沙門氏菌的檢驗

沙門氏菌的檢驗食品學(xué)院14食品質(zhì)量與安全1班劉文敏柳基煒衛(wèi)杰恒 溫紫君201430520115201430520116201430520121201430520122摘要：本實驗采用GB/T4789.4-2010的檢測方法測定雞場中的沙門氏菌。通過本實驗學(xué)習(xí)沙門氏菌的檢測方法和技術(shù)，了解沙門氏菌的一些生化特性；本實驗先用顯色培養(yǎng)基找出可疑菌落，再做生化試驗找出可疑的典型性的沙門氏菌，再通過血清學(xué)試驗最終確定是否為沙門氏菌屬。關(guān)鍵詞：沙門氏菌接種生化試驗血清學(xué)鑒定前言沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)中具有重要意義的人畜共患病種之一，其病原沙門氏菌屬于腸道細菌科。沙門氏菌是一個統(tǒng)稱，泛指2000多種有緊密連系的細菌，包括引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細菌。雖然只有少數(shù)人因沙門氏菌而患病，但是，在世界范圍內(nèi)的細菌性食物中毒事件中，由沙門氏菌引起的占大多數(shù)。因此，采用科學(xué)、合理的方法檢驗食品中沙門氏菌，已經(jīng)成為了人們最關(guān)心的問題之一⑴。國標(biāo)法384789.4-2010）是目前中國規(guī)定的食品中沙門氏菌的標(biāo)準檢測方法，也是基層實驗室普遍采用的檢測方法，它根據(jù)沙門氏菌的生長特點和生化特性，采取前增菌、增菌、分離、生化試驗和血清學(xué)鑒定5個步驟進行⑵。1材料與方法實驗材料儀器設(shè)備均質(zhì)器、三角燒瓶、平皿、玻璃棒、接種棒恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，42℃±1℃吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸頭電子天平PL602-S,梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋SYQ-DSX-280B,上海申安醫(yī)療器械廠試劑藥品雞腸、靛基質(zhì)試劑、沙門氏菌O和H診斷血清、API20E生化試劑盒或VITEKGNI生化鑒定卡培養(yǎng)基蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、HE瓊脂、三糖鐵瓊脂、蛋白胨水、尿素瓊脂、氰化鉀、氰化鉀對照、賴氨酸脫竣酶、賴氨酸脫竣酶對照、甘露醇、山梨醇、B-D半乳糖背（ONPG）培養(yǎng)基實驗方法培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的配制步驟蛋白胨水（BPW）：稱取蛋白胨10g、氯化鈉5g、磷酸氫二鈉9g、磷酸二氫鈉1.5g、蒸餾水1000ml,將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約10min,煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH,高壓滅菌121℃,15min。分裝10瓶，每瓶90ml四硫磺酸鈉煌綠（TTB）：高壓滅菌121℃,15min滅菌冷卻后至30℃,每100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液加碘液2ml,煌綠液1ml配制培養(yǎng)基的注意事項（1）按照說明書上的用量進行換算，稱取準確分量的合成培養(yǎng)基粉末；（2）加熱煮沸溶解培養(yǎng)基時，留意鍋內(nèi)水位的變化，水位下降可再添加適量的水，以免水分蒸發(fā)過多，導(dǎo)致后面分裝不夠量；（3）往試管中放小導(dǎo)管時，注意處理氣泡。沙門氏菌群檢測沙門氏菌檢測程序2沙門氏菌檢測操作步驟前增菌稱取10g（mL）樣品放入盛有90mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min?10000r/min均質(zhì)1min?2min,或置于盛有90mLBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min?2min。使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)，于36℃±1℃培養(yǎng)8h?18h。增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，于42℃士1℃培養(yǎng)18h?24h。同時，另取1mL,轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h。分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個HE瓊脂平板。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h?24h（HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h?48h（BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落，各個平板上的菌落特征見表1表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的囪落特征選棒性瓊脂平板沙門氏菌BS蟠菌落為黑色有金融限驚耨色或灰也懿周周培養(yǎng)軻&黑色或驚色有些菌株用成燧色的畝落，周圍培養(yǎng)基不變■:HE垣脂藍綠色或黃色，多數(shù)青落中心翳色或幾乎至黑色；有些國株為黃色.中心黑色或兒平全黑色XLD瓊騰匐落旦科紅色1帶或不帶黑色中心，有些■株可星現(xiàn)大的帶光涕的黑色中心1或呈現(xiàn)全部黑色的菌落有些菌株為黃鰭落帝或襁黑色中也沙門氏胡髓培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)卦稅嬲行判總生化試驗三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h,必要時可延長至48鼠在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表2。

