DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用課件

DNA條形碼技術在生物分類學中的應用DNABarcodingintheidentificationofmedicinalplantsDNA條形碼技術在生物分類學中的應用DNABarcodin1一、前言二、DNA條形碼的概念及原理三、DNA條形碼的標準及優(yōu)點四、DNA條形碼的操作及分析方法五、DNA條形碼在植物中的研究現(xiàn)狀六、DNA條形碼在藥用植物鑒定中的應用主要內(nèi)容一、前言主要內(nèi)容2一、前言長期以來．生物分類學家一直在尋找能夠迅速區(qū)分不同物種的方法。自卡爾-林奈對生物物種進行系統(tǒng)分類以來，生物學家利用各種各樣的性狀——顏色、外形和行為等形態(tài)或者解剖學特征的傳統(tǒng)分類學來鑒定動物和植物，這些特征往往對形態(tài)近似種的鑒定較網(wǎng)難，且可能出現(xiàn)錯誤。

最近數(shù)十年，研究者開始利用DNA中攜帶的遺傳信息來完成這個任務。DNA條形碼(DNAbarcoding)技術是一種利用短的DNA片段對物種進行識別和鑒定的新的分子生物學技術，是生物學近期研究的熱點之一。一、前言長期以來．生物分類學家一直在尋找能夠迅速區(qū)分3二、DNA條形碼的概念及原理

DNABarcoding的概念由加拿大動物學家PaulHebert首次提出。DNA條形碼技術(DNAbarcoding)是利用標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段(DNAbarcode)自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)，它可以對物種進行快速的自動鑒定。二、DNA條形碼的概念及原理DNABarcoding的概4DNA條形碼的原理：DNA是生物的遺傳信息載體，遺傳物質(zhì)的不同，決定了生物的多樣性。由于每種生物物種的DNA序列都是唯一的，就給DNA條形碼提供了物質(zhì)基礎。由于部分堿基的保守性，幾十個堿基的長度不能提供足夠的編碼信息，因此目前的DNA條形碼分析都是基于幾百個堿基長度的DNA序列。DNA條形碼的原理：DNA是生物的遺傳信息載體，遺傳物質(zhì)的不5DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］6DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］72003年，加拿大圭爾夫大學(UniversityofGuelph)PaulHebert教授提出了“DNA條形碼”概念。將條形碼技術引入生物界。其思想產(chǎn)生于現(xiàn)代商品零售業(yè)的條形編碼系統(tǒng)。將超市用以區(qū)分成千上萬種不同商品的條形碼概念引入，利用A、T、C和G4個堿基在基因中的排列順序識別物種，他們把這種小片段基因序列稱作物種的DNA條形碼（DNAbarcodes），并提出為全球生物編碼的計劃。PaulHebert教授率先于2003年選取線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(cytochromecoxidasesubunit1，c01)作為動物中通用的物種鑒定標記，并提出DNA條形碼的定義：通過使用短的標準DNA片段，對物種進行快速、準確的識別和鑒定。

PaulHebert等對動物界包括脊椎動物和無脊椎動物共11門13320個物種的線粒體細胞色素c氧化酶亞基1（CytochromecoxdaseI，COI）基因序列比較分析,發(fā)現(xiàn)98%的物種遺傳距離差異在種內(nèi)為0%-2%，種間平均可達到11.3%，據(jù)此提出可以用單一的小片段基因來代表物種。目前，DNA條形碼技術在很多動物分類群中得到了成功應用2003年，加拿大圭爾夫大學(UniversityofG82004年秋，美國國立生物技術信息中心(NCBI)與生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)簽署合作。物種條形碼的標準DNA序列及其相關數(shù)據(jù)將存檔于GenBank。隨后，GenBank提供的C01序列數(shù)迅速增長．突出表現(xiàn)在除脊索動物之外各類群C01序列數(shù)量的劇增．目前脊索動物的分類基本上都已經(jīng)完成。。2005年2月。倫敦舉辦了第一屆全球DNA條形碼會議．對DNA條形碼的分類理念、實驗技術的細節(jié)分析以及資料庫建立等議題進行了討論。最終目的是聯(lián)合各個類群的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫組建一個全球生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫．將此數(shù)據(jù)庫設置在GenBank中．讓公眾可以自由登錄查詢。2004年秋，美國國立生物技術信息中心(NCBI)與生命條形9DNA條形碼技術的原理DNA條形碼技術是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析從而進行物種鑒定的技術。DNA序列由A，T，C。G4種堿基組成．如果有n個堿基，就會有4n種編碼方式。如果按照這個公式計算。15個堿基位點就能出現(xiàn)近10億種的編碼序列．這個數(shù)字是現(xiàn)存物種的100倍。由于自然選擇的原因。某些位點上的堿基是同定的．從而導致可能的編碼組合數(shù)減少。這可以通過只考慮蛋白編碼基因來解決．因為在蛋白編碼基因里。由于密碼子的簡并性．其第三位堿基通常都不受自然選擇作用的影響，是自由變化。一個長度300bp的蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸片段在第三密碼子位點含有100個核苷酸．