藥學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)

緒論分子生物學(xué)(molecularbiology〕:是在分子水平爭辯生命現(xiàn)象的科學(xué)，是現(xiàn)代生命科學(xué)的共同語言。核心內(nèi)容是通過生物的物質(zhì)根底——核酸、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的構(gòu)造、功能及其相互作用等運(yùn)動規(guī)律的爭辯來說明生命分子根底，從而探討生命的奇特。藥學(xué)分子生物學(xué)(pharmaceuticalmolecularbiology)：由于分子生物學(xué)的理論、技術(shù)滲入到藥學(xué)爭辯領(lǐng)域，從而使藥物學(xué)爭辯以化學(xué)、藥學(xué)的培育模式轉(zhuǎn)化為以生命科學(xué)、藥學(xué)和化學(xué)相結(jié)合的藥模式。核酸、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的構(gòu)造、功能及相互作用分子生物學(xué)在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用：1、DNA重組技術(shù)與藥爭辯2、藥物基因組學(xué)、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)與現(xiàn)代藥物爭辯3、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)是基因、蛋白質(zhì)、疾病三者相連的橋梁科學(xué)第一章核酸的分子構(gòu)造、性質(zhì)和功能核酸的根本構(gòu)造〔重點(diǎn)把握：磷酸核苷堿基戊糖引起DNA構(gòu)象轉(zhuǎn)變的因素：核苷酸挨次、堿基組成、鹽的種類、相對濕度。DNA雙螺旋構(gòu)造有利 氫鍵 不利疏水力穩(wěn)定性的影響：mRNA:遺傳信息

堿基積存力

靜電斥力真核生物的mRNA構(gòu)造:5”53’非編碼區(qū)—3’polyAmRNA5”碼區(qū)—終止區(qū)—3’非編碼區(qū)tRNA的二級構(gòu)造：三葉草形三級構(gòu)造：倒L功能： 承受氨基酸、攜帶氨基酸，把氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體上，然后依據(jù)mRNA上的密碼挨次裝配成多肽或蛋白質(zhì)。rRNA：組成核蛋白體核酸分子雜交的原理：復(fù)性〔DNA〕反義RNA的作用機(jī)制〔把握：Ⅰ類反義RNA:直接作用于靶mRNA的SD碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA鏈RNA，從而易被RNAⅡ類反義RNA：與mRNAmRNA化，抑制翻譯；Ⅲ類反義RNA：則直接抑制靶mRNA雙鏈RNA誘導(dǎo)誘導(dǎo)RNAi的過程主要分為兩個(gè)階段〔重點(diǎn)把握：Ⅰ啟動階段Ⅱ執(zhí)行階段啟動階段：當(dāng)細(xì)胞中由于感染等緣由消滅雙鏈RNA細(xì)胞中一種稱為Dicer鏈RNA21-23bpRNA〔siRN，單鏈siRNARNARISC〕執(zhí)行階段：當(dāng)目標(biāo)mRNA與RISC中的siRNARISCRNA，并由細(xì)胞中的核酸酶將其進(jìn)一步降解，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)病毒核酸的特點(diǎn)〔了解：病毒只含一種核酸，構(gòu)成病毒體的心髓。核酸類型多態(tài)化分子量小，基因組構(gòu)造簡潔，所含基因組數(shù)目少病毒基因組核酸復(fù)制多樣化病毒核酸更易受宿主細(xì)胞的影響而發(fā)生基因突變和重組DNARNA樣的核酸成為傳染性核酸DNA:脫氧核糖、磷酸、堿基組蛋白：堿性氨基酸，帶正電，如精氨酸、賴氨酸。非組蛋白：酸性氨基酸，帶負(fù)電，如天冬氨酸、谷氨酸。少量RNA酶RNA的含量最少?；虻亩x：基因的生物學(xué)定義:是攜帶生物遺傳信息的構(gòu)造單位，又是把握一個(gè)特定性狀的功能單位?；虻姆肿由飳W(xué)定義：指DNA具有肯定長度的片段。嚴(yán)格地說，基因不僅包含編碼蛋白質(zhì)肽鏈或RNA包括為保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列?；蚪M(genome)：是細(xì)胞中一套完整單體遺傳物質(zhì)的總和?