表2沙門氏筐屬在三糖鐵頊脂和穎氨酸脫馥酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果二藕恢瓊脂賴氨蒯嬲試驗培養(yǎng)基朝好斷斜面底層產(chǎn)氣航化氫KA+(-)+（一:，可疑沙門氏菌屬KA+(-)+(-.)可疑抄門氏菌屬AA+(-)+(-)腺加氏菌屬AA+/—非沙門氏窗KK+『一f一非沙門氏菌由K：產(chǎn)帳A：產(chǎn)酸：+：陽性I一：陰性：+（-）：多獨陽性，少數(shù)陰性：+/-：陽性或陰性口在三糖鐵瓊脂內(nèi)斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，同時賴氨酸脫竣酶試驗陰性的菌株可以排除。其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌屬的可能，同時也均有不是沙門氏菌屬的可能。系列生化反應(yīng)試驗接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗）、尿素瓊脂（PH7.2）、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h,必要時可延長至48h,按表3判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲存于2℃?5℃或室溫至少保留24h,以備必要時復(fù)查。表3沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH12尿素上優(yōu)鉀（KCN）頓氨酸脫皎酶A]——————+A2+————+A3————+/-注：+陽性;-陰性；+/—陽性或陰性.反應(yīng)序號A1：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫竣酶3項中有1項異常，按表4可判定為沙門氏菌，如有2項異常為非沙門氏菌。

表4沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表pH尿素家化椰（KCN）賴氨酸雌酶判定緒果———甲型副睇沙門隔俵求血靜虢緒果）—一瀏〕氏菌腌V〔要求符合糊生化特性）+—一沙門氏盲個別變體（要求血翳鑒超果）注;+表示陽由+表示陰山反應(yīng)序號A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項試驗結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進行判定。反應(yīng)序號A3：補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫竣酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫竣酶陰性。必要時按表5進行沙門氏菌生化群的鑒別。表5沙門氏陵屬各生化辭的飄項目[n111IYV衛(wèi)矛解++——十—山梨盥4-+++十—水楊甘一—+——CNFG——-—+—丙二雌—++———KCN一—+.—注：+孟示陽性；一表示陰性■:血清學(xué)鑒定滴一定生理鹽水在載玻片靠近磨砂的一邊作對照，在另外一邊滴一滴血清，用滅菌后的接種環(huán)從三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面取一點菌種，放進血清中，然后用酒精燈將接種環(huán)滅菌冷卻后，再取少量菌種放進生理鹽水中。觀察血清中的的菌落是否凝結(jié)，與生理鹽水中的菌落對比。結(jié)果與報告綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。3實驗結(jié)果與分析沙門氏菌檢測現(xiàn)象和結(jié)果（見表7）表7沙門氏菌檢測現(xiàn)象和結(jié)果試劑硫化氫蛋白胨（加靛基質(zhì)）尿素氰化鉀賴氨酸脫竣酶現(xiàn)象黑色不變色桃紅色不渾濁綠色結(jié)果+-+-+注：+陽性，-陰性實驗結(jié)果分析對照沙門氏菌生化反應(yīng)初步鑒定表，尿素，氰化鉀，賴氨酸脫竣酸三項中有兩項異常，按沙門氏菌生化鑒定表可判定結(jié)果為非沙門氏菌屬。甘露醇和山梨醇試驗現(xiàn)象和結(jié)果甘露醇和山梨醇都變成黃色，表現(xiàn)為陽性。需要補做血清學(xué)鑒定試驗。OPNG試驗現(xiàn)象和結(jié)果OPNG變成深黃色，表現(xiàn)為陽性，為非沙門氏菌屬。血清學(xué)鑒定實驗現(xiàn)象和結(jié)果血清中的菌落沒有出現(xiàn)凝結(jié)現(xiàn)象，與生理鹽水中的菌落現(xiàn)象一樣。實驗結(jié)果分析血清學(xué)鑒定結(jié)果為該菌落為非沙門氏菌屬。4實驗結(jié)論與討論結(jié)論：綜合以上生化試驗和血清學(xué)試驗的結(jié)果，25g樣品中未檢出沙門氏菌屬。討論：沙門氏菌是重要的腸道致病菌，腸炎沙門氏菌是其中的一種，常引起雞、鴨等禽類感染，還可引起食物中毒⑸，但是實驗結(jié)果顯示為非沙門氏菌屬，可見實驗結(jié)果的正確性可信性不高，實驗過程中可能存在操作失誤（如接種環(huán)還未冷卻就取種，導(dǎo)致菌種死亡）或者其他原因?qū)е聦嶒炂?，?yīng)該重新做實驗，嚴格按照國標(biāo)再次進行試驗，提高實驗的準確性和可信度。鑒于雞肉等畜禽產(chǎn)品污染沙門氏菌所引起食源性疾病的風(fēng)險，越來越多的學(xué)者投入到其生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)的溯源研究中。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法由于存在著抗原的變異及不同種屬菌間的交叉反應(yīng)等，其應(yīng)用受到了一定限制⑶。而ERIC-PCR技術(shù)具有操作簡便、重復(fù)性強，靈敏度高、鑒別能力強、所需儀器設(shè)備簡單、成本低等優(yōu)點，成為細菌基因分型、流行病學(xué)調(diào)查研究領(lǐng)域里強有力的工具引。.5檢驗報告報告陰性結(jié)果：25g樣品中未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌。參考文[1]陳玲.食品中沙門氏菌檢驗方法的研究[J].科技與創(chuàng)新，2015,8.[2]孫園園，趙鵬等.沙門氏菌檢測