這些位點上發(fā)生的替代通常都是中性選擇．并且大多數(shù)都是通過隨機漂變在種群中固定下來的。在這100多個位點上就存在4100種可能性．為隨后的序列比對分析提供了較大的可能性。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展．獲得100多個堿基序列變得非常容易。DNA條形碼技術的原理10理想的DNA條形碼應當符合下列標準①具有足夠的變異性以區(qū)分不同的物種。②同時應具有相對的保守性，以便于用通用引物進行擴增。③必須是一段標準的DNA區(qū)來盡可能鑒別不同的分類群。④目標DNA區(qū)應當包含足夠的系統(tǒng)進化信息以定位物種在分類系統(tǒng)(科，屬等)中的位置。⑤目標DNA區(qū)應該足夠的短，以便有部分降解的DNA擴增。三、DNA條形碼的標準及優(yōu)點理想的DNA條形碼應當符合下列標準三、DNA條形碼的標準及優(yōu)11三、DNA條形碼的標準及優(yōu)點Kress等(2005)和Taberlet等(2007)提出了理想的DNA條形碼標準：(1)可以區(qū)分物種的足夠變異和分化，同時種內(nèi)變異必須足夠??；(2)有高度保守的引物設計區(qū)以便于設計通用引物；(3)片段足夠短，以便于DNA提取和PCR擴增，尤其是對部分降解的DNA的擴增。三、DNA條形碼的標準及優(yōu)點Kress等(2005)和Tab122004年，由AlfredSloan基金會贊助，在美國華盛頓特區(qū)舉辦了一個關于DNA條形碼的大型研討會，此次會議創(chuàng)立了生命條形碼聯(lián)盟(CBOL,theConsortiumfortheBarcodeofLife)。生命條形碼聯(lián)盟闡述了DNA條形碼的優(yōu)點：(1)以DNA序列為檢測對象，生物的DNA是由遺傳信息決定的，因此同種生物不同生長時期的DNA序列信息是相同的，即使經(jīng)過加工，形態(tài)發(fā)生變化，DNA序列信息不會改變，較之傳統(tǒng)的方法，擴大了檢測樣本范圍；同時樣本部分受損也不會影響識別結果。(2)可進行非專家物種鑒定。只要設計一套簡單的實驗方案，經(jīng)過簡單培訓的技術員即可操作。2004年，由AlfredSloan基金會贊助，在美國華13(3)準確性高。特定的物種具有特定的DNA序列信息，而形態(tài)學鑒別特征會因趨同和變異導致物種的鑒定誤差。(4)通過建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可一次性快速鑒定大量樣本。分類學家新的研究成果將不斷地加入數(shù)據(jù)庫，成為永久性資料，從而推動分類學科更加快速深入地發(fā)展。(3)準確性高。特定的物種具有特定的DNA序列信息，而形態(tài)學14四、DNA條形碼的操作及分析方法DNA條形碼的操作過程與分子生物學實驗類似，包括采集材料并提取DNA、利用通用引物PCR擴增目的片段、純化PCR產(chǎn)物、序序列測定與分析以及提交結果到相關數(shù)據(jù)庫。條形碼的應用目標是所有物種，并且每個物種需要多份材料。采集材料時應以傳統(tǒng)的形態(tài)分類學知識為依據(jù)，盡可能地涵蓋傳統(tǒng)分類學中的變異式樣。通常認為每個物種至少需要10份材料，并最好包括5個不同居群。四、DNA條形碼的操作及分析方法DNA條形碼的操作過程與分子15DNA的提取

根據(jù)樣品的不同，可以采用不同的提取方法，例如CTAB法、TrizolQiagenDNeasykit等(DoyleJJ，DoyleJL.1987)設計通用引物一般情況下，可以通過分析NCBI和GenBank數(shù)據(jù)庫中的DNA序列，在模板的保守區(qū)內(nèi)利用專業(yè)軟件設計引物。DNA的提取16DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］17PCR擴增以樣品DNA為模板，利用通用引物進行擴增。不同序列有不同的PCR程序。有時需要在實驗中調(diào)整PCR程序，才能得到目標序列。一般而言，如果樣品DNA純度高且完整，則有利于PCR的進行。如果樣品DNA有較為嚴重的降解現(xiàn)象，可以根據(jù)基因葉綠體trnL(UAA)內(nèi)含子的短片段重新設計通用引物，有利于序列擴增。PCR擴增18全新4通道實時熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀全新4通道實時熒光定量PCR儀普通梯度PCR儀19PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退20基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段21基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增22瓊脂糖凝膠電泳用于檢測PCR擴增效率，選取擴增效果好的樣品，進行單向或雙向測序。測序原理目前用于測序的技術主要是Sanger于1977年發(fā)明的雙脫氧核糖核酸鏈末端終止法。瓊脂糖凝膠電泳23這種測序方法是根據(jù)核普酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核普酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列?；驹硎敲總€反應含有所有四種脫氧核營酸三磷酸(dNTP)使之擴增，并混入限量的一種不同雙脫氧核普三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’一OH基團，使延長的寡聚核普酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點由反應中相應的雙脫氧而定。