ELK1結(jié)合位點突變的EGR1啟動子載體構(gòu)建和活性測定

ELK1結(jié)合位點突變的EGR1啟動子載體構(gòu)建和活性測定梁旭竟、張惠華2,熊毅％陳小佳方L暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科2.基因工程藥物國家工程研究中心，廣東省生物工程藥物重點實驗室,暨南大學(xué)生物工程研究所，廣州510632摘要目的構(gòu)建EGR1啟動子片段中ELK1結(jié)合位點突變的載體并測定其活性。方法以己構(gòu)建的人EGR1啟動子載體為模板，在引物上引入突變堿基，重疊PCR擴增獲得突變啟動子序列，T載體亞克隆入pGL3-basic熒光表達載體，獲得重組突變載體pGL3-EGRlmt。用Lipofectanune2000^轉(zhuǎn)染293A細胞，化學(xué)發(fā)光法檢測熒光素酶活性。結(jié)果經(jīng)酶切、PCR&測序鑒定顯示，成功構(gòu)建了pGL3-EGRlmt載體，應(yīng)用雙熒光報告系統(tǒng)檢測顯示轉(zhuǎn)染了重組突變載體的細胞的熒光素酶活性明顯低于未突變組，說明ELK1位點突變成功抑制了啟動子的活性。結(jié)論成功構(gòu)建了pGL3-EGRlmt載體，為進一步研究EGR1對下游信號通路的影響提供了實驗基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:EGR1啟動子；重疊PCR；點突變中圖分類號：Q78ConstructionandactivitydeterminationofEGR1promotervectorwithELK1bindingsitemutationLiangXu-Jing\ZhangHui-hua2,XiongYr,ChenXiao-Jia2('DepartmentofInfectiousDiseases,theFiistAffiliatedHospitalofJinanUniversity,

Guangzliou510630：2NationalEngineermgResearchCenterofGeneticMedicine.Guangdong

ProvincialKeyLaboratoiyofBioengineeringMedicine,BioengineeringInstituteof

Jinan,University,Guangzliou510632,China)AbstractObjectiveToconstiuctEGR1promoterreportvectorwithELK!bmdmgsitemutationandevaluateitsactivity.MethodsTheEGR1promotersequencewithELK1bmdmgsitemutationwasobtainedbyoverlapPCRassayusingpomtmutatedpriineis.pGL3-EGRlmtwasobtamedbywliichtlietargetedsequencewassubclonedmtopGL3-basicvectortluoughT-vector.ThentheactivitiesoffluorescenceweredetectedbvchemiluminescencemethodafterthevectorswereJcotransfectedintotlie293AcellswithLipofectanmie2000.ResultsThepGL3-EGRlmtplasnudwasconstmctedsuccessfullybyrestrictionenzymedigestion,PCRandtheanalysisofnucleotidesequence.TheactivitiesoffluorescenceinthegroupofpGL3-EGRlmtwerelowerthanthatofpGL3-EGRlbydoublefluorescentreportersystem,wliichimpliedthatmutationofELK1uiliibitedpromoteractivity.ConclusionThepGL3-EGRlmtplasnudwasconstmctedsuccessfully,wliichprovideanexperimentalbasisfbrfurtherstudyoftheeffectofEGR1ondownstieamsignalingpathways.Keywords:EGR1promoter；oveilappmgPCR:sitemutant'通訊作者：陳小佳電話:(020)85221983,Email:tchenxj@EGR1(earlygrowthresponse1)屬于即刻早期基因家族中的一員⑴，位于人類染色體5q31,由533個氨基酸組成的分子量為75kD的蛋白質(zhì)【習(xí)。EGR1在不同細胞類型或刺激卜?，可結(jié)合到目的基因DNA上起到激活轉(zhuǎn)錄作用，促進細胞的分化、生長、生長抑制和凋亡⑶。有研究報道，EGR1啟動子上有多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括血清反應(yīng)元件SREs.AP-1結(jié)合位點、cAMP調(diào)控元件CREs和SP1結(jié)合位點等也AhmedPl發(fā)現(xiàn)，EGR1作為癌癥基因治療中的應(yīng)用主要有兩個方面：第一，EGR1啟動子含有空間和時間表達的信息，可通過離子輻射控制具有凋亡和自殺功能的基因的表達來調(diào)控EGR1的表達；第二，EGR1蛋白可■抑制射線誘導(dǎo)的前存活基因(NFkB和bcl-2)和激活前凋亡基因(bax),消除對輻射的抵抗力，從而提高對輻射的敏感程度。ELK1為轉(zhuǎn)錄因子，為ETS家族中的重要成員，能與DNA直接結(jié)合而起到轉(zhuǎn)錄激活作用回。