姚敏杰基于磁性微粒和熒光微球的DNA檢測方法研究(西北大學(xué)碩士學(xué)位答辯)20076課件

基于磁性微粒和熒光微球的DNA檢測方法研究答辯人：姚敏杰專業(yè)：分子微生物學(xué)導(dǎo)師：陳超教授崔亞麗教授西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2007-05西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯基于磁性微粒和熒光微球的DNA答辯人：姚敏杰西北大學(xué)生命科學(xué)1目錄綜述研究報(bào)告

實(shí)驗(yàn)一基于磁性微粒的DNA雜交檢測實(shí)驗(yàn)二熒光微球用于人乳頭瘤病毒的基因分型研究

全文總結(jié)目前現(xiàn)有的固相核酸雜交檢測方法雜交基本原理本研究的意義2西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯目錄綜述目前現(xiàn)有的固相核酸雜交檢測方法2西北大學(xué)碩士學(xué)位論文1.目前現(xiàn)有的固相核酸雜交檢測方法綜述特異性、敏感性、樣品制備和標(biāo)記繁瑣、儀器的研制和機(jī)械化程度不高大規(guī)模、高通量快速、自動化程度高DNA芯片技術(shù)敏感性較低特異性好bDNA技術(shù)工作量大，實(shí)際應(yīng)用受到限制假陽性率較低差異雜交靈敏度低，操作繁瑣復(fù)雜特異性強(qiáng)印跡雜交不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。操作簡單，事先無需對核酸樣品進(jìn)行特殊處理，一張膜可同時(shí)檢測多個(gè)樣品斑點(diǎn)雜交/狹線雜交組織原位雜交操作繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力特異性高，可精確定位菌落原位雜交原位雜交缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)方法種類3西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯1.目前現(xiàn)有的固相核酸雜交檢測方法綜述特異性、敏感性、樣品制磁性微粒技術(shù)磁性微粒的研究始于上世紀(jì)70年代，它除具有納米顆粒的特征外，還可以通過表面的功能基團(tuán)進(jìn)行修飾，共價(jià)偶聯(lián)蛋白、核酸等有機(jī)/生物分子，并且具有順磁性，可在外加磁場的作用下快速移動和分離而廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢測、靶向載藥、細(xì)胞分選、酶的固定化以及分子生物學(xué)（DNA和RNA的測序與純化）等領(lǐng)域中。技術(shù)優(yōu)勢靈敏度高、特異性強(qiáng)實(shí)用性、操作性強(qiáng)儀器設(shè)備簡單、省時(shí)省力4西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯磁性微粒技術(shù)磁性微粒的研究始于上世紀(jì)70年代熒光微球技術(shù)液態(tài)懸浮芯片技術(shù)是指一項(xiàng)將核苷酸、抗原、抗體、受體、肽鏈及酶底物等生物大分子結(jié)合在熒光微球表面，根據(jù)生物測定的原理，與待測樣品中的相應(yīng)物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，然后借助流式細(xì)胞儀對檢測結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)定量化分析的技術(shù)。技術(shù)優(yōu)勢高通量、快速分析高特異性、高精確性、高靈敏度省時(shí)、省力、經(jīng)濟(jì)液態(tài)懸浮基因芯片儀器照片5西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯熒光微球技術(shù)液態(tài)懸浮芯片技術(shù)是指一項(xiàng)將核苷酸2.雜交基本原理固相直接雜交檢測原理示意圖RNADNA后續(xù)檢測后續(xù)檢測標(biāo)記檢測探針固相基質(zhì)固相基質(zhì)標(biāo)記物6西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯2.雜交基本原理固相直接雜交檢測原理示意圖RNADNA后續(xù)檢單堿基鏈延伸反應(yīng)檢測SNP基因型的示意圖5’3’+5’3’后續(xù)檢測分別代表不同的堿基標(biāo)記物圖解單堿基鏈延伸反應(yīng)的原理引物7單堿基鏈延伸反應(yīng)檢測SNP基因型的示意圖5’3’+5’3’本研究的意義有助于建立經(jīng)濟(jì)、快速的DNA固相檢測方法有助于高通量、高靈敏度、高特異性和自動化的DNA檢測方法的建立有助于對遺傳疾病、腫瘤、傳染病等的迅速診斷，有助于司法部門對罪犯的鑒別、性別鑒別、器官或組織移植的配型等領(lǐng)域的研究與應(yīng)用8西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯本研究的意義有助于建立經(jīng)濟(jì)、快速的DNA固相檢測方法8西北大實(shí)驗(yàn)一基于磁性微粒的DNA雜交檢測實(shí)驗(yàn)原理探針與磁性微粒的偶聯(lián)靶片段的擴(kuò)增單堿基鏈延伸熒光信號的引入以及結(jié)果的讀取實(shí)驗(yàn)小結(jié)研究報(bào)告9西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)原理研究報(bào)告9西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯檢測原理示意圖實(shí)驗(yàn)原理A：jingwenChen等檢測SNP原理示意圖[1]B：本研究設(shè)計(jì)原理示意圖[1]jingwenChen,MarieA.lannoneetal.AMicrosphere-BasedAssayforMultiplexedSingleNucleotidePolymorphismAnalysisUsingSingleBaseChainExtension[J].GenomeResearch.2000,10:549-55710檢測原理示意圖實(shí)驗(yàn)原理A：jingwenChen等檢測S探針與磁性微粒的偶聯(lián)探針在不同磁性微粒表面的偶聯(lián)示意圖苯異二硫氰酸酯