這種測序方法是根據(jù)核普酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定24DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］25DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］26序列分析生物條形碼工程的首要目標是建立可用來作為鑒定標本工具的基因序列數(shù)據(jù)庫。目前只建立了動物條形碼數(shù)據(jù)庫，植物條形碼尚處于評估階段，只有該技術在植物中進一步完善后才有可能建立相應的數(shù)據(jù)庫。序列數(shù)據(jù)分析是DNA條形碼探索的最重要環(huán)節(jié)，由于植物的種間雜交現(xiàn)象比較普遍，因此植物條形碼的分析方法也處于不斷的摸索中。序列分析27目前報道的序列分析方法基本分為以下幾步：(1)序列比對和人工校正。一般采用ClustalW，生命條形碼數(shù)據(jù)庫中使用HiddenMarkovModels行序列比對，也可以BLASTsearch在Genbank中搜索相似的基因片段對比片段信息的可靠性。(2)遺傳分析。植物條形碼需要對不同片段的種間和種內(nèi)變異進行對比，以選擇最佳的片段或片段組合。種間距離基本采用Kimura-2-parameterdistance(K2P)模型計算。理想的DNA條形碼檢測到的種間遺傳變異應明顯大于種內(nèi)遺傳變異。(3)系統(tǒng)學分析。采用標準的系統(tǒng)學分析方法，建立系統(tǒng)發(fā)生樹，檢驗同一個物種的不同個體能否聚在一起。目前報道的序列分析方法基本分為以下幾步：28DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］29DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］30五、DNA條形碼在植物中的研究現(xiàn)狀在植物中DNA條形碼的研究進展相對緩慢，主要有兩方面原因：(1)植物線粒體基因組進化速率較慢，遺傳分化小，因此動物中的標準片段COI不適用于植物；(2)系統(tǒng)學研究中常用的片段變異較小，不適合用作條形碼片段(Chaseetal.,2005;Kressetal.,2005)。由于核基因組通常具有多拷貝的特性，且物種內(nèi)變異較大，引物通用性差，并且擴增時對模板DNA的質(zhì)量要求高，不適用于存在DNA降解的材料(Kressetal.,2005)，因此，植物中最可能的條形碼還是從葉綠體基因組中選擇(Chaseetal.,2005;Cowanetal.,2006)。五、DNA條形碼在植物中的研究現(xiàn)狀在植物中DNA條形碼的研究31生物條形碼聯(lián)盟(CBOL)最初建議的植物條形碼片段均為葉綠體段：matK，rpoC1，rpoB，accD，nhdJ和YCF5。但因為后3個片段在一些主要的植物類群中有缺失，如YCF5在苔蘚類植物中缺失，accD在禾本科植物中缺失，而ndhJ在松屬植物中缺失，因此它們在第二階段的更新中已被排除。由于越來越多的研究表明單靠某一個片段不太可能對所有的植物物種進行準確鑒定，研究者又相繼提出了不同的片段組合方案。生物條形碼聯(lián)盟(CBOL)最初建議的植物條形碼片段均為葉綠體32片段組合方案最早由Kress等(2005)提出。Kress等(2005)通過對53科88屬99個物種的9個質(zhì)體基因片段(trnK-rps16、trnH-psbA、rp136-rps8、atpB-rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD和trnL-trnF)和核基因ITS序列進行分析，提出了片段組合方案,并預測ITS+trnH-psbA組合將在有花植物(floweringplants)中有較廣泛的應用價值。片段組合方案最早由Kress等(2005)提出。33為了尋求一種通用的植物條形碼，許多學者進行了積極的探索，已提出了多種條形碼片段或組合方法，但至今仍沒有達成明確的共識?，F(xiàn)有的研究報道了在2種組合方案中選擇片段的方法，分別是Chase等(2005)提出的交通燈法(trafficlightapproach)和Newmaster等(2006)提出的等級(tier)分類法。為了尋求一種通用的植物條形碼，許多學者進行了積極的探索，已提342007年9月，在第二屆國際生命條形碼大會上，總結了5種片段組合：Chase等(2007)提出的rpoC1+rpoB+matK或rpoC1+matK+trnH-psbA；Kress和Erickson(2007)提出的rbcL+trnH-psbA，其可以對陸生植物進行識別和鑒定。韓國植物學家Ki-JoongKim等提出的matK+atpF-atpH+psbK-psbI或matK+atpF-atpH+trnHpsbA(Pennisi,2007)2007年9月，在第二屆國際生命條形碼大會上，總結了5種片段35Steele等(2010)用5個葉綠體DNA片段組合，對葫蘆科Psiguria屬的6個種進行了條形碼鑒定，發(fā)現(xiàn)每個物種均擁有各自獨特的條形碼。2009年11月7日至13日在墨西哥召開的第三屆DNA條形碼國際學術大會上，與會者達成共識，一致建議在rbcL和matK之外，選擇進化速率較快的ITS和trnH-psbA，探討它們在陸地植物中的通用性、分辨率和適合程度。Steele等(2010)用5個葉綠體DNA片段組合，對葫蘆36植物基因組的進化與動物基因組的完全不同。動物存在生殖隔離，不同物種的動物無法繁殖雜交后代，可以此為標準鑒定動物物種，但許多植物物種間可以互相雜交，這就模糊了它們之間的遺傳邊界(geneticboundary)，造成了植物在種的水平上有較大的差異。因此在尋求整個植物界通用的條形碼過程中，可首先找出適合于大部分植物的片段或組合，其它少部分則作為特例，再針對不同的科屬選擇不同的條形碼。