實驗一、RNA提取方法及原理課件

實驗一、RNA提取方法及原理一、研究背景二、方法及原理一、研究背景1.RNA研究的重要性DNA，RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。二、方法及原理1、RNA的提取流程

（1）樣本前處理（2）細(xì)胞裂解（3）RNA的純化及獲得RNA提取流程－－樣品前處理注意點

選擇新鮮血液，不得超過4小時選擇新鮮的幼嫩組織選擇處于生長旺盛的時期收集細(xì)胞選擇新鮮組織，生長旺盛的組織可將新鮮血液先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，得到的白細(xì)胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存較長時間去掉培養(yǎng)基，加入一定量TRNzol-70℃保存較長時間推薦使用專門的RNA樣品儲存液進(jìn)行儲存液氮或加入RNase抑制劑中保存，避免反復(fù)凍融RNA提取流程－－樣品前處理中如何保存樣本RNA提取流程－－細(xì)胞裂解，以釋放RNA異硫氰酸胍/酚－TRNzol總RNA提取試劑獨特配方--RNAplant植物RNA提取試劑胍鹽/β-巰基乙醇—RNAprep系列RNA提取試劑盒2.RNA提取的注意事項杜絕外源酶的污染a.嚴(yán)格戴好口罩，手套。b.實驗所涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。c.實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。明確自己的抽提目的a.任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。b.RNA抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實驗的一次成功，而不是得率。

復(fù)習(xí)核酸的提取方法RNA的提取苯酚水溶液提取細(xì)胞破碎→勻漿等體積90％苯酚水溶液振蕩→RNA、Pro分開→RNA、多糖（水層）；DNA、Pro（苯酚層）冷酚法、熱酚法，注意苯酚除雜復(fù)習(xí)核酸的提取方法DNA提取濃鹽法：1mol/L氯化鈉溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質(zhì)或：先用稀鹽除去RNA－Pro，再用濃鹽提取也可用苯酚法，苯酚層得到DNA、Pro復(fù)習(xí)核酸的提取方法核酸的沉淀DNA的等電點4-4.5，RNA的等電點2-2.5.收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。Trizol

試劑提RNA的原理Trizol

試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑。Trizol中含苯酚和異硫氰酸胍，可保護(hù)RNA免受RNase的污染。Trizol試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整性，裂解細(xì)胞并釋放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分離,加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。TRIzol法提取流程1.樣品處理：

組織：取100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置勻漿器中，加入1mlTrizol充分勻漿，勻漿液轉(zhuǎn)1.5ml離心管中,室溫靜置５min。2.加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。3.4℃離心，13000g×15min，取上清。4.加入與上清1:1的異丙醇(約0.5ml)，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置20min(-20℃，時間長效果更好)。

取200-300ul從5步往下做。細(xì)胞基因組DNA水相有機(jī)相RNA氯仿純化pH5.7離心加入裂解液(TRNzol-A+)實驗流程圖細(xì)胞選擇貼壁細(xì)胞

懸浮細(xì)胞RNA提取常見問題

RNA的降解

OD260/OD280

比值偏低電泳帶型異常下游實驗效果不佳RNA降解冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對小一點；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時補(bǔ)充液氮。OD260/OD280比值偏低

蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。電泳帶型異常

非變性電泳：上樣量超過

3ug，電壓超過

6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致

28S和

18S條帶分不開。

變性電泳條帶變淡：

EB與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；甲醛的質(zhì)量不高。下游實驗效果不佳

RNA降解

抽提試劑的殘留

75%乙醇洗滌

樣品中雜質(zhì)的殘留

多糖等雜質(zhì)，再次沉淀

DNA污染

使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNARNA的保存短期保存：可將RNA溶解于TE緩沖液(10mmol／LTris，1mmol／LEDTA)或無：RNA酶水(0.1mmol／LEDTA)中，保存于一20℃。在保存RNA樣品時，通常使用EDTA來螯合RNA酶以防止其降解RNA。值得注意的是，許多實驗室配制EDTA后常使用很長時間甚至數(shù)年，這種長期使用的EDTA溶液常有微生物存在，反而會造成RNA酶的污染。中長期保存：相對于一20℃，一80℃可進(jìn)一步防止RNA降解?？蓪NA溶解于TE緩沖液或無RNA酶水中，保存于一80℃，通常可保存6個月左右。長期保存：保存RNA最為穩(wěn)定的方法是經(jīng)乙醇沉