可通過與c-fos啟動子的血清應(yīng)答元件、血清反應(yīng)因子結(jié)合而形成三元復(fù)合物從而介導(dǎo)基因表達。其活性受磷酸化與去磷酸化影響，其表達與NIAPK信號通路有關(guān)，包括Eikl/2.p3信號途徑⑶。根據(jù)軟件分析和文獻報道，在已獲得的EGR1啟動子(-6697157)中含有3個ELK1結(jié)合位點，通過將其中一個結(jié)合位點(CCCGCCGGAACAAC)突變，檢測下游相關(guān)分子的變化，為EGR1在癌癥治療方面的功能和機制研究打下了良好的基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑大腸桿菌DH5a、293A細胞為本實驗室保存。pGL3-basic載體、pRL-TK載體、內(nèi)切酶I、HindHRpMD18-T載體均購自Takaia公司，KOD-Neo-Plus高保真酶、LigationHigh購自Toyobo公司，2xLATaqMix、DNAmarker購自廣州東盛生物公司，LipofectamineTNI2000轉(zhuǎn)染試劑購自Iiivitrogen,雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自Promega公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。1.1.2引物的設(shè)計和合成根據(jù)UCSC收錄的EGR1啟動子序列，利用文獻報道和軟件預(yù)測的ELK1結(jié)合位點(CGACCCGGAAATGC),用Piuner5.0設(shè)計重疊PCR特異性引物。上游引物：5'-ATCGCTCGAGGGGCCCTGGATGACAGCGAT-3'(含有X/?。I酶切位點,劃線部分)，上游重疊引物：5'-CCTTATATGGCATTGAAGAGTCGCAGCTGGT-3，，擴增長度為305bp：下游重疊引物：5'-ACCAGCTGCGACTCTTCAATGCCATATAAGG-3',下游引物：5'-ACCCAAGCTTAACACTGAGAAGCGTGCAGGC-3'(含朽HindIII酶切位點，劃線部分)，擴增長度為596bp,總長度為846bp°1.2方法1.2.1PCR擴增模板為己構(gòu)建好的含有EGR1啟動子序列(-669?+157)的pGL3-EGRl載體，由本研究小組構(gòu)建。PCR反應(yīng)分為兩步，第一步體系為25ul,模板lub1Oxbuffer2.5ul,MgSO41.5ul,dNTP2.5ul,KOD-Neo-Plus0.5ul,上游引物(下游引物)/上游重疊引物(下游重疊引物)分別為0.75ul,3dH=O15.5ul。96°C30s,59°C30s,72°C40s,32循環(huán)。擴增產(chǎn)物純化后，進行第二步。體系為10ul,上、下游純化產(chǎn)物各0.5ul,2xTaqMix5uL4ul3dH2Oo96°C30s,5TC30s,72°C60s,12循環(huán)。反應(yīng)完成后，各補加2xTaqMix5uLlul3dH2O,上游引物和卜游引物各2uL96'C30s,53.5°C30s,72°C60s,32循環(huán)。擴增產(chǎn)物純化后，根據(jù)A-T克隆法，直接跟T載體進行連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5a，在LB培養(yǎng)基上選擇淺色(接近無色)菌落，液體培養(yǎng)，抽提重組質(zhì)粒，酶切、PCR驗證插入片段的大小，測序。序列正確的重組子抽提質(zhì)粒，亞克隆到pGL3-basic,酶切、PCR鑒定，獲得pGL3-EGRlmto1.2.2脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細胞對數(shù)生長期的293A細胞計數(shù)后，按1X"細胞/孔，種于24孔板內(nèi)，待細胞融合度為60%時，進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。以共轉(zhuǎn)染pGL3-EGRl、pRL-TK和pGL3-EGRlmt、pRL-TK為實驗組，pGL3、pRL-TK為對照組,按每孔ipgDNA,用川1Lipofectamine?2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細胞，48h后，收集細胞。1.2.3雙熒光素酶報告實驗每孔細胞加入150111的PLB,室溫輕微振搖30mm,收集細胞裂解液于干凈的EP管中；在白色不透光的96孔板中加入50ul的LARII:將細胞裂解液12,000g離心Imin,取上清25ul加入孔中并吹打均勻；用閱讀儀測量可見光強度10s（此時所讀的光為pGL載體上轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生的螢火蟲熒光素酶所發(fā)出的）；繼續(xù)在孔中加入50ulStop&GioReagent,吹打均勻：用閱讀儀測量可見光強度10s（此時所讀的光為內(nèi)參pRL-TK載體上轉(zhuǎn)錄翻譯出的海腎熒光素酶所發(fā)出的）；將所得到的數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化后進行分析。2結(jié)果2.1EGR1啟動子突變序列的獲得以原有的啟動子片段為模板，利用含有突變堿基的引物進行重疊PCR,分別為596bp和305bp的擴增片段：將得到的擴增片段作為模板進行PCR,獲得全長為846bp的含有突變堿基的啟動子片段，經(jīng)測序鑒定正確（圖1A、IB、1C）oM123M:lOObpDNA標(biāo)準(zhǔn)；1:596bp片段;2:305bp片段;3:846bp的含有突變堿基的啟動子片段圖1AEGR1啟動子突變序列的獲得GGAAGGATCCCTCGCCTTCACAACCCTTATTTG6^.aGGATCCCCCGCCG6AACAACCCTTATT圖1C原始序列圖2.2重組突變載體的構(gòu)建根據(jù)A-T克隆法，先把目的片段連接到PMD18-T載體（圖2A）,經(jīng)Xho\>Hind\\\雙酶切，亞克隆到pGL3-basic載體（圖2B）opGL3-basic載體多克隆位點下游含有螢火蟲熒光素能編碼區(qū)域，熒光素酶表達量的高低間接反映啟動子活性。