編碼基因通常變異較小，特別是葉綠體基因組相對比較保守，使用編碼基因和非編碼基因的組合，可能會更好地識別和鑒定物種。多片段組合將是植物條形碼選擇的最終方案。植物基因組的進化與動物基因組的完全不同。動物存在生殖隔離，不37DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］38DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］39DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］40六、DNA條形碼在藥用植物鑒定中的應用DNA條形碼已經(jīng)在動物中得到廣泛應用，在植物中的研究也正在快速開展，這將有助于非分類學專業(yè)工作者對有關材料進行快速、準確的鑒定，尤其是對于藥材的鑒定。由于各片段(尤其是多片段的組合選擇)在不同類群中的應用效果不同，目前尚未獲得一致的植物條形碼標準片段，因此，當前的研究熱點仍然是選擇和評價可能的條形碼片段，進行更大規(guī)模的分析和整體評價。六、DNA條形碼在藥用植物鑒定中的應用DNA條形碼已經(jīng)在動物41目前，DNA條形碼以其快速、準確和自動化，在生物物種鑒定領域的研究方興未艾，而在藥材鑒定中的應用尚處于萌芽狀態(tài)。如能將DNA條形碼用于市場品種混亂的多來源藥材的鑒定，彌補其在藥材質(zhì)量評價方面的不足，形成能夠全面反映藥材的生物基原、質(zhì)量、產(chǎn)地等信息的DNA條形碼系統(tǒng)，則可以快速準確的鑒定多來源的藥材。該系統(tǒng)不僅能夠用于藥材的鑒定與質(zhì)量評價，還可以探討原植物間的親緣關系及系統(tǒng)發(fā)育。目前，DNA條形碼以其快速、準確和自動化，在生物物種鑒定領域42遠景預期技術成熟后可形成供企業(yè)使用的藥材生產(chǎn)標準，在進貨時以DNA條形碼系統(tǒng)進行質(zhì)量控制，在藥材成品上標識DNA條形碼，質(zhì)檢部門可對其進行驗證判斷真?zhèn)渭笆欠穹仙庂|(zhì)量標準。隨著DNA條形碼技術的飛速發(fā)展，可以預見地球上幾乎所有生物種類都將具備唯一的DNA條形碼。該技術有著巨大的應用潛力，不久的將來，手持式快速物種鑒定設備的投入使用將給藥材的快速鑒定工作帶來巨大的便利。遠景預期技術成熟后可形成供企業(yè)使用的藥材生產(chǎn)標準，在進貨時以43謝謝謝謝44植物DNA條形碼技術的應用范疇1.物種鑒定以及新種和隱種的發(fā)現(xiàn)除了可以進行物種鑒定外，利用DNA條形碼技術還可以發(fā)現(xiàn)許多新種和隱種。例如，Lahaye等單獨使用matK片段對分布在中美洲的l000多種蘭科植物進行分析，顯示單獨使用matK片段能夠揭示隱種并且證明了DNA條形碼的可行性；2010年，Newmaster等通過DNA條形碼技術發(fā)現(xiàn)了感應草屬(BiophytumDC．)中的3個隱種，并發(fā)現(xiàn)了草沙蠶屬(TripogonRoem．etSchuh．)的1個新種。協(xié)助傳統(tǒng)分類方法發(fā)現(xiàn)那些形態(tài)相似但存在遺傳分化的隱種是DNA條形碼技術對分類學研究的重要貢獻，可顯著提高實地生態(tài)學考察研究的準確性和效率。植物DNA條形碼技術的應用范疇1.物種鑒定以及新種和隱種的發(fā)452.用于解決一些生物學問題Jurado—Rivera等舊副認為：DNA條形碼還可用于解決一些復雜的牛物學問題，如寄生關系等。通過擴增草食性動物牛的trnL基因，發(fā)現(xiàn)Peltoschema與4種寄生植物關系密切。因此，利用DNA條形碼可以正確識別寄生植物并確定營養(yǎng)關系。2.用于解決一些生物學問題463.在民族植物學研究中的應用值得一提的是，DNA條形碼技術在民族植物學研究中也得到了一定的應用。民族植物學以傳統(tǒng)社會管理和利用的植物為主要研究對象，在研究過程中常常通過借助民間分類學家(parataxonomist)的知識來獲得當?shù)厝藢χ参镞M行分門別類的信息。這些民間分類學家的知識有些是傳承自長輩、有些則結合了自己的觀察和實踐，他們不必像分類學家那樣一般需要獲得植物的繁殖器官才能有效鑒定物種，而是基于他們長期積累的知識、通過植物某個生長階段的某個(些)器官(通常是營養(yǎng)器官)，就能準確說出植物的當?shù)孛Q、生長習性、資源和分布狀況、用途和用法等3.在民族植物學研究中的應用47在開展民族植物學研究的過程中，由植物分類學家和民間分類學家分別獲得的植物種數(shù)往往存在一定的差異，或前者數(shù)量多于后者，或后者數(shù)量多于前者。到底哪一個物種數(shù)是準確的?在沒有足夠的時間等待植物開花和結果的情況下，采集植物葉片通過DNA條形碼技術進行分類簽定，是一種理想的快速鑒別方法。在開展民族植物學研究的過程中，由植物分類學48基于這樣的設想，加拿大圭爾夫大學的Newmaster博士及其合作者，將DNA條形碼技術應用于民族植物學的研究。印度南部西高止山脈的2個山地部落Irulas和Malasars把在當?shù)乇环Q為“Sunaipul”的1種草沙蠶屬禾草用于祭祀和其他經(jīng)濟用途，這種植物對當?shù)厣鐓^(qū)居民十分重要，因而當?shù)氐拿耖g分類學家(或信息提供者informant)能輕易識別這一物種。有趣的是，這是1個植物分類學上的隱種，植物分類學家難以通過形態(tài)特征朱識別。Newmaster等采用DNA條形碼技術，不僅證實了民問分類學家鑒定該物種的正確性，而且發(fā)現(xiàn)Sunaipul是植物學上的1個新種，將其命名為TripogoncopeNewmaster。因此，他們認為DNA條形碼技術可以應用于一些民間分類群(ethnotaxon)的鑒定和識別。Newmaster等還將DNA條形碼與基因組學的相關技術相結合，應用于印度一些部落的民間分類群，包括民族藥用植物。在此基礎上，他們提出了“民族植物基因組學”(ethnobotanygenomics)的概念，認為通過民族植物基因組學的研究，可以識別一些隱種，還能確定一些珍稀植物的分布及其生態(tài)學特性隱種