丙基三甲氧基硅烷ABCA：羧基末端磁性微粒B：氨基末端磁性微粒C：環(huán)氧乙烷磁性微粒11探針與磁性微粒的偶聯(lián)探針在不同磁性微粒表面的偶聯(lián)示意圖苯異二磁性微粒的優(yōu)選磁性微粒的種類羧基末端磁性微粒、氨基末端磁性微粒、環(huán)氧乙烷磁性微粒、Dynal磁性微粒優(yōu)選內(nèi)容探針在磁性微粒表面最大偶聯(lián)量探針在磁性微粒表面的偶聯(lián)效率經(jīng)過熱處理后探針在磁性微粒表面的損失量探針在磁性微粒表面偶聯(lián)所用時(shí)間選用材料的價(jià)格96℃5min5min+5個(gè)循環(huán)5min+10個(gè)循環(huán)5min+20個(gè)循環(huán)5min+30個(gè)循環(huán)

12西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯磁性微粒的優(yōu)選磁性微粒的種類羧基末端磁性微粒、氨基末端磁性微磁性微粒優(yōu)選結(jié)果1.最大偶聯(lián)量和偶聯(lián)效率1.5mg磁性微粒加入量(mg)97.60±0.0197.20±0.0184.60±0.0266.00±0.010.650±0.010.650±0.010.790±0.010.440±0.011nmol羧基末端磁性微粒Dynal磁性微粒環(huán)氧乙烷磁性微粒氨基末端磁性微粒探針與磁性微粒的偶聯(lián)效率(%)每毫克磁性微粒表面的探針偶聯(lián)量(nmol)探針加入量(nmol)磁性微粒種類2.經(jīng)過熱處理后探針在磁性微粒表面的損失量2.89%4.26%15.70%64.00%2.10%3.78%19.90%55.80%1.42%3.50%23.30%53.70%1.36%2.77%31.30%47.10%0.59%1.61%28.10%24.90%羧基Dynal環(huán)氧乙烷氨基5min+30個(gè)循環(huán)5min+20個(gè)循環(huán)5min+10個(gè)循環(huán)5min+5個(gè)循環(huán)96℃5min磁性微粒種類熱處理反應(yīng)時(shí)間13磁性微粒優(yōu)選結(jié)果1.最大偶聯(lián)量和偶聯(lián)效率1.5mg磁性微粒3.其它因素對磁性微粒優(yōu)選的影響磁性微粒種類價(jià)格（￥/mg/ml）偶聯(lián)所需時(shí)間（h）輔助儀器設(shè)備羧基末端磁性微粒Dynal磁性微粒氨基末端磁性微粒環(huán)氧乙烷磁性微粒9.648.43.610.41.51.53.53.5磁性分離器（磁架）磁性分離器可控溫?fù)u床可控溫?fù)u床最終選取羧基末端磁性微粒進(jìn)行后續(xù)研究14西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯3.其它因素對磁性微粒優(yōu)選的影響磁性微粒種類價(jià)格（￥/mg/靶片段的擴(kuò)增不對稱PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件試劑加入量終濃度上游引物0.625μL待定下游引物0.625μL待定dNTP2μL0.16nmol/L反應(yīng)緩沖液（10×Buffer）2.5μL10mmol/LMgCl22.5μL2.5mmol/LDNA聚合酶0.5μL2.5U無核酶水（ddH2O）14.25μL模板量2μL72℃