；蚪M構(gòu)造的異同：原核生物原核生物真核生物基因組很小基因組浩大簡單，含多種序列成分幾乎無蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體有操縱子構(gòu)造基因家族化，有重復(fù)序列基因多連續(xù)，有重疊基因基因不連續(xù)〔真核細(xì)胞病毒除外〕多順反子單順反子以單拷貝和多拷貝兩種形式存在以單拷貝和多拷貝兩種形式存在第三章、可移動的遺傳因子〔轉(zhuǎn)座子)和染色體外的遺傳因子轉(zhuǎn)座子(transposon)：原核生物和真核生物基因組中存在著可以從一個(gè)部位轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)部位的DNA逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子〔retransposon〕:指內(nèi)部含逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列，通過DNA RNA DNA方式進(jìn)展轉(zhuǎn)座，即轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的RNA，再經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄生成的轉(zhuǎn)座子DNA并整合到基因組中。質(zhì)粒〔plasmid〕:是多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物細(xì)胞染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA遺傳重組〔geneticrecombination〕:減數(shù)分裂時(shí)，通過同源染色體的交換和非同源染色體的獨(dú)立安排，使子代細(xì)胞的遺傳信息產(chǎn)生了重組合，這種現(xiàn)象稱為遺傳重組。同源重組〔homologousrecombination〕:指發(fā)生在兩條雙鏈DNA的同源序列之間，涉及的是大片段同源DNA位點(diǎn)特異重組〔site-specificrecombination〕:指不依靠于DNA序列的同源性，而依靠于能與某些酶相結(jié)合的特異DNA簡述原核生物轉(zhuǎn)座子的類型及組成特點(diǎn)：①IS——兩端有ITR,只能編碼轉(zhuǎn)座酶；②類轉(zhuǎn)座子——構(gòu)造同IS，但不能獨(dú)立存在，僅作為復(fù)合轉(zhuǎn)座子的兩端組件；③復(fù)合轉(zhuǎn)座子——兩端由ISIS④TnAITR,可編碼轉(zhuǎn)座酶、解離酶和抗性物質(zhì)。解釋逆轉(zhuǎn)錄病毒與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的區(qū)分：② 轉(zhuǎn)錄病毒是具有感染力量的病毒顆粒，可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移；②逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主DNA但是不能在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移。DNA⑴質(zhì)粒的復(fù)制 嚴(yán)密型質(zhì)粒的復(fù)制松弛型質(zhì)粒的復(fù)制⑵質(zhì)粒的不相容性⑶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性⑷質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記試述大腸桿菌同源重組酶的特點(diǎn)〔p92：⑴RecBCD:具有外切核酸酶活性，序列特異性的單鏈內(nèi)切酶的活性DNAATPaseATP為解旋供給能量；⑵RecA：DNAATPase各種DNA⑶RuvAB：RuvAHolliday〔ATPase〕憑借其解旋酶活性，推動HollidayRuvHolliday同源重組與位點(diǎn)特異重組有何不同：①同源重組中DNA位點(diǎn)特異性重組是在某些特異的DNA②同源重組后染色體內(nèi)的DNA位點(diǎn)特異性重組中DNADNA序列發(fā)生重排，從而得到不同的結(jié)果。Holliday模型的步驟：1、兩個(gè)DNA分子單鏈的同一部位發(fā)生斷裂；2holliday連接體；3、通過分支移動產(chǎn)生同另一分子的互補(bǔ)序列形成異源雙鏈DNA；180，中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體的DNA。分別為片段重組體和拼接重組體。第四章DNA的復(fù)制、突變、損傷和修復(fù)復(fù)制〔replication〕DNADNADNA，一股單鏈從親代完整地承受過來，另一股單鏈則完全從合成。復(fù)制子：兩個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)之間的DNA復(fù)制叉：DNAY形構(gòu)造稱為復(fù)制叉。使DNA〔1〕ATPDNA解開成為兩條單鏈。DNASSB—在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。DNADNA聚合酶：原核生物：DNA-pol對復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)展校讀，對復(fù)制和修復(fù)DNA-polⅡ

