發(fā)酵工程原生質(zhì)體育種

第第四交育獅獅虎獅獅虎面包面包酵母酵（能進(jìn)雜發(fā)酵，利用麥芽糖能力強(qiáng)雜交育種是雜交育種是指將兩型不經(jīng)吻合(或接合)使遺傳物質(zhì)重新組合離和篩選出具有新性狀菌株的舉通過(guò)具有不同遺傳性狀菌株的雜交，使遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換、重組，改變親株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，擴(kuò)大變異范圍，使兩親株的優(yōu)良性狀集中于重組體，獲得新品種； 緩慢等缺陷，也可以提高對(duì)誘變劑的敏感性可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，促進(jìn)遺傳理論的發(fā)展。選擇原始親選擇原始親誘變篩選直接親雜篩選重組重組體分析鑒親本標(biāo)記親本選 親和力測(cè)

原始親 直接親 原始親本：具有不同遺傳背景的優(yōu)質(zhì)，主要根據(jù)雜交的目的來(lái)選擇直接親本：在雜交育種中具有遺傳標(biāo)記和親和能力而直接用于雜交配對(duì)的菌株。培養(yǎng)基有限培養(yǎng)基（LM）：供異核體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基（M）：鑒別重組體的培養(yǎng)基（鑒別培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基）營(yíng)養(yǎng)缺陷型顏常規(guī)雜交常規(guī)雜交育原育轉(zhuǎn)染原原再種原育種的優(yōu)原 無(wú)細(xì)胞壁，誘變劑能更迅速的內(nèi)滲與DNA作用原生 是單個(gè)分散的細(xì)胞，與誘變劑接觸面大，易受誘變作用；原生 再生本質(zhì)上是細(xì)胞壁重建和 能力恢復(fù)的過(guò)程，再生的細(xì)胞壁可能在組成與結(jié)構(gòu)上都發(fā)生變化，甚至于產(chǎn)生可遺傳的利于細(xì)胞代謝和產(chǎn)物外泌的變異；原生 的出發(fā)材料一般為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，對(duì)環(huán)境和誘變劑較為敏感；1、原 原生再種是微生物原生質(zhì)體后直接再生，從再生菌落中分離篩選變異菌株，最終得到優(yōu)良性狀提高的正變株。例 福提霉素產(chǎn)生菌小單孢菌（micromonosporasp.SIPI4812）原 泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌經(jīng)二輪原生再生誘誘變作種內(nèi)原自然融影響孢子形篩選作菌種活化和預(yù)培遺菌種活化和預(yù)培遺傳穩(wěn)定性鑒原再種的 原復(fù)原原復(fù)原再高產(chǎn)菌株分離（初篩2、原 誘變育原生誘變育種是以微生物原為育種材料，然后分離到再生培養(yǎng)基中再生，并從再生菌落中篩選高產(chǎn)突變菌株的過(guò)程。 誘變劑原生誘孢子正變負(fù)變正變負(fù)變-60Co---He-Ne激2-5-0原原項(xiàng)原孢細(xì)胞結(jié)無(wú)細(xì)胞致密細(xì)胞細(xì)胞狀對(duì)誘變劑敏強(qiáng)弱誘變劑作用快慢誘變效原原菌種特性及發(fā)酵特性研菌種特性及發(fā)酵特性研遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性鑒原 復(fù) 原 再 高產(chǎn)菌株分離（初篩PEGPEG原的菌齡，菌絲的生長(zhǎng)條件和質(zhì)粒的濃原 再生條件，再生培養(yǎng)基組成等3通過(guò)轉(zhuǎn)化，通過(guò)轉(zhuǎn)化，將質(zhì)粒DNA片段DNA轉(zhuǎn)入原的技術(shù)影響轉(zhuǎn)化的原原菌種特性及發(fā)酵特性研菌種特性及發(fā)酵特性研遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性鑒原

復(fù)以一定例混合，在PEG介導(dǎo)下成轉(zhuǎn)化過(guò)原 再 高產(chǎn)菌株分離（初篩第五第五育融原原原原融合育種是型不的菌株融合使遺傳物質(zhì)重新組合從中分離和篩選出具有新性狀菌株的過(guò)程 原原選定純化親本原融原生原融

選定純化親本原生B檢出融合融合子的分離和融合重組體的1、滅活標(biāo)滅活原

是指采用熱、紫外線、電離輻射以及某些生化試劑、抗生素等作為滅活劑處理單一親株或雙親株的原生，使細(xì)胞內(nèi)的某些酶或代謝途徑鈍化而失去再生的能力，經(jīng)細(xì)胞融合后，由于損傷部位的互補(bǔ)可以形成能再生的融合體。 原生A（野生型55℃鈍化原生