10min

95℃5min94℃30s55℃30s72℃30cycles4℃hold30s15西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯靶片段的擴(kuò)增不對稱PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件試劑加入量終濃不對稱PCR擴(kuò)增上下游引物濃度的摸索500bp250bpssDNAdsDNAM：MakerDL-2000，Y：上下游引物濃度為1:1時(shí)擴(kuò)增結(jié)果，――：PCR空白對照50:1：上下游引物濃度為50:1的擴(kuò)增結(jié)果，75:1：上下游引物濃度為75:1的擴(kuò)增結(jié)果，100:1：上下游引物濃度為100:1的擴(kuò)增結(jié)果不對稱PCR上下游引物優(yōu)化結(jié)果16不對稱PCR擴(kuò)增上下游引物濃度的摸索500bp250bpss不對稱擴(kuò)增PCR產(chǎn)物與固定有探針的磁性微粒的雜交反應(yīng)及單堿基鏈延伸反應(yīng)補(bǔ)至20μL已雜交的產(chǎn)物各1μL10μmol/LddTTP、ddCTP、ddGTP1μL10μmol/LBiotin-ddATP0.5μLrTaq聚合酶0.8μL25mmol/LMgCl20.8μL1mol/LTris-HCl（pH9.0）加入量反應(yīng)試劑磁性微粒表面的單堿基鏈延伸反應(yīng)體系補(bǔ)至50μL無核酶水（ddH2O）16μL4.5mol/LTMAC20μL不對稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12μL偶聯(lián)有探針的磁性微粒復(fù)合物加入量反應(yīng)試劑雜交反應(yīng)體系17西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯不對稱擴(kuò)增PCR產(chǎn)物與固定有探針的磁性微粒的雜交反應(yīng)及單堿基熒光信號的引入和結(jié)果的讀取洗滌條件的優(yōu)化分別用1×PBST洗滌4次、2次、1次選取最佳結(jié)果洗滌條件的優(yōu)化結(jié)果ATGC重復(fù)2次對照對照重復(fù)2次洗4次結(jié)果洗2次結(jié)果ATGC重復(fù)2次對照洗1次結(jié)果A:biotin-ddATPT:biotin-ddTTPG:biotin-ddGTPC:biotin-ddCTPATGC18熒光信號的引入和結(jié)果的讀取洗滌條件的優(yōu)化洗滌條件的優(yōu)化結(jié)果A氨基標(biāo)記探針溶液在羧基末端磁性微粒表面偶聯(lián)前后的紫外吸收曲線波長/nm吸光度值偶聯(lián)結(jié)果500bp250bpssDNAdsDNAM－DL2000Y－對稱擴(kuò)增結(jié)果（陽性對照）50:1－不對稱擴(kuò)增結(jié)果－－空白對照（上樣量均為：5μLPCR產(chǎn)物+1μL10×loadingbuffer）E.Coli不對稱PCR擴(kuò)增結(jié)果不對稱PCR擴(kuò)增結(jié)果19西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯氨基標(biāo)記探針溶液在羧基末端磁性波長/nm吸光度值偶聯(lián)結(jié)果50最終檢測結(jié)果71246對照組157591121488891實(shí)驗(yàn)組CGTA核酸位點(diǎn)熒光值熒光檢測值21.030.901.171.38陽性值/陰性值7.25陰性平均背景值152.56.58.510陽性檢測值CGTA核酸位點(diǎn)熒光檢測值結(jié)果分析20西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯最終檢測結(jié)果71246對照組157591121488891實(shí)實(shí)驗(yàn)小結(jié)基于單堿基鏈延伸反應(yīng)原理初步建立了DNA雜交檢測的方法。在檢測大腸桿菌待測核酸DNA時(shí)，獲取陽性信號是對照組的21倍。證明該方法用于DNA雜交檢測的可行性、特異性和準(zhǔn)確性。對4種不同的磁性微粒進(jìn)行篩選，初選出與探針偶聯(lián)效率高、偶聯(lián)量高而穩(wěn)定、磁性微?？山?jīng)過長時(shí)間高溫處理且表面修飾的功能基團(tuán)損失較少的磁性微粒。3.利用不對稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一定量單鏈PCR產(chǎn)物，免除了用NaOH處理PCR產(chǎn)物以便雙鏈DNA變?yōu)閱捂湹牟襟E，簡化了雜交反應(yīng)操作和縮短了時(shí)間，增大了雜交檢測法的實(shí)用性。21西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯實(shí)驗(yàn)小結(jié)基于單堿基鏈延伸反應(yīng)原理初步建立了DNA雜交檢測的方實(shí)驗(yàn)二熒光微球用于人乳頭瘤病毒的基因分型研究人乳頭瘤病毒簡介實(shí)驗(yàn)原理探針與熒光微球的偶聯(lián)靶片段的擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物與偶聯(lián)有探針的熒光微球進(jìn)行雜交基因分型方法的建立實(shí)驗(yàn)小結(jié)22西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯實(shí)驗(yàn)二人乳頭瘤病毒簡介22西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯人乳頭瘤病毒簡介人乳頭瘤病毒是乳多空病毒科乳頭瘤病毒屬的一個(gè)雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其顆粒呈球形，呈二十面體對稱，直徑約45～55nm，分子長度約為7.8～8kb。HPV感染的潛伏期長，不易在體外培養(yǎng)。因此，目前對HPV感染的分型診斷，主要依賴分子生物學(xué)手段對病毒DNA檢測?，F(xiàn)有的檢測方法對操作人員技術(shù)水平要求高，試劑昂貴；所需臨床標(biāo)本量大，甚至還需對臨床標(biāo)本多次擴(kuò)增及多次分離分析，整個(gè)過程頗為復(fù)雜。因此，對HPV進(jìn)行早期、快速檢測和型別鑒定具有重要的臨床意義。主要感染上皮組織，顯示高度的宿主特異性，對人體特異部位的上皮細(xì)胞具親和力。通過人體間密切接觸傳播，可引起尋常疣，尖銳濕疣，宮頸癌等疾病。迄今已發(fā)現(xiàn)有120余型HPV。23西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯人乳頭瘤病毒簡介人乳頭瘤病毒是乳多空病毒科乳頭分型依據(jù)及實(shí)驗(yàn)原理檢測原理示意圖HPV的分型主要根據(jù)其基因組的同源性不同進(jìn)行分型，作為新的一型HPV，其基因組可被完全克隆，L1、E6及E7開放閱讀框與其它型基因組比較，具有低于90%的同源性。分型依據(jù)24分型依據(jù)及實(shí)驗(yàn)原理檢測原理示意圖HPV的分型探針