cryptic

species

亦稱“孿生種”。繁殖隔離而形態(tài)上幾乎無區(qū)別的不同物種。隱存是指種群間由于彼此形態(tài)的相似性而無法區(qū)分，并非指其顏色或形態(tài)酷似其生存背景或基底而無法辨認。隱存種在有些生物類群中相當普遍。

基于這樣的設想，加拿大圭爾夫大學的Newmaster博士及其49清風藤屬(SabiaColebr．)中的小花清風藤(SabiaparvifloraWall．exRoxb．)是1種非常重要的民間藥用植物，被貴州和云南的布依族民眾廣泛用于治療黃疸型肝炎、止血和消炎，布依族民眾也使用同屬植物作為代用品，但是一些形態(tài)相似的混淆品已經(jīng)進入市場。龍春林領導的研究組用trnH-psbA、rbcL和matK片段對6種清風藤屬植物和7種市場混淆品進行鑒定，結果表明：這3個DNA片段的擴增成功率和物種識別率都很高，且小花清風藤與同屬替代品之間的序列差異率較低(僅為00.00％一0.86％)，但與混淆品之間的序列差異率卻較高(達24．50％)，說明布依族民眾識別清風藤屬植物的傳統(tǒng)知識是可靠的。研究結果還表明，DNA條形碼技術不僅可以有效鑒別市場上小花清風藤的混淆品，而且對民族傳統(tǒng)醫(yī)藥文化的保護有重要作用。清風藤屬(SabiaColebr．)中的小花清風藤504.構建AIT系統(tǒng)2009年，Newmaster等提出開發(fā)和研制AIT(automatedidentificationtechnology)系統(tǒng)，即：將1片未知的植物葉片插入AIT機，通過無線網(wǎng)絡，就可以獲得該葉片所代表植物的名稱、分布、化學成分、食用價值等，既省時又經(jīng)濟，可代替昂貴又費時的傳統(tǒng)分類方法，同時也減少了通過形態(tài)特征識別物種的一些限制因素。預計AIT系統(tǒng)可能會給生物界帶來革命性的改變，也會對人類社會產(chǎn)生重要影響。4.構建AIT系統(tǒng)51DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］52DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］53DNA條形碼技術在生物分類學中的應用DNABarcodingintheidentificationofmedicinalplantsDNA條形碼技術在生物分類學中的應用DNABarcodin54一、前言二、DNA條形碼的概念及原理三、DNA條形碼的標準及優(yōu)點四、DNA條形碼的操作及分析方法五、DNA條形碼在植物中的研究現(xiàn)狀六、DNA條形碼在藥用植物鑒定中的應用主要內(nèi)容一、前言主要內(nèi)容55一、前言長期以來．生物分類學家一直在尋找能夠迅速區(qū)分不同物種的方法。自卡爾-林奈對生物物種進行系統(tǒng)分類以來，生物學家利用各種各樣的性狀——顏色、外形和行為等形態(tài)或者解剖學特征的傳統(tǒng)分類學來鑒定動物和植物，這些特征往往對形態(tài)近似種的鑒定較網(wǎng)難，且可能出現(xiàn)錯誤。

最近數(shù)十年，研究者開始利用DNA中攜帶的遺傳信息來完成這個任務。DNA條形碼(DNAbarcoding)技術是一種利用短的DNA片段對物種進行識別和鑒定的新的分子生物學技術，是生物學近期研究的熱點之一。一、前言長期以來．生物分類學家一直在尋找能夠迅速區(qū)分56二、DNA條形碼的概念及原理

DNABarcoding的概念由加拿大動物學家PaulHebert首次提出。DNA條形碼技術(DNAbarcoding)是利用標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段(DNAbarcode)自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)，它可以對物種進行快速的自動鑒定。二、DNA條形碼的概念及原理DNABarcoding的概57DNA條形碼的原理：DNA是生物的遺傳信息載體，遺傳物質(zhì)的不同，決定了生物的多樣性。由于每種生物物種的DNA序列都是唯一的，就給DNA條形碼提供了物質(zhì)基礎。由于部分堿基的保守性，幾十個堿基的長度不能提供足夠的編碼信息，因此目前的DNA條形碼分析都是基于幾百個堿基長度的DNA序列。DNA條形碼的原理：DNA是生物的遺傳信息載體，遺傳物質(zhì)的不58DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］59DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］602003年，加拿大圭爾夫大學(UniversityofGuelph)PaulHebert教授提出了“DNA條形碼”概念。將條形碼技術引入生物界。其思想產(chǎn)生于現(xiàn)代商品零售業(yè)的條形編碼系統(tǒng)。將超市用以區(qū)分成千上萬種不同商品的條形碼概念引入，利用A、T、C和G4個堿基在基因中的排列順序識別物種，他們把這種小片段基因序列稱作物種的DNA條形碼（DNAbarcodes），并提出為全球生物編碼的計劃。PaulHebert教授率先于2003年選取線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(cytochromecoxidasesubunit1，c01)作為動物中通用的物種鑒定標記，并提出DNA條形碼的定義：通過使用短的標準DNA片段，對物種進行快速、準確的識別和鑒定。

