納豆芽孢桿菌答辯 課件

納豆芽孢桿菌發(fā)酵聚谷氨酸過程中專業(yè)：*****研究生：*****指導(dǎo)老師：*****教授

*****副教授

二○一四年五月二十二日谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)機制研究陜西師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文答辯匯報內(nèi)容研究背景與意義1谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究3谷氨酸脫氫酶基因的驗證2鈣離子對發(fā)酵的調(diào)控作用4結(jié)論與展望5研究背景與意義1研究背景與意義

γ-PGA是由L-谷氨酸(L-glutamicacid)或D-谷氨酸(D-glutamicacid)單體通過α-氨基與γ-羧基縮合而成的多肽分子，其結(jié)構(gòu)式如圖所示。微生物發(fā)酵法化學(xué)合成法(γ-PGA、α-PGA)

γ-PGAL-GluD-Glu+γαγα微生物發(fā)酵聚谷氨酸概述研究背景與意義聚谷氨酸產(chǎn)生菌納豆食品納豆激酶聚谷氨酸γ-PGA發(fā)現(xiàn)于1937年，從一種致病的革蘭氏陽性細(xì)菌炭疽芽孢桿菌的莢膜中分離得到。其后發(fā)現(xiàn)了多種芽孢桿菌均能產(chǎn)生這種物質(zhì)，主要包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。由于枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的易培養(yǎng)性和生物安全性，目前對于這兩種菌生產(chǎn)γ-PGA的研究報道較多。在聚谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，納豆芽孢桿菌作為一類從納豆發(fā)酵食品中分離出來的主要菌株，在生產(chǎn)食品級γ-PGA中發(fā)揮了巨大的作用。納豆芽孢桿菌研究背景與意義金屬離子對聚谷氨酸發(fā)酵的影響金屬離子生產(chǎn)菌株調(diào)控作用Mn2+B.licheniformisNCIMB11709、B.subtilisNX-2產(chǎn)生不同程度的γ-PGA的D-異構(gòu)體；延長細(xì)胞活力K+Bacillussp.RKY3激發(fā)菌體細(xì)胞的生長及γ-PGA的產(chǎn)生Mg2+Bacillussp.RKY3激發(fā)菌體細(xì)胞的生長及γ-PGA的產(chǎn)生Na+B.subtilis

chungkookjung有效減少泡沫，降低粘度，改善溶氧及傳質(zhì)；降低γ-PGA的分子量大小Ca2+Bacillussubtilis

HSF1410降低γ-PGA發(fā)酵液的粘度；提高γ-PGA產(chǎn)量；不會引起γ-PGA分子量的變化表1-1不同金屬離子對發(fā)酵的調(diào)控作用研究背景與意義L-Glu主要是由α-酮戊二酸和NH4+由GDH催化合成，接著，ATP被谷氨酸依賴的ATP水解酶水解為ADP和Pi，然后磷酸基團(tuán)結(jié)合到小分子γ-PGA的C-末端，之后D-或者L-谷氨酸的氨基端與C端磷酸化了的小分子γ-PGA發(fā)生親核攻擊，生成Pi并延伸γ-PGA鏈。