中消滅的空隙進(jìn)展填補(bǔ)DNA-polⅢ是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。合成后隨鏈，引物酶活性DNAβ：DNADNAδ:先導(dǎo)鏈合成DNAγ：線粒體DNA的合成DNAε：機(jī)制不明類似于δ端粒：真核生物染色體線性DNA端粒的構(gòu)造特點(diǎn)：1、由末端單鏈DNA2、末端DNAG、C端粒的功能：1、維持染色體的穩(wěn)定性；2、維持DNA端粒酶的組成：端粒酶RNA；端粒酶協(xié)同蛋白；端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：3”-疊氮胸苷〔AZT〕DNAD噬菌體和病毒DNA的復(fù)制：滾環(huán)復(fù)制AZT逆轉(zhuǎn)錄酶合成病毒DNAAZTDNAAZT3’-OH3’-5’磷酸二酯鍵，使病毒DNA〔HIV〕突變可分為：自發(fā)突變；誘發(fā)突變突變類型 堿基置換突變 點(diǎn)突變〔轉(zhuǎn)換、顛換〕單點(diǎn)突變堿基插入〔較長〕 多點(diǎn)突變堿基缺失〔較長〕的轉(zhuǎn)變移碼突變：是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式轉(zhuǎn)變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列挨次發(fā)生轉(zhuǎn)變。依據(jù)密碼子遺傳信息轉(zhuǎn)變分類：同義突變、錯(cuò)義突變、無義突變依據(jù)突變表現(xiàn)型對外界環(huán)境的敏感性分類：非條件性突變、條件性突變突變型與野生型的變換：正相突變、回復(fù)突變突變緣由：〔一〕自發(fā)突變〔脫氨基、脫嘌呤〕〔二〕誘發(fā)突變１．射線〔１〕堿基類似物〔２〕氨基嘌呤〔３〕堿基修飾劑〔亞硝酸、羥胺、烷化劑〕〔４〕ＤＮＡ插入劑〔三〕基因的人工誘變DNA的修復(fù)系統(tǒng)：一、復(fù)制修復(fù)二、損傷修復(fù)

尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)錯(cuò)配修復(fù)無嘌呤〔AP〕修復(fù)光復(fù)活修復(fù)甲基轉(zhuǎn)移酶修復(fù)切除修復(fù)三、復(fù)制后修復(fù) 大腸桿菌的重組修復(fù)系統(tǒng)SOS修復(fù)光復(fù)活修復(fù)〔原理胸腺嘧啶在uv的作用下生成TT二聚體〔胸腺嘧啶二聚體復(fù)活酶在藍(lán)光的照耀下激活，是二聚體解離。限制與修飾限制：限制性內(nèi)切酶切斷外來的DNA修飾：甲基化酶保護(hù)細(xì)胞自身的DNA渥曼青霉素的作用機(jī)制〔抑制腫瘤細(xì)胞〕抑制DNA損傷修復(fù)的蛋白激酶的活性，DNA的修復(fù)功能減弱，增加多耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性。第五章轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄〔transcriptio：生物體以DNA為模板合成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄單位：RNADNA模板的一個(gè)特定位點(diǎn)，并在另一位點(diǎn)處終止，這一特定區(qū)域稱為轉(zhuǎn)錄單位?！参挥谵D(zhuǎn)錄起點(diǎn)到轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)之間的DNA〕不對稱轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄選擇性稱為不對稱轉(zhuǎn)錄。有兩方面含義1〕在DNA指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；〔2〕模板鏈并非總是在同一單鏈上復(fù)制與轉(zhuǎn)錄一樣點(diǎn)：以DNA為模板；由5’向3’方向延長；反響體系需要Mg2+區(qū)分：啟動子〔promote：是指RNADNA序列。