PaulHebert等對動物界包括脊椎動物和無脊椎動物共11門13320個物種的線粒體細胞色素c氧化酶亞基1（CytochromecoxdaseI，COI）基因序列比較分析,發(fā)現(xiàn)98%的物種遺傳距離差異在種內(nèi)為0%-2%，種間平均可達到11.3%，據(jù)此提出可以用單一的小片段基因來代表物種。目前，DNA條形碼技術在很多動物分類群中得到了成功應用2003年，加拿大圭爾夫大學(UniversityofG612004年秋，美國國立生物技術信息中心(NCBI)與生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)簽署合作。物種條形碼的標準DNA序列及其相關數(shù)據(jù)將存檔于GenBank。隨后，GenBank提供的C01序列數(shù)迅速增長．突出表現(xiàn)在除脊索動物之外各類群C01序列數(shù)量的劇增．目前脊索動物的分類基本上都已經(jīng)完成。。2005年2月。倫敦舉辦了第一屆全球DNA條形碼會議．對DNA條形碼的分類理念、實驗技術的細節(jié)分析以及資料庫建立等議題進行了討論。最終目的是聯(lián)合各個類群的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫組建一個全球生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫．將此數(shù)據(jù)庫設置在GenBank中．讓公眾可以自由登錄查詢。2004年秋，美國國立生物技術信息中心(NCBI)與生命條形62DNA條形碼技術的原理DNA條形碼技術是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析從而進行物種鑒定的技術。DNA序列由A，T，C。G4種堿基組成．如果有n個堿基，就會有4n種編碼方式。如果按照這個公式計算。15個堿基位點就能出現(xiàn)近10億種的編碼序列．這個數(shù)字是現(xiàn)存物種的100倍。由于自然選擇的原因。某些位點上的堿基是同定的．從而導致可能的編碼組合數(shù)減少。這可以通過只考慮蛋白編碼基因來解決．因為在蛋白編碼基因里。由于密碼子的簡并性．其第三位堿基通常都不受自然選擇作用的影響，是自由變化。一個長度300bp的蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸片段在第三密碼子位點含有100個核苷酸．這些位點上發(fā)生的替代通常都是中性選擇．并且大多數(shù)都是通過隨機漂變在種群中固定下來的。在這100多個位點上就存在4100種可能性．為隨后的序列比對分析提供了較大的可能性。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展．獲得100多個堿基序列變得非常容易。DNA條形碼技術的原理63理想的DNA條形碼應當符合下列標準①具有足夠的變異性以區(qū)分不同的物種。②同時應具有相對的保守性，以便于用通用引物進行擴增。③必須是一段標準的DNA區(qū)來盡可能鑒別不同的分類群。④目標DNA區(qū)應當包含足夠的系統(tǒng)進化信息以定位物種在分類系統(tǒng)(科，屬等)中的位置。⑤目標DNA區(qū)應該足夠的短，以便有部分降解的DNA擴增。三、DNA條形碼的標準及優(yōu)點理想的DNA條形碼應當符合下列標準三、DNA條形碼的標準及優(yōu)64三、DNA條形碼的標準及優(yōu)點Kress等(2005)和Taberlet等(2007)提出了理想的DNA條形碼標準：(1)可以區(qū)分物種的足夠變異和分化，同時種內(nèi)變異必須足夠小；(2)有高度保守的引物設計區(qū)以便于設計通用引物；(3)片段足夠短，以便于DNA提取和PCR擴增，尤其是對部分降解的DNA的擴增。三、DNA條形碼的標準及優(yōu)點Kress等(2005)和Tab652004年，由AlfredSloan基金會贊助，在美國華盛頓特區(qū)舉辦了一個關于DNA條形碼的大型研討會，此次會議創(chuàng)立了生命條形碼聯(lián)盟(CBOL,theConsortiumfortheBarcodeofLife)。生命條形碼聯(lián)盟闡述了DNA條形碼的優(yōu)點：(1)以DNA序列為檢測對象，生物的DNA是由遺傳信息決定的，因此同種生物不同生長時期的DNA序列信息是相同的，即使經(jīng)過加工，形態(tài)發(fā)生變化，DNA序列信息不會改變，較之傳統(tǒng)的方法，擴大了檢測樣本范圍；同時樣本部分受損也不會影響識別結果。(2)可進行非專家物種鑒定。只要設計一套簡單的實驗方案，經(jīng)過簡單培訓的技術員即可操作。2004年，由AlfredSloan基金會贊助，在美國華66(3)準確性高。特定的物種具有特定的DNA序列信息，而形態(tài)學鑒別特征會因趨同和變異導致物種的鑒定誤差。(4)通過建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可一次性快速鑒定大量樣本。分類學家新的研究成果將不斷地加入數(shù)據(jù)庫，成為永久性資料，從而推動分類學科更加快速深入地發(fā)展。(3)準確性高。特定的物種具有特定的DNA序列信息，而形態(tài)學67四、DNA條形碼的操作及分析方法DNA條形碼的操作過程與分子生物學實驗類似，包括采集材料并提取DNA、利用通用引物PCR擴增目的片段、純化PCR產(chǎn)物、序序列測定與分析以及提交結果到相關數(shù)據(jù)庫。條形碼的應用目標是所有物種，并且每個物種需要多份材料。采集材料時應以傳統(tǒng)的形態(tài)分類學知識為依據(jù)，盡可能地涵蓋傳統(tǒng)分類學中的變異式樣。通常認為每個物種至少需要10份材料，并最好包括5個不同居群。四、DNA條形碼的操作及分析方法DNA條形碼的操作過程與分子68DNA的提取