原生再生（營(yíng)養(yǎng)缺陷型、再生（-

篩原養(yǎng)型重組2、熒光標(biāo)是一種工遺傳標(biāo)記。在雙親原除去多余后，將帶有不同熒光色素的親本原生融合，然后挑選同時(shí)具有雙的的（（一）原的過(guò)接離收集菌酶斜面孢接離收集菌酶斜面孢液體培養(yǎng)高滲溶原1、培養(yǎng)甘氨酸：替代D-壁肽聚糖的交聯(lián)，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，利于原 形成EDTA：能與多種金屬離子形成絡(luò)合物，避免金屬離子對(duì)青霉素：松動(dòng)細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞壁對(duì)脫壁酶的敏感性，更有利于原生 的形成。2、菌

3、酶的種4、酶濃

酵母牛真選擇利于原 形成和再生的酶濃度55、酶解溫度和控制適合的酶解溫度和pH6、酶解時(shí)控制適合6、酶解時(shí)控制適合的酶解時(shí)間

8、滲透壓穩(wěn)定 霉菌：KCl和NaCl等穩(wěn)定劑的使用濃度一般為0.3～0.8mol／L在滲透壓穩(wěn)定劑中，Ca2+、Mg2+是必不可PEG介PEG介導(dǎo)融電融激光誘導(dǎo)融脂（Liposome）融合等融原原的融合的11、PEG（聚乙二醇）原A原 B（10原A（A∶B=1∶130%~40%PEG，CaCl 適溫處理1~10min以再生培養(yǎng)基稀釋4~5低速離心除去重懸，涂布選擇性PEG：脫水②能降PEG：脫水②能降低原 的膜電能促進(jìn)磷脂分子紊亂和重新組織原生（A∶B=1∶1 原生粘合、收縮、高度變形、小區(qū)域融細(xì)小原生逐漸增原 完全融PEG介導(dǎo)融合關(guān)鍵因PEGPEG分子量4000～6000PEG作用終濃度30%～40%Ca2+作用濃度為0.052、電 F的作用，根據(jù)雙向電泳現(xiàn)象，原生向電極的方向泳動(dòng)。與此同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生偶極化，促使原生相互粘連，并使細(xì)胞沿電力線方向排列成串，融合細(xì)胞之間形成緊密接觸。原生在電場(chǎng)作用下沿電力線方向排電場(chǎng)作用下原生質(zhì)膜被擊穿的過(guò)然后在外加瞬間高頻直流強(qiáng)電壓作用，以50μs時(shí)程脈沖沖擊原生粘連點(diǎn)，擾亂原生膜的分子排列，使之穿孔，然后發(fā)生原電場(chǎng)作用下原生質(zhì)膜被擊穿的過(guò)原生膜相互粘質(zhì)膜分子排列擾分子排列嚴(yán)重受質(zhì)膜穿孔形成通 在再生培養(yǎng)基上實(shí)是含高滲穩(wěn)定劑的完是含高滲穩(wěn)定劑的完全培養(yǎng)基Ca2+、Mg2+必不可少R2YE培養(yǎng)基（用于鏈霉菌原生再生 10.3，K2SO4 MgCl2·6H2O1.012，Glucose 0.2，Casaminoacid0.1， 0.4，Yeastextract0.4，Traceelement KH2PO4 CaCl2·2H2O Tris-HCl(0.25mol/L,pH7.2)NaOH 原原大分子合成與原 生 合成細(xì)胞壁物質(zhì)，組裝、恢復(fù)成完整細(xì)胞；能力恢復(fù)開(kāi) 繁殖成為正常的細(xì)胞形態(tài)和菌落 原生再生過(guò)程中細(xì)胞壁合成和重建階菌體的生理狀年青菌 的原 再生能力 穩(wěn)定

酶的作用濃度及作用時(shí)選擇利于原生形成和再生的酶濃降低原生的再生率。再再生培養(yǎng)基的組Ca2+、Mg2+濃磷酸鹽再生培養(yǎng)基的水再生培養(yǎng)基表面的水分要揮原生再生率的計(jì)算能再生細(xì)胞壁的原生再生率 ————————————— x原生總原生再生菌落數(shù)-非原生再生菌落=—————————————————— x原生總數(shù)（血球計(jì)數(shù)結(jié)果高滲溶液涂皿再生菌數(shù)-水涂皿再生菌=—————————————————— x原生總數(shù)（血球計(jì)數(shù)結(jié)果融合子融合子的檢出主要依靠?jī)蓚€(gè)親本的選擇性標(biāo)親本A（a+b-