原核生物啟動子：1、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)保守序列2、-10序列(Pribnow框〕-35序列(Sextama框〕作用部位間隔區(qū): 17bp轉(zhuǎn)錄效率最高CAP結(jié)合位點(diǎn)RNAII的啟動子構(gòu)造：1、起始子；2、TATA框(-25)；3、CAAT框(-75)；4、GC框(-90)；5、增加子(遠(yuǎn)上游序列)〔enhancer):1、遠(yuǎn)上游序列；2、轉(zhuǎn)錄頻率增加；4、大多為重復(fù)序列；5、組織特異性、細(xì)胞特異性；6、無基因?qū)Ｒ恍裕?、受外部信號調(diào)控原核生物轉(zhuǎn)錄起始需要RNA聚合酶全酶〔δ；兩個(gè)α、β、β’,后四個(gè)為核心酶〕ρ因子：NTP酶的活性；解旋酶的活性?！卜且揽喀岩蜃拥慕K止〕RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactors,TF)：RNA些關(guān)心因子〔蛋白質(zhì)〕〔真核生物〕RNA生物合成抑制劑：利福霉素：抑制細(xì)菌RNA聚合酶〔抑制聚合酶的活性起始階段〕利迪鏈霉素：抑制細(xì)菌RNA聚合酶〔作用于β亞基抑制延長〕RNA聚合酶〔抑制聚合酶活性〕真核生物mRNA前體加工：〔15端加帽〔5端有N7甲基鳥苷酸；〔2〕3’PolyA〔聚腺苷酸化〕;內(nèi)含子剪接；甲基化帽子構(gòu)造的功能:1、mRNA穩(wěn)定性，使mRNA免遭核酸酶的攻擊。2mRNA供給信號，促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成。3RNA的合成。內(nèi)含子分類：,rRNAII：線粒體、葉綠體，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是mRNAmRNAtRNA第I轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是rRNA〔經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)酯反響：鳥核苷-OH攻擊第一個(gè)外顯子與內(nèi)含子之間的磷酸二酯鍵第一個(gè)外顯子3”-OH攻擊內(nèi)含子與其次個(gè)外顯子之間的磷酸二酯鍵兩個(gè)外顯子相連III類的內(nèi)含子的自我剪接：GU-AG規(guī)章〔套索構(gòu)造〕tRNA前體的加工：1、核酸內(nèi)切酶在tRNA兩端切斷23”端逐個(gè)切去附加的堿基33”端加上-CCA-OH4、核苷的修飾(堿基修飾：甲基化；復(fù)原反響；核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反響；脫氨反響)。第六章蛋白質(zhì)生物合成——翻譯及翻譯后過程蛋白質(zhì)生物合成的概念mRNAmRNA分子中核苷酸的排列挨次所組成的密碼信息合成蛋白質(zhì)的過程。蛋白質(zhì)生物合成體系：根本原料：20種編碼氨基酸模板：mRNAtRNA裝配機(jī)：核蛋白體放因子等能源物質(zhì)：ATP、GTP無機(jī)離子：Mg2+K+ORF)：mRNA5’-AUG端終止密碼子之間的核苷酸序列，稱為開放閱讀框架codomRNA3代表一種氨基酸(或其他信息)，這種三聯(lián)體形式的核苷酸序列稱為密碼子。遺傳密碼的性質(zhì)：方向性、連續(xù)性、簡并性、搖擺性、通用性、偏愛性搖擺性：反密碼子與密碼子之間的配對有時(shí)并不嚴(yán)格遵守常見的堿基配對規(guī)律，這種現(xiàn)象稱為搖擺配對。原核生物mRNA的特點(diǎn)〔重點(diǎn)〕12、SD序列: 起始AUG上游, -AGGA-保守序列，是核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)。3mRNA可編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，為多順反子(polycistron)。真核生物mRNA的特點(diǎn)〔重點(diǎn)〕1、轉(zhuǎn)錄和翻譯分別在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中完成。2、半衰期相對較長〔幾小時(shí)甚至幾天〕、Kozak序列：mRNA起始密碼子處的一段保守序列-CCACCAUGG-，能增加翻譯起始的效率。4、單順反子真核生物:起始氨基酰-tRNA: Met-tRNAiMet-tRNA：Met-tRNAMet原核生物：起始氨基酰-tRNA: fMet-tRNAfMet 甲酰甲硫氨酰-tRNA原核生物mRNA在核蛋白體小亞基上的準(zhǔn)確定位和結(jié)合涉及兩種機(jī)制：S-DmRNA與小亞基結(jié)合。