根據(jù)樣品的不同，可以采用不同的提取方法，例如CTAB法、TrizolQiagenDNeasykit等(DoyleJJ，DoyleJL.1987)設計通用引物一般情況下，可以通過分析NCBI和GenBank數(shù)據(jù)庫中的DNA序列，在模板的保守區(qū)內(nèi)利用專業(yè)軟件設計引物。DNA的提取69DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］70PCR擴增以樣品DNA為模板，利用通用引物進行擴增。不同序列有不同的PCR程序。有時需要在實驗中調(diào)整PCR程序，才能得到目標序列。一般而言，如果樣品DNA純度高且完整，則有利于PCR的進行。如果樣品DNA有較為嚴重的降解現(xiàn)象，可以根據(jù)基因葉綠體trnL(UAA)內(nèi)含子的短片段重新設計通用引物，有利于序列擴增。PCR擴增71全新4通道實時熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀全新4通道實時熒光定量PCR儀普通梯度PCR儀72PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退73基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段74基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增75瓊脂糖凝膠電泳用于檢測PCR擴增效率，選取擴增效果好的樣品，進行單向或雙向測序。測序原理目前用于測序的技術主要是Sanger于1977年發(fā)明的雙脫氧核糖核酸鏈末端終止法。瓊脂糖凝膠電泳76這種測序方法是根據(jù)核普酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核普酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。基本原理是每個反應含有所有四種脫氧核營酸三磷酸(dNTP)使之擴增，并混入限量的一種不同雙脫氧核普三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’一OH基團，使延長的寡聚核普酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點由反應中相應的雙脫氧而定。這種測序方法是根據(jù)核普酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定77DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］78DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］79序列分析生物條形碼工程的首要目標是建立可用來作為鑒定標本工具的基因序列數(shù)據(jù)庫。目前只建立了動物條形碼數(shù)據(jù)庫，植物條形碼尚處于評估階段，只有該技術在植物中進一步完善后才有可能建立相應的數(shù)據(jù)庫。序列數(shù)據(jù)分析是DNA條形碼探索的最重要環(huán)節(jié)，由于植物的種間雜交現(xiàn)象比較普遍，因此植物條形碼的分析方法也處于不斷的摸索中。序列分析80目前報道的序列分析方法基本分為以下幾步：(1)序列比對和人工校正。一般采用ClustalW，生命條形碼數(shù)據(jù)庫中使用HiddenMarkovModels行序列比對，也可以BLASTsearch在Genbank中搜索相似的基因片段對比片段信息的可靠性。(2)遺傳分析。植物條形碼需要對不同片段的種間和種內(nèi)變異進行對比，以選擇最佳的片段或片段組合。種間距離基本采用Kimura-2-parameterdistance(K2P)模型計算。理想的DNA條形碼檢測到的種間遺傳變異應明顯大于種內(nèi)遺傳變異。(3)系統(tǒng)學分析。采用標準的系統(tǒng)學分析方法，建立系統(tǒng)發(fā)生樹，檢驗同一個物種的不同個體能否聚在一起。目前報道的序列分析方法基本分為以下幾步：81DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］82DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］83五、DNA條形碼在植物中的研究現(xiàn)狀在植物中DNA條形碼的研究進展相對緩慢，主要有兩方面原因：(1)植物線粒體基因組進化速率較慢，遺傳分化小，因此動物中的標準片段COI不適用于植物；(2)系統(tǒng)學研究中常用的片段變異較小，不適合用作條形碼片段(Chaseetal.,2005;Kressetal.,2005)。由于核基因組通常具有多拷貝的特性，且物種內(nèi)變異較大，引物通用性差，并且擴增時對模板DNA的質(zhì)量要求高，不適用于存在DNA降解的材料(Kressetal.,2005)，因此，植物中最可能的條形碼還是從葉綠體基因組中選擇(Chaseetal.,2005;Cowanetal.,2006)。五、DNA條形碼在植物中的研究現(xiàn)狀在植物中DNA條形碼的研究84生物條形碼聯(lián)盟(CBOL)最初建議的植物條形碼片段均為葉綠體段：matK，rpoC1，rpoB，accD，nhdJ和YCF5。但因為后3個片段在一些主要的植物類群中有缺失，如YCF5在苔蘚類植物中缺失，accD在禾本科植物中缺失，而ndhJ在松屬植物中缺失，因此它們在第二階段的更新中已被排除。由于越來越多的研究表明單靠某一個片段不太可能對所有的植物物種進行準確鑒定，研究者又相繼提出了不同的片段組合方案。生物條形碼聯(lián)盟(CBOL)最初建議的植物條形碼片段均為葉綠體85片段組合方案最早由Kress等(2005)提出。