前期研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+添加后，菌體內(nèi)α-酮戊二酸節(jié)點上的谷氨酸脫氫酶與未加入Ca2+相比，酶活顯著提高，因此α-酮戊二酸更多地流向了與NH4+形成谷氨酸，合成更多的γ-PGA。谷氨酸依賴的ATP酶PGA聚合酶聚谷氨酸的生物合成途徑圖1-1γ-PGA生物合成途徑谷氨酸脫氫酶研究背景與意義α-酮戊二酸+NH3+NAD(P)HL-谷氨酸+NAD(P)（NADH，NADPH，NAD(P)H三種輔酶依賴型）GDHBacillussubtilis谷氨酸脫氫酶微生物調(diào)控機制立題依據(jù)γ-PGA是一種由微生物發(fā)酵生產(chǎn)而得的高分子物質(zhì)，具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性，因此在食品、農(nóng)業(yè)、化妝品、制藥業(yè)以及環(huán)保等領(lǐng)域應(yīng)用非常的廣泛。國內(nèi)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)規(guī)模小，成本高，發(fā)酵水平低，造成γ-PGA產(chǎn)品價格昂貴，嚴(yán)重制約著這種生物高聚物的實際應(yīng)用水平。因此，如何降低γ-PGA生產(chǎn)成本、提高γ-PGA的產(chǎn)量，是目前γ-PGA研究領(lǐng)域中的重要課題之一。該研究以γ-PGA合成中底物谷氨酸供給調(diào)控機制為突破口，打破以往局限于γ-PGA合成酶及其調(diào)控的研究策略，不僅可初步闡明鈣調(diào)節(jié)GDH活性和谷氨酸合成機制，而且為γ-PGA合成機制研究提供更廣泛的理論和實驗證據(jù)，也有利于為進(jìn)一步提高γ-PGA合成水平提供人為控制的技術(shù)策略。谷氨酸脫氫酶基因的驗證Strains/plasmidDescriptionSource/referenceB.subtilisHSF1410Isolatedfrom“natto”黃柏祺,2010E.coliDH5αF-endA1glnV44thi-1recA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169hsdR17(rK-mK+)λ–Hanahan,1985E.coliBL21(DE3)F-ompTgaldcmlonhsdSB(rB-mB-)λ(DE3[lacIlacUV5-T7gene1ind1sam7nin5])Studier,F.W.,1986plasmidspET28a(+)ExpressvectorKmrT7lacHis-Tag(N,C)T7-tag11(I)thrombin陜西省微生物研究所萬一研究員T-VectorpMD?19(Simple)ClonevectorAprTakara表2-1菌株與質(zhì)粒實驗材料谷氨酸脫氫酶基因的驗證構(gòu)建過程：PCR獲得gdhA基因，TA克隆于T載體中；將表達(dá)載體與含目的片段的T載體分別經(jīng)雙酶切，T4連接酶過夜連接得到含目的基因的重組質(zhì)粒。體外表達(dá)：將重組質(zhì)粒電擊導(dǎo)入大腸桿菌BL21宿主菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，SDS法驗證目的蛋白的表達(dá)。圖2-1pET28a/gdhA構(gòu)建過程示意圖實驗方法谷氨酸脫氫酶基因的驗證結(jié)果與分析1.gdhA克隆、生物信息學(xué)分析及載體構(gòu)建對pET28a/gdhA雙酶切，出現(xiàn)兩條DNA片段，一條是pET28a載體片段（約5.3kb），一條是gdhA谷氨酸脫氫酶基因片段（約1.3kb）。生物信息學(xué)顯示，此gdhA谷氨酸脫氫酶基因有1275個堿基，可編碼424個氨基酸殘基，蛋白分子式C2084H3312N570O630S19，分子量47.05kDa，等電點5.58，總原子數(shù)6615，脂溶指數(shù)87.59，疏水性平均值-0.255，是一個親水性蛋白。圖2-2基因組提取、gdhAPCR擴增與重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖谷氨酸脫氫酶基因的驗證圖2-3gdhA蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析圖結(jié)果：gdhA蛋白序列中，α-螺旋192個，沒有β-螺旋，延伸鏈68個，β-轉(zhuǎn)角36個，其余為無規(guī)則卷曲128個。分析：預(yù)測表明該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲。谷氨酸脫氫酶基因的驗證2.gdhA基因的體外誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果：E.coliBL21表達(dá)宿主成功目的蛋白，且目的蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時間的增長而增加，而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體內(nèi)不含該目的蛋白。該誘導(dǎo)表達(dá)蛋白分子量約47kDa，與gdhA谷氨酸脫氫酶的分子量（47.05kDa）大小一致。分析：證明該目的蛋白的編碼基因gdhA為正確的谷氨酸脫氫酶基因。圖2-4IPTG誘導(dǎo)后菌體全蛋白電泳圖谷氨酸脫氫酶基因的驗證小結(jié)與討論（1）成功從納豆芽孢桿菌HSF1410中克隆得到gdhA谷氨酸脫氫酶基因，基因全長1,275bp，GC含量44.16%。序列比對發(fā)現(xiàn)該基因與NCBI上報道的Bacillussubtilissubsp.nattogudB谷氨酸脫氫酶序列具有100%同源性。（2）構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a/gdhA，成功于大腸桿菌BL21中進(jìn)行g(shù)dhA目的蛋白的表達(dá)，蛋白表達(dá)水平隨著時間的增長而增大。所獲得的目的蛋白分子量與預(yù)測的gdhA編碼蛋白分子量相一致，確證gdhA確為谷氨酸脫氫酶基因。（3）可在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行融合蛋白的純化與酶活驗證實驗，以確認(rèn)所得到的目的蛋白具有谷氨酸脫氫酶活性為宜。

谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究（1）液體種子培養(yǎng)基：液體LB培養(yǎng)基，pH7.0，121℃蒸汽滅菌20min；（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20g/l，谷氨酸鈉10g/l，NH4Cl1g/l，酵母粉1g/l，K2HPO43g/l，MgSO40.2g/l，pH7.0，121℃蒸汽滅菌20min。培養(yǎng)基實驗儀器與設(shè)備UV-Vis分光光度計（TU-1810型）北京普析通用儀器有限責(zé)任公司PikoRealreal-timePCRsystem美國Thermo公司微量核酸蛋白測定儀（NanodropND2000型）美國Thermo公司其他儀器及設(shè)備見第二章2.1.2。谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究實驗技術(shù)路線推測與假設(shè)谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究結(jié)果與分析圖3-1粗酶液中添加不同濃度CaCl2時GDH活性結(jié)果：GDH比活力均在190U/mg左右，方差分析后可知，添加不同濃度Ca2+對粗酶液中谷氨酸脫氫酶活性變化影響不顯著（p=0.934>0.05）。分析：鈣離子對GDH沒有體外直接激活作用。1.鈣離子對谷氨酸脫氫酶的體外調(diào)節(jié)作用谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究2.鈣離子對谷氨酸脫氫酶的體內(nèi)調(diào)節(jié)作用（1）不同鈣離子濃度下谷氨酸脫氫酶酶活分析圖3-2發(fā)酵液中添加不同濃度CaCl2時GDH活性結(jié)果：隨著Ca2+濃度不斷增大，GDH比活力逐步升高。方差分析可知，發(fā)酵過程中添加不同濃度Ca2+對GDH活性變化影響顯著（p=0.000<0.05）。分析：猜測Ca2+在生物體內(nèi)調(diào)節(jié)了GDH基因的轉(zhuǎn)錄水平，使得酶的表達(dá)量提高。谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究①總RNA提取及引物退火溫度優(yōu)化實驗圖3-3總RNA電泳圖圖3-4gapdh基因和gdhA的PCR產(chǎn)物對提取的總RNA進(jìn)行甲醛變性膠電泳，23S及16S條帶清晰完整，說明提取的RNA完整性很好。Tm=60℃時，分別對gapdh，gdhA基因進(jìn)行擴增，產(chǎn)物條帶清晰，長度正確，無引物二聚體。驗證引物特異性良好，退火溫度適宜。谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究②擴增效率測定基因名線性回歸方程R2擴增效率gapdhY=-3.338X+43.0790.996999.336%gdhAY=-3.423X+33.5380.998395.955%表3-2內(nèi)參及目的基因相對標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3-5相對標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴增曲線及熔解曲線結(jié)果：PCR體系穩(wěn)定，引物擴增效率高，實驗重復(fù)性好。熔解曲線單一峰，峰型尖銳無雜峰，說明定量PCR體系結(jié)果真實可靠。分析：兩基因擴增效率均在95-105%范圍內(nèi)，相差不大，表明可以采用相對定量的方法測定目的基因的相對表達(dá)量。谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究③鈣離子對gdhA谷氨酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響圖3-6不同CaCl2濃度組gdhA相對表達(dá)量圖3-7gdpdh與gdhA擴增曲線及熔解曲線結(jié)果：CaCl2濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2‰（w/v）時，gdhA相對表達(dá)量之比為：1:1.18:1.27:1.57:1.76。分析：證實了猜想Ca2+可在菌體生長過程中進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過調(diào)控gdhA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，增加GDH在菌體中的表達(dá)量，使酶活性提高。匯報內(nèi)容研究背景與意義1谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究3谷氨酸脫氫酶基因的驗證2鈣離子對發(fā)酵的調(diào)控作用4結(jié)論與展望5鈣離子對發(fā)酵的調(diào)控作用材料與儀器全自動氨基酸分析儀（L-8900型）日本HITACHI公司其余實驗材料和儀器均參考第三章。