實(shí)驗(yàn)八、聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳課件

實(shí)驗(yàn)八SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì)一、目的要求1.學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù)2.學(xué)習(xí)和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù)二、原理

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Bis)在加速劑N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethylethylenediamine，簡(jiǎn)稱(chēng)TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，簡(jiǎn)稱(chēng)AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱(chēng)為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE)。凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。表3.4分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

蛋白質(zhì)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 核酸(RNA) 104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類(lèi)。目前常用的多為圓盤(pán)電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。

圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

圖2夾心垂直板電泳槽示意圖

圖3凝膠模示意圖

1.樣品槽模板2.長(zhǎng)玻璃板1.導(dǎo)線接頭2.下貯槽3.凹形橡膠框

4.樣品槽模板5.固定螺絲6.上貯槽7.冷凝系統(tǒng)

返回（1）樣品濃縮效應(yīng)(a)凝膠孔徑不連續(xù)性：(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；在pH6.7的凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-)尾隨離子(trailingion)或慢離子：甘氨酸根mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過(guò)蛋白質(zhì)；（c)電位梯度的不連續(xù)性：(2)分子篩效應(yīng)(3)電荷效應(yīng)圖5不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖

三、試劑與器材試劑：10%SDS、凝膠貯液（30％ACr-0.8%Bis)、分離膠緩沖液（3.0mol/LpH8.9Tris－HCl緩沖液）、濃縮膠緩沖液（0.5mol/LpH6.7Tris－HCl緩沖液）、10%過(guò)硫酸銨、10%TEMED、pH8.3Tris-Gly電極緩沖液、1%瓊脂糖溶液、0.05％考馬斯亮蘭R250、7%醋酸器材：垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、脫色搖床五、操作方法1.安裝夾心式垂直板電泳槽(1)裝上貯槽和固定螺絲銷(xiāo)釘，仰放在桌面上。(2)將長(zhǎng)、短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽。(4)將下貯槽的銷(xiāo)孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲銷(xiāo)釘?shù)纳腺A槽，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽。(5)豎直電泳槽，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應(yīng)避免有氣泡。3.制備凝膠板 將混合后的分離膠溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加至長(zhǎng)、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1mL注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約3–4mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。約30-60min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。 將上、下貯槽的蒸餾水倒去，將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加到長(zhǎng)、短玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方)，距短玻璃上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板.在上、下貯槽中加入蒸餾水，但不能超過(guò)短玻璃板上緣。靜置電泳槽，10min左右，上膠即可聚合，再放置10-20min，加入電極緩沖液，使液面沒(méi)過(guò)短玻璃板約0.5cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。4.樣品的處理及加樣 將樣品按0.5–1mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時(shí)迸出)，在100℃沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。 用微量進(jìn)樣器取25l上述混合液，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。7.結(jié)果處理

量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率mR:相對(duì)遷移率mR=

蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)六、注意事項(xiàng)（1）安裝電泳槽時(shí)要注