研究發(fā)現(xiàn)，在外陰、宮頸部位，感染HPV最常見的低危類型有HPV6，HPV11和HPV53；高危類型有HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV56，HPV58等，這些類型占外生殖器部位感染類型的96%左右。

選擇的探針參考M.V.JACOBS[2]設(shè)計(jì)。通過使用美國NCBI數(shù)據(jù)庫做BLAST比對研究，結(jié)果每一型探針與其它型HPV間未出現(xiàn)型間交叉相互干擾的現(xiàn)象。

[2]Dunbar,S.A.andJ.W.Jacobson.ApplicationoftheLuminexLabMAPinrapidscreeningformutationsinthecysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorgene:Apilotstudy.ClinicalChemistry[J].2000,46:1498-1500.探針與熒光微球的偶聯(lián)探針[2]Dunbar,S.A.andJ.W.J25HPV類型微球編碼探針序列（5’to3’）[3]HPV18HPV31HPV35106155166TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCATGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATACGTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA所有探針5’端均采用NH2-C14修飾，以便與熒光微球偶聯(lián)。探針由三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。[3]M.V.JACOBS,A.M.DERODAHUSMAN,A.J.C.VANDENBRULE,P.J.F,etal.Group-SpecificDifferentiationbetweenHigh-andLow-RiskHumanPapillomavirusGenotypesbyGeneralPrimer-MediatedPCRandTwoCocktailsofOligonucleotideProbes[J].CLIN.MICROBIOL.1995,33(4):901-90526西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯所有探針5’端均采用NH2-C14修飾，以便與熒光微球偶聯(lián)。靶片段的擴(kuò)增5μL模板量29.5μL無核酶水（ddH2O）1.25U0.5μLDNA聚合酶1.5mmol/L4μLMgCl210mmol/L5μL反應(yīng)緩沖液（10×Buffer）0.2nmol/L2μLdNTP0.4nmol/L2μL下游引物GP6+0.4nmol/L2μL上游引物GP5+終濃度加入量試劑72℃

5min

95℃5min94℃30s55℃30s72℃40cycles4℃hold45s27西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯靶片段的擴(kuò)增5μL模板量29.5μL無核酶水1.25U擴(kuò)增結(jié)果HPV質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果100bp250bpM：DL2000；1：PCR空白對照；2：HPV18；3：HPV31；4：HPV35（上樣量均為：5μLPCR產(chǎn)物+1μL10×loadingbuffer）28西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯擴(kuò)增結(jié)果HPV質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果100bp250bpM：72.925.418.05陽性值/陰性值51.282.0114.5陰性平均背景值3730.02084.0922.0陽性檢測值35型31型18型質(zhì)粒名稱檢測單純一型HPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒結(jié)果分析表3730.077.068.0HPV35型96.068.02084.0HPV31型105.0922.0124.0HPV18型35型18型31型166106155微球+探針熒光值質(zhì)粒檢測單純一型HPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的數(shù)據(jù)檢測結(jié)果2972.925.418.05陽性值/陰性值51.282.011實(shí)驗(yàn)小結(jié)以液態(tài)懸浮基因芯片為技術(shù)平臺，初步建立HPVDNA雜交檢測分型的方法。本方法選取的3種型特異性探針以共價(jià)鍵分別偶聯(lián)至3種不同的熒光微球，表面探針密度高，產(chǎn)生信號強(qiáng)，同時(shí)熒光檢測使信號進(jìn)一步得到放大，所以敏感性大大提高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雜交值/未雜交值最高可達(dá)近百倍，最低也有8倍以上。3種熒光微球探針對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品PCR產(chǎn)物具有特異性的雜交反應(yīng)，彼此間并不相互干擾，對于產(chǎn)物中單一型HPV存在的情況下，根據(jù)所對應(yīng)熒光信號對待測DNA進(jìn)行確定，可100％的分析出HPV型別。

3.雜交過程在懸浮的液相中進(jìn)行，雜交后不用清洗就可以直接讀數(shù)，檢測效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于固相雜交，所用時(shí)間從幾小時(shí)縮短到30分鐘，快速、可靠、操作簡便。并且臨床檢測中使用通用引物，僅需一次PCR擴(kuò)增即可檢測3種最常見的高危型HPV，既提高了檢測的通量，也大大降低了臨床標(biāo)本的用量。30西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯實(shí)驗(yàn)小結(jié)以液態(tài)懸浮基因芯片為技術(shù)平臺，初步建立HPVDNA全文總結(jié)1.本文利用液態(tài)懸浮的羧基末端磁性微粒和液態(tài)熒光微球?yàn)檩d體，構(gòu)建了雜交檢測DNA的新方法，具有操作簡便、省時(shí)省力、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、結(jié)果判別準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