實驗方法消解液的制備不同濃度鈣離子發(fā)酵培養(yǎng)取200μL消解液氮氣吹干，0.2M鹽酸定容至5mL，過濾后進(jìn)樣分析取上清發(fā)酵液加入濃鹽酸110℃消解22h1.生物量的測定：OD6002.γ-PGA產(chǎn)量及NH4Cl消耗量測定上述離心后的上清發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后直接過濾，進(jìn)樣分析未消解液的制備通過計算獲得γ-PGA產(chǎn)量和NH4Cl消耗量鈣離子對發(fā)酵的調(diào)控作用結(jié)果與分析1.鈣離子對發(fā)酵液中菌體生物量的影響圖4-1不同CaCl2濃度組對發(fā)酵液中生物量的影響結(jié)果：隨著Ca2+濃度的升高發(fā)酵液中生物量不斷下降。這說明Ca2+對納豆芽孢桿菌的生長繁殖具有逆影響。分析：生物量也是影響γ-PGA產(chǎn)量的重要因素，生物量的下降勢必會造成γ-PGA的產(chǎn)量的降低。鈣離子對發(fā)酵的調(diào)控作用2.鈣離子對γ-PGA產(chǎn)量的影響圖4-2不同CaCl2濃度組中γ-PGA的產(chǎn)量結(jié)果：當(dāng)發(fā)酵液中Ca2+濃度逐漸升高時，γ-PGA產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)CaCl2濃度為0.1‰時，γ-PGA產(chǎn)量可達(dá)最大為9.68g/L。分析：γ-PGA產(chǎn)量的變化是Ca2+對GDH活性的調(diào)控與對發(fā)酵生物量的影響兩者共同作用的結(jié)果。鈣離子對發(fā)酵的調(diào)控作用3.鈣離子對發(fā)酵液中NH4Cl消耗量的影響圖4-3不同CaCl2濃度組中NH4Cl的消耗量結(jié)果：當(dāng)發(fā)酵液中Ca2+濃度升高時，NH4Cl的消耗量呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)CaCl2濃度為0.1‰時，NH4Cl的消耗量可達(dá)最大0.766g/L。分析：該結(jié)果γ-PGA產(chǎn)量變化結(jié)果相一致。鈣離子對發(fā)酵的調(diào)控作用4.鈣離子對γ-PGA產(chǎn)量調(diào)控的可能原因分析Ca2+增加胞內(nèi)GDH表達(dá)量菌體生長繁殖具有抑制作用鈣離子對發(fā)酵的調(diào)控作用小結(jié)與討論（1）實驗表明在發(fā)酵過程中Ca2+對菌體的生長繁殖具有一定的抑制作用。（2）實驗表明在發(fā)酵過程中Ca2+對γ-PGA產(chǎn)量及底物NH4Cl消耗量具有影響作用。CaCl2濃度為0.1‰時，γ-PGA產(chǎn)量可達(dá)最大9.68g/L，底物NH4Cl消耗量同樣為最大0.766g/L。（3）本研究分析了Ca2+對γ-PGA產(chǎn)量調(diào)控的可能原因，以期為Ca2+調(diào)控γ-PGA發(fā)酵提供理論依據(jù)。匯報內(nèi)容研究背景與意義1谷氨酸脫氫酶鈣調(diào)節(jié)機制研究3谷氨酸脫氫酶基因的驗證2鈣離子對發(fā)酵的調(diào)控作用4結(jié)論與展望5結(jié)論與展望結(jié)論本文以納豆芽孢桿菌HSF1410為實驗材料，研究了GDH的Ca2+調(diào)控機制以及Ca2+對發(fā)酵的調(diào)控影響，得出的結(jié)論如下：（1）獲得gdhA谷氨酸脫氫酶基因，序列比對得知gdhA與NCBI上已報道的B.subtilisnattogudB谷氨酸脫氫酶基因序列具有100%同源性；構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a/gdhA，于大腸桿菌BL21中成功進(jìn)行體外表達(dá)，所獲目的蛋白與預(yù)測的gdhA編碼蛋白分子量一致，確證gdhA確為谷氨酸脫氫酶基因。（2）明確了GDH的Ca2+調(diào)節(jié)機制。Ca2+對GDH無體外直接激活作用，而是在發(fā)酵過程中進(jìn)入胞內(nèi)，通過調(diào)控gdhA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，增加了GDH在菌體中的表達(dá)量，從而使細(xì)胞內(nèi)GDH活性升高。結(jié)論與展望（3）考察了發(fā)酵過程中Ca2+對菌體生物量、γ-PGA產(chǎn)量以及NH4Cl消耗量的影響。結(jié)果表明：在發(fā)酵過程中，Ca2+對菌體的生長繁殖具有一定的抑制作用；且對γ-PGA產(chǎn)量和NH4Cl消耗量均具有影響作用。實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中CaCl2最佳添加量為0.1‰，此時γ-PGA產(chǎn)量可達(dá)最大9.68g/L。（4）本研