M：DS5000標(biāo)準(zhǔn)；1:pMD18-T-EGRlmt;23:pMD18-T-EGRlmt雙酶切、PCR圖2ApMD18-T-EGRlmt重組載體的構(gòu)建M1M212345Ml:XHindIIIDNA標(biāo)準(zhǔn);M2:DS2000DNA標(biāo)準(zhǔn)；1:pGL3-basic;3:pGL3-EGRlmt;2、4:pGL3、pGL3-EGRlmt雙酶切；5:pGL3-EGRlmtPCR圖2BpGL3-EGRlmt載體的構(gòu)建2.3突變啟動子活性檢測pGL3-basic載體含有熒光素能報告基因，常用來檢測基因啟動子活性。將PGL3-EGR1和pGL3-EGRlmt分別與內(nèi)對照載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染293A細胞，48h后收集樣品檢測。EGR1啟動子上ELK1結(jié)合位點經(jīng)突變后，其啟動子活性明顯比原始啟動子序列啟動子活性低（圖3）。圖3突變啟動子活性檢測3討論EGR1最初是作為調(diào)控細胞生長和增殖的因子被發(fā)現(xiàn)同，促進細胞從GCVG1期進入G2/M期。高表達的EGR1能穩(wěn)定染色體和抑制增殖，也可以促進分化和細胞凋亡：并能直接調(diào)控一系列的腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子及其受體等的表達，形成下游信號網(wǎng)絡(luò)決定細胞命運站。ELK1為核轉(zhuǎn)錄激活因子，ELK1基因編碼的蛋白結(jié)合細胞核，激活Ras-Raf-MAPK信號通路。通過軟件分析和文獻報道，結(jié)合重疊PCR,對EGR1啟動子原序列上含有的ELK1結(jié)合位點，如果對其結(jié)合位點進行突變，通過雙熒光素酶實驗證明ELK1結(jié)合位點突變后基因啟動子活性明顯下降，則說明ELK1對EGR1的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用。因此，本文對EGR1啟動子相關(guān)ELK1位點突變的研究，為下一步對EGR1功能研究提供了實驗基礎(chǔ)。本研究中主要采用重疊PCR技術(shù)來實現(xiàn)目的堿基的突變。重疊PCR技木（OverlapPCR）由于采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來.與目前市面上發(fā)傳的點突變試劑盒相比，它利用PCR技術(shù)能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，故能夠很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法雅以得到的產(chǎn)物。但是需要注意的是，本技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補引物的設(shè)計，盡管通過引物設(shè)計軟件的輔助分析，但由于在實際操作中，作為模板的核昔酸序列特性不同，不同的PCR儀器升降溫速度，以及PCR反應(yīng)體系等多種因素對實驗的成功都會有影響，因此，需通過具體實驗來分析所設(shè)計引物的可用性。獲得成功的重組報告載體后，本研究還采用了雙熒光報告系統(tǒng)（DLR）來驗證突變重組載體是否有預(yù)期功能。在DLR測試系統(tǒng)中，分別測定細胞裂解液中的熒光蟲和海腎熒光素酶活力。在完成螢火蟲熒光素酶活力的測定后，螢火蟲發(fā)光被快速湮滅，并同時激活海腎熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)（內(nèi)對照）。因此，DLR系統(tǒng)整合了兩個測試化學(xué)，對共表達的兩個報告基因作快速的定量，而旦通過內(nèi)對照，內(nèi)在的變化因素所削弱的實驗準(zhǔn)確性，如培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率，因此，目前該系統(tǒng)廣泛地應(yīng)用于啟動子活性分析的研究。總而言之，通過本研究，為下一步研究EGR1的功能奠定了良好的工作基礎(chǔ)。參考文獻YuJ,BaronVMercolaD,etal.Anetworkofp73,p53andEgrlisrequiredforefficientapoptosisintumorcells[J].CellDeathDifier,2007,14(3):436-446.DeckinamiK,RorschF,SteriR.etal.Dunethvlcelecoxibnilubits111PGES-IpromoteractivitybyuifluenciiigEGR1andNF-kB[J].BiochemPharmacol,2010.80(9):1365-1372.BaronVAdanisonED,CalogeroA,etal.ThetranscnptionfactoregrlisaduectregulatorofmultipletumorsuppressorsmcludmgTGFbetal,PTEN,p53,andfibronectin[J].CancerGeneThei\2006,13(2):115-124.GitenayD,BaionVT.IsEGR1apotentialtargetforprostatecancertherapy?[J].Futu