2.以羧基末端磁性微粒構(gòu)建的DNA檢測方法，每毫克磁性微粒表面最大可偶聯(lián)針0.65nmol，偶聯(lián)效率可達(dá)97.60％，根據(jù)單堿基鏈延伸原理的檢測點(diǎn)是空白點(diǎn)熒光強(qiáng)度的21倍，證明該反應(yīng)體系的正確性與可靠性。在外加磁場的作用下很容易與未雜交的核酸或探針分離，大大簡化了操作步驟，為進(jìn)一步檢測節(jié)約時(shí)間。3.以熒光微球?yàn)榧夹g(shù)平臺建立的方法，所選取的3種型特異性探針以共價(jià)鍵分別偶聯(lián)至3種不同的熒光微球，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雜交值/未雜交值最高可達(dá)近百倍，最低也有8倍以上。雜交過程在懸浮的液相中進(jìn)行，雜交后不用清洗就可以直接讀數(shù)，檢測效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于固相雜交，所用時(shí)間縮短至30分鐘，快速、可靠、操作簡便。31西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯全文總結(jié)1.本文利用液態(tài)懸浮的羧基末端磁性微粒和液態(tài)熒光微球致謝感謝我的導(dǎo)師陳超教授在我碩士學(xué)習(xí)期間給我創(chuàng)造了難得的實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺和良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境以及對我的生活的關(guān)心，在此我謹(jǐn)向陳老師表示最衷心的感謝和深深的敬意！感謝崔亞麗教授在實(shí)驗(yàn)以及論文的完成方面給予的悉心指導(dǎo)和無私的幫助！感謝國家微檢測系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心的董兆麟教授、但寧博士、李錚教授、朱娟莉老師、彭明麗博士在實(shí)驗(yàn)過程中的耐心指導(dǎo)和幫助！感謝實(shí)驗(yàn)室全體工作人員和同學(xué)在實(shí)驗(yàn)中對于的技術(shù)幫助、合作、理解和支持！感謝在我三年的學(xué)習(xí)生活中任何給予我關(guān)心和幫助的人！致謝感謝我的導(dǎo)師陳超教授在我碩士學(xué)習(xí)期間給我創(chuàng)造了難32基于磁性微粒和熒光微球的DNA檢測方法研究答辯人：姚敏杰專業(yè)：分子微生物學(xué)導(dǎo)師：陳超教授崔亞麗教授西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2007-05西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯基于磁性微粒和熒光微球的DNA答辯人：姚敏杰西北大學(xué)生命科學(xué)33目錄綜述研究報(bào)告