Kress等(2005)通過對53科88屬99個物種的9個質(zhì)體基因片段(trnK-rps16、trnH-psbA、rp136-rps8、atpB-rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD和trnL-trnF)和核基因ITS序列進行分析，提出了片段組合方案,并預測ITS+trnH-psbA組合將在有花植物(floweringplants)中有較廣泛的應用價值。片段組合方案最早由Kress等(2005)提出。86為了尋求一種通用的植物條形碼，許多學者進行了積極的探索，已提出了多種條形碼片段或組合方法，但至今仍沒有達成明確的共識。現(xiàn)有的研究報道了在2種組合方案中選擇片段的方法，分別是Chase等(2005)提出的交通燈法(trafficlightapproach)和Newmaster等(2006)提出的等級(tier)分類法。為了尋求一種通用的植物條形碼，許多學者進行了積極的探索，已提872007年9月，在第二屆國際生命條形碼大會上，總結了5種片段組合：Chase等(2007)提出的rpoC1+rpoB+matK或rpoC1+matK+trnH-psbA；Kress和Erickson(2007)提出的rbcL+trnH-psbA，其可以對陸生植物進行識別和鑒定。韓國植物學家Ki-JoongKim等提出的matK+atpF-atpH+psbK-psbI或matK+atpF-atpH+trnHpsbA(Pennisi,2007)2007年9月，在第二屆國際生命條形碼大會上，總結了5種片段88Steele等(2010)用5個葉綠體DNA片段組合，對葫蘆科Psiguria屬的6個種進行了條形碼鑒定，發(fā)現(xiàn)每個物種均擁有各自獨特的條形碼。2009年11月7日至13日在墨西哥召開的第三屆DNA條形碼國際學術大會上，與會者達成共識，一致建議在rbcL和matK之外，選擇進化速率較快的ITS和trnH-psbA，探討它們在陸地植物中的通用性、分辨率和適合程度。Steele等(2010)用5個葉綠體DNA片段組合，對葫蘆89植物基因組的進化與動物基因組的完全不同。動物存在生殖隔離，不同物種的動物無法繁殖雜交后代，可以此為標準鑒定動物物種，但許多植物物種間可以互相雜交，這就模糊了它們之間的遺傳邊界(geneticboundary)，造成了植物在種的水平上有較大的差異。因此在尋求整個植物界通用的條形碼過程中，可首先找出適合于大部分植物的片段或組合，其它少部分則作為特例，再針對不同的科屬選擇不同的條形碼。編碼基因通常變異較小，特別是葉綠體基因組相對比較保守，使用編碼基因和非編碼基因的組合，可能會更好地識別和鑒定物種。多片段組合將是植物條形碼選擇的最終方案。植物基因組的進化與動物基因組的完全不同。動物存在生殖隔離，不90DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］91DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］92DNA條形碼技術在生物分類學鑒定中的應用［課件］93六、DNA條形碼在藥用植物鑒定中的應用DNA條形碼已經(jīng)在動物中得到廣泛應用，在植物中的研究也正在快速開展，這將有助于非分類學專業(yè)工作者對有關材料進行快速、準確的鑒定，尤其是對于藥材的鑒定。由于各片段(尤其是多片段的組合選擇)在不同類群中的應用效果不同，目前尚未獲得一致的植物條形碼標準片段，因此，當前的研究熱點仍然是選擇和評價可能的條形碼片段，進行更大規(guī)模的分析和整體評價。六、DNA條形碼在藥用植物鑒定中的應用DNA條形碼已經(jīng)在動物94目前，DNA條形碼以其快速、準確和自動化，在生物物種鑒定領域的研究方興未艾，而在藥材鑒定中的應用尚處于萌芽狀態(tài)。如能將DNA條形碼用于市場品種混亂的多來源藥材的鑒定，彌補其在藥材質(zhì)量評價方面的不足，形成能夠全面反映藥材的生物基原、質(zhì)量、產(chǎn)地等信息的DNA條形碼系統(tǒng)，則可以快速準確的鑒定多來源的藥材。該系統(tǒng)不僅能夠用于藥材的鑒定與質(zhì)量評價，還可以探討原植物間的親緣關系及系統(tǒng)發(fā)育。目前，DNA條形碼以其快速、準確和自動化，在生物物種鑒定領域95遠景預期技術成熟后可形成供企業(yè)使用的藥材生產(chǎn)標準，在進貨時以DNA條形碼系統(tǒng)進行質(zhì)量控制，在藥材成品上標識DNA條形碼，質(zhì)檢部門可對其進行驗證判斷真?zhèn)渭笆欠穹仙庂|(zhì)量標準。隨著DNA條形碼技術的飛速發(fā)展，可以預見地球上幾乎所有生物種類都將具備唯一的DNA條形碼。該技術有著巨大的應用潛力，不久的將來，手持式快速物種鑒定設備的投入使用將給藥材的快速鑒定工作帶來巨大的便利。遠景預期技術成熟后可形成供企業(yè)使用的藥材生產(chǎn)標準，在進貨時以96謝謝謝謝97植物DNA條形碼技術的應用范疇1.物種鑒定以及新種和隱種的發(fā)現(xiàn)除了可以進行物種鑒定外，利用DNA條形碼技術還可以發(fā)現(xiàn)許多新種和隱種。例如，Lahaye等單獨使用matK片段對分布在中美洲的l000多種蘭科植物進行分析，顯示單獨使用matK片段能夠揭示隱種并且證明了DNA條形碼的可行性；2010年，Newmaster等通過DNA條形碼技術發(fā)現(xiàn)了感應草屬(BiophytumDC．)中的3個隱種，并發(fā)現(xiàn)了草沙蠶屬(TripogonRoem．etSchuh．)的1個新種。協(xié)助傳統(tǒng)分類方法發(fā)現(xiàn)那些形態(tài)相似但存在遺傳分化的隱種是DNA條形碼技術對分類學研究的重要貢獻，可顯著提高實地生態(tài)學考察研究的準確性和效率。植物DNA條形碼技術的應用范疇1.物種鑒定以及新種和隱種的發(fā)982.用于解決一些生物學問題Jurado—Rivera等舊副認為：DNA條形碼還可用于解決一些復雜的牛物學問題，