實(shí)驗(yàn)一基于磁性微粒的DNA雜交檢測實(shí)驗(yàn)二熒光微球用于人乳頭瘤病毒的基因分型研究

全文總結(jié)目前現(xiàn)有的固相核酸雜交檢測方法雜交基本原理本研究的意義34西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯目錄綜述目前現(xiàn)有的固相核酸雜交檢測方法2西北大學(xué)碩士學(xué)位論文1.目前現(xiàn)有的固相核酸雜交檢測方法綜述特異性、敏感性、樣品制備和標(biāo)記繁瑣、儀器的研制和機(jī)械化程度不高大規(guī)模、高通量快速、自動化程度高DNA芯片技術(shù)敏感性較低特異性好bDNA技術(shù)工作量大，實(shí)際應(yīng)用受到限制假陽性率較低差異雜交靈敏度低，操作繁瑣復(fù)雜特異性強(qiáng)印跡雜交不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。操作簡單，事先無需對核酸樣品進(jìn)行特殊處理，一張膜可同時(shí)檢測多個(gè)樣品斑點(diǎn)雜交/狹線雜交組織原位雜交操作繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力特異性高，可精確定位菌落原位雜交原位雜交缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)方法種類35西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯1.目前現(xiàn)有的固相核酸雜交檢測方法綜述特異性、敏感性、樣品制磁性微粒技術(shù)磁性微粒的研究始于上世紀(jì)70年代，它除具有納米顆粒的特征外，還可以通過表面的功能基團(tuán)進(jìn)行修飾，共價(jià)偶聯(lián)蛋白、核酸等有機(jī)/生物分子，并且具有順磁性，可在外加磁場的作用下快速移動和分離而廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢測、靶向載藥、細(xì)胞分選、酶的固定化以及分子生物學(xué)（DNA和RNA的測序與純化）等領(lǐng)域中。技術(shù)優(yōu)勢靈敏度高、特異性強(qiáng)實(shí)用性、操作性強(qiáng)儀器設(shè)備簡單、省時(shí)省力36西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯磁性微粒技術(shù)磁性微粒的研究始于上世紀(jì)70年代熒光微球技術(shù)液態(tài)懸浮芯片技術(shù)是指一項(xiàng)將核苷酸、抗原、抗體、受體、肽鏈及酶底物等生物大分子結(jié)合在熒光微球表面，根據(jù)生物測定的原理，與待測樣品中的相應(yīng)物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，然后借助流式細(xì)胞儀對檢測結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)定量化分析的技術(shù)。技術(shù)優(yōu)勢高通量、快速分析高特異性、高精確性、高靈敏度省時(shí)、省力、經(jīng)濟(jì)液態(tài)懸浮基因芯片儀器照片37西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯熒光微球技術(shù)液態(tài)懸浮芯片技術(shù)是指一項(xiàng)將核苷酸2.雜交基本原理固相直接雜交檢測原理示意圖RNADNA后續(xù)檢測后續(xù)檢測標(biāo)記檢測探針固相基質(zhì)固相基質(zhì)標(biāo)記物38西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯2.雜交基本原理固相直接雜交檢測原理示意圖RNADNA后續(xù)檢單堿基鏈延伸反應(yīng)檢測SNP基因型的示意圖5’3’+5’3’后續(xù)檢測分別代表不同的堿基標(biāo)記物圖解單堿基鏈延伸反應(yīng)的原理引物39單堿基鏈延伸反應(yīng)檢測SNP基因型的示意圖5’3’+5’3’本研究的意義有助于建立經(jīng)濟(jì)、快速的DNA固相檢測方法有助于高通量、高靈敏度、高特異性和自動化的DNA檢測方法的建立有助于對遺傳疾病、腫瘤、傳染病等的迅速診斷，有助于司法部門對罪犯的鑒別、性別鑒別、器官或組織移植的配型等領(lǐng)域的研究與應(yīng)用40西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯本研究的意義有助于建立經(jīng)濟(jì)、快速的DNA固相檢測方法8西北大實(shí)驗(yàn)一基于磁性微粒的DNA雜交檢測實(shí)驗(yàn)原理探針與磁性微粒的偶聯(lián)靶片段的擴(kuò)增單堿基鏈延伸熒光信號的引入以及結(jié)果的讀取實(shí)驗(yàn)小結(jié)研究報(bào)告41西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)原理研究報(bào)告9西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯檢測原理示意圖實(shí)驗(yàn)原理A：jingwenChen等檢測SNP原理示意圖[1]B：本研究設(shè)計(jì)原理示意圖[1]jingwenChen,MarieA.lannoneetal.AMicrosphere-BasedAssayforMultiplexedSingleNucleotidePolymorphismAnalysisUsingSingleBaseChainExtension[J].GenomeResearch.2000,10:549-55742檢測原理示意圖實(shí)驗(yàn)原理A：jingwenChen等檢測S探針與磁性微粒的偶聯(lián)探針在不同磁性微粒表面的偶聯(lián)示意圖苯異二硫氰酸酯

丙基三甲氧基硅烷ABCA：羧基末端磁性微粒B：氨基末端磁性微粒C：環(huán)氧乙烷磁性微粒43探針與磁性微粒的偶聯(lián)探針在不同磁性微粒表面的偶聯(lián)示意圖苯異二磁性微粒的優(yōu)選磁性微粒的種類羧基末端磁性微粒、氨基末端磁性微粒、環(huán)氧乙烷磁性微粒、Dynal磁性微粒優(yōu)選內(nèi)容探針在磁性微粒表面最大偶聯(lián)量探針在磁性微粒表面的偶聯(lián)效率經(jīng)過熱處理后探針在磁性微粒表面的損失量探針在磁性微粒表面偶聯(lián)所用時(shí)間選用材料的價(jià)格96℃5min5min+5個(gè)循環(huán)5min+10個(gè)循環(huán)5min+20個(gè)循環(huán)5min+30個(gè)循環(huán)

44西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯磁性微粒的優(yōu)選磁性微粒的種類羧基末端磁性微粒、氨基末端磁性微磁性微粒優(yōu)選結(jié)果1.最大偶聯(lián)量和偶聯(lián)效率1.5mg磁性微粒加入量(mg)97.60±0.0197.20±0.0184.60±0.0266.00±0.010.650±0.010.650±0.010.790±0.010.440±0.011nmol羧基末端磁性微粒Dynal磁性微粒環(huán)氧乙烷磁性微粒氨基末端磁性微粒探針與磁性微粒的偶聯(lián)效率(%)每毫克磁性微粒表面的探針偶聯(lián)量(nmol)探針加入量(nmol)磁性微粒種類2.經(jīng)過熱處理后探針在磁性微粒表面的損失量2.89%4.26%15.70%64.00%2.10%3.78%19.90%55.80%1.42%3.50%23.30%53.70%1.36%2.77%31.30%47.10%0.59%1.61%28.10%24.90%羧基Dynal環(huán)氧乙烷氨基5min+30個(gè)循環(huán)5min+20個(gè)循環(huán)5min+10個(gè)循環(huán)5min+5個(gè)循環(huán)96℃5min磁性微粒種類熱處理反應(yīng)時(shí)間45磁性微粒優(yōu)選結(jié)果1.最大偶聯(lián)量和偶聯(lián)效率1.5mg磁性微粒3.其它因素對磁性微粒優(yōu)選的影響磁性微粒種類價(jià)格（￥/mg/ml）偶聯(lián)所需時(shí)間（h）輔助儀器設(shè)備羧基末端磁性微粒Dynal磁性微粒氨基末端磁性微粒環(huán)氧乙烷磁性微粒9.648.43.610.41.51.53.53.5磁性分離器（磁架）磁性分離器可控溫?fù)u床可控溫?fù)u床最終選取羧基末端磁性微粒進(jìn)行后續(xù)研究46西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯3.其它因素對磁性微粒優(yōu)選的影響磁性微粒種類價(jià)格（￥/mg/靶片段的擴(kuò)增不對稱PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件試劑加入量終濃度上游引物0.625μL待定下游引物0.625μL待定dNTP2μL0.16nmol/L反應(yīng)緩沖液（10×Buffer）2.5μL10mmol/LMgCl22.5μL2.5mmol/LDNA聚合酶0.5μL2.5U無核酶水（ddH2O）14.25μL模板量2μL72℃

10min

95℃5min94℃30s55℃30s72℃30cycles4℃hold30s47西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯靶片段的擴(kuò)增不對稱PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件試劑加入量終濃不對稱PCR擴(kuò)增上下游引物濃度的摸索500bp250bpssDNAdsDNAM：MakerDL-2000，Y：上下游引物濃度為1:1時(shí)擴(kuò)增結(jié)果，――：PCR空白對照50:1：上下游引物濃度為50:1的擴(kuò)增結(jié)果，75:1：上下游引物濃度為75:1的擴(kuò)增結(jié)果，100:1：上下游引物濃度為100:1的擴(kuò)增結(jié)果不對稱PCR上下游引物優(yōu)化結(jié)果48不對稱PCR擴(kuò)增上下游引物濃度的摸索500bp250bpss不對稱擴(kuò)增PCR產(chǎn)物與固定有探針的磁性微粒的雜交反應(yīng)及單堿基鏈延伸反應(yīng)補(bǔ)至20μL已雜交的產(chǎn)物各1μL10μmol/LddTTP、ddCTP、ddGTP1μL10μmol/LBiotin-ddATP0.5μLrTaq聚合酶0.8μL25mmol/LMgCl20.8μL1mol/LTris-HCl（pH9.0）加入量反應(yīng)試劑磁性微粒表面的單堿基鏈延伸反應(yīng)體系補(bǔ)至50μL無核酶水（ddH2O）16μL4.5mol/LTMAC20μL不對稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12μL偶聯(lián)有探針的磁性微粒復(fù)合物加入量反應(yīng)試劑雜交反應(yīng)體系49西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯不對稱擴(kuò)增PCR產(chǎn)物與固定有探針的磁性微粒的雜交反應(yīng)及單堿基熒光信號的引入和結(jié)果的讀取洗滌條件的優(yōu)化分別用1×PBST洗滌4次、2次、1次選取最佳結(jié)果洗滌條件的優(yōu)化結(jié)果ATGC重復(fù)2次對照對照重復(fù)2次洗4次結(jié)果洗2次結(jié)果ATGC重復(fù)2次對照洗1次結(jié)果A:biotin-ddATPT:biotin-ddTTPG:biotin-ddGTPC:biotin-ddCTPATGC50熒光信號的引入和結(jié)果的讀取洗滌條件的優(yōu)化洗滌條件的優(yōu)化結(jié)果A氨基標(biāo)記探針溶液在羧基末端磁性微粒表面偶聯(lián)前后的紫外吸收曲線波長/nm吸光度值偶聯(lián)結(jié)果500bp250bpssDNAdsDNAM－DL2000Y－對稱擴(kuò)增結(jié)果（陽性對照）50:1－不對稱擴(kuò)增結(jié)果－－空白對照（上樣量均為：5μLPCR產(chǎn)物+1μL10×loadingbuffer）E.Coli不對稱PCR擴(kuò)增結(jié)果不對稱PCR擴(kuò)增結(jié)果51西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯氨基標(biāo)記探針溶液在羧基末端磁性波長/nm吸光度值偶聯(lián)結(jié)果50最終檢測結(jié)果71246對照組157591121488891實(shí)驗(yàn)組CGTA核酸位點(diǎn)熒光值熒光檢測值21.030.901.171.38陽性值/陰性值7.25陰性平均背景值152.56.58.510陽性檢測值CGTA核酸位點(diǎn)熒光檢測值結(jié)果分析52西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯最終檢測結(jié)果71246對照組157591121488891實(shí)實(shí)驗(yàn)小結(jié)基于單堿基鏈延伸反應(yīng)原理初步建立了DNA雜交檢測的方法。在檢測大腸桿菌待測核酸DNA時(shí)，獲取陽性信號是對照組的21倍。證明該方法用于DNA雜交檢測的可行性、特異性和準(zhǔn)確性。對4種不同的磁性微粒進(jìn)行篩選，初選出與探針偶聯(lián)效率高、偶聯(lián)量高而穩(wěn)定、磁性微粒可經(jīng)過長時(shí)間高溫處理且表面修飾的功能基團(tuán)損失較少的磁性微粒。3.利用不對稱PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一定量單鏈PCR產(chǎn)物，免除了用NaOH處理PCR產(chǎn)物以便雙鏈DNA變?yōu)閱捂湹牟襟E，簡化了雜交反應(yīng)操作和縮短了時(shí)間，增大了雜交檢測法的實(shí)用性。53西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯實(shí)驗(yàn)小結(jié)基于單堿基鏈延伸反應(yīng)原理初步建立了DNA雜交檢測的方實(shí)驗(yàn)二熒光微球用于人乳頭瘤病毒的基因分型研究人乳頭瘤病毒簡介實(shí)驗(yàn)原理探針與熒光微球的偶聯(lián)靶片段的擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物與偶聯(lián)有探針的熒光微球進(jìn)行雜交基因分型方法的建立實(shí)驗(yàn)小結(jié)54西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯實(shí)驗(yàn)二人乳頭瘤病毒簡介22西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯人乳頭瘤病毒簡介人乳頭瘤病毒是乳多空病毒科乳頭瘤病毒屬的一個(gè)雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其顆粒呈球形，呈二十面體對稱，直徑約45～55nm，分子長度約為7.8～8kb。HPV感染的潛伏期長，不易在體外培養(yǎng)。因此，目前對HPV感染的分型診斷，主要依賴分子生物學(xué)手段對病毒DNA檢測?，F(xiàn)有的檢測方法對操作人員技術(shù)水平要求高，試劑昂貴；所需臨床標(biāo)本量大，甚至還需對臨床標(biāo)本多次擴(kuò)增及多次分離分析，整個(gè)過程頗為復(fù)雜。因此，對HPV進(jìn)行早期、快速檢測和型別鑒定具有重要的臨床意義。主要感染上皮組織，顯示高度的宿主特異性，對人體特異部位的上皮細(xì)胞具親和力。通過人體間密切接觸傳播，可引起尋常疣，尖銳濕疣，宮頸癌等疾病。迄今已發(fā)現(xiàn)有120余型HPV。55西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯人乳頭瘤病毒簡介人乳頭瘤病毒是乳多空病毒科乳頭分型依據(jù)及實(shí)驗(yàn)原理檢測原理示意圖HPV的分型主要根據(jù)其基因組的同源性不同進(jìn)行分型，作為新的一型HPV，其基因組可被完全克隆，L1、E6及E7開放閱讀框與其它型基因組比較，具有低于90%的同源性。分型依據(jù)56分型依據(jù)及實(shí)驗(yàn)原理檢測原理示意圖HPV的分型探針

研究發(fā)現(xiàn)，在外陰、宮頸部位，感染HPV最常見的低危類型有HPV6，HPV11和HPV53；高危類型有HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV56，HPV58等，這些類型占外生殖器部位感染類型的96%左右。

選擇的探針參考M.V.JACOBS[2]設(shè)計(jì)。通過使用美國NCBI數(shù)據(jù)庫做BLAST比對研究，結(jié)果每一型探針與其它型HPV間未出現(xiàn)型間交叉相互干擾的現(xiàn)象。

[2]Dunbar,S.A.andJ.W.Jacobson.ApplicationoftheLuminexLabMAPinrapidscreeningformutationsinthecysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorgene:Apilotstudy.ClinicalChemistry[J].2000,46:1498-1500.探針與熒光微球的偶聯(lián)探針[2]Dunbar,S.A.andJ.W.J57HPV類型微球編碼探針序列（5’to3’）[3]HPV18HPV31HPV35106155166TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCATGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATACGTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA所有探針5’端均采用NH2-C14修飾，以便與熒光微球偶聯(lián)。探針由三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。[3]M.V.JACOBS,A.M.DERODAHUSMAN,A.J.C.VANDENBRULE,P.J.F,etal.Group-SpecificDifferentiationbetweenHigh-andLow-RiskHumanPapillomavirusGenotypesbyGeneralPrimer-MediatedPCRandTwoCocktailsofOligonucleotideProbes[J].CLIN.MICROBIOL.1995,33(4):901-90558西北大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯所有探針5’端均采用NH2-C14修飾，以便與熒光微球偶聯(lián)。靶片段的擴(kuò)增5μL模板量29.5μL無核酶水（ddH2O）1.25U0.5μLDNA聚合酶1.5mmol/L4μLMgCl210mmol/L5μL反應(yīng)緩沖液（10×Buffer）0.2nmol/L2μLdNTP0.4nmol/L2μL下游引物GP6+0.4nmol/L2μL上游引物GP5+終濃度加入量試劑72℃

5min

95℃5min94℃