rpS-1識別并結(jié)合。原核生物的肽鏈合成起始：分別與核蛋白體結(jié)合而形成翻譯起始復(fù)合物的過程?！睮F-〕mRNA在小亞基定位結(jié)合；起始氨基酰-tRNA的結(jié)合；(IF-1、IF-2、GTP)核蛋白體大亞基結(jié)合。：1.進(jìn)位(positioning)/注冊(registration)(EF-TuEF-Ts催化)成肽(peptidebondformation)〔肽?；D(zhuǎn)移酶〕轉(zhuǎn)位(translocation)〔轉(zhuǎn)位酶〕核蛋白體循環(huán)：肽鏈延長在核蛋白體上連續(xù)循環(huán)式進(jìn)展，又稱為核蛋白體循環(huán)。多聚核蛋白體：1條mRNA模板鏈都可附著10～100個(gè)核蛋白體，這些核蛋白mRNA與多個(gè)核蛋白體形成的聚合物稱為多聚核蛋白體。蛋白質(zhì)生物合成阻斷劑〔P205~208〕抗生素類阻斷劑〔嘌呤霉素、氯霉素、放線菌酮〕抗代謝藥物〔長春堿、三尖杉酯堿〕〔eEF-2失活-糖基化，阻斷蛋白質(zhì)合成〕干擾素 失活-磷酸化;降解病毒mRNA)的正確折疊的保守蛋白質(zhì)。分子伴侶有以下功能：①封閉待折疊蛋白質(zhì)的暴露的疏水區(qū)段；②創(chuàng)立一個(gè)隔離的環(huán)境，可以使蛋白質(zhì)的折疊互不干擾；③促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和去聚攏?！惨弧硞?cè)鏈氨基酸的微小修飾二硫鍵的形成甲基化、磷酸化及乙?；捕臣羟泻图艚蛹庸端的切除剪切信號肽的切除前體蛋白加工活性肽的剪切釋放〔三〕添加化學(xué)基團(tuán)第八章基因工程及其在醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用基因工程的根本原理〔簡答題：獵取目的基因—選擇和構(gòu)建載體—目的基因與載體的連接—重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞—重組體的篩選—克隆基因的表達(dá)限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的3種粘性末端：5’-粘性末端；3’-粘性末端；平頭末端影響限制性內(nèi)切酶活性的因素：1、DNA的純度2、DNA甲基化程度3DNA的分子構(gòu)型4、反響溫度5、反響系統(tǒng)組成：緩沖液、pH等6、酶量、反響體積、酶切時(shí)間合理使用DNA連接酶(DNAligase)：DNA5′-3′-羥基末端之DNADNA分子或片段連接。DNA連接酶的分類：(1)T4DNA連接酶DNA分子大腸桿菌DNA連接酶 只能連接粘性末端DNARNA的修飾酶：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶——同聚物加尾5’-末端的磷酸限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開嗎？DNA的特異序列〔回文序列DNA。DNADNA連接酶有何不同點(diǎn)？1、DNA連接酶：主要是連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵，起連接作用，在基因工程中起作用。2、DNADNADNA復(fù)制中起作用3DNA連接酶是將DNADNA連接酶不需要模板DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵形DNA鏈；載體必備條件：1、能自主復(fù)制；2、有多克隆位點(diǎn)MCS；3、具有遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；4、分子量小，以容納較大的外源DNA。質(zhì)粒(plasmid)：是細(xì)菌染色體外的遺傳單位，環(huán)狀雙鏈DNA分子。存在于宿主細(xì)胞內(nèi)、獨(dú)立于染色體外的、自主復(fù)制的遺傳成分?？寺≥d體(cloningvector):能使插入的外源DNA不能表達(dá)，這樣的載體為克隆載體表達(dá)載體:為使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的載體稱表達(dá)載體。LacZ’β-N端，而細(xì)菌染色體能編碼β-C端,形成α互補(bǔ)產(chǎn)生了具有活性的β-X-gal被雜合的β-半乳糖苷酶水解，形成藍(lán)色化合物，因此在平板上產(chǎn)生藍(lán)色菌落。而LacZ’序列上存在多克隆位點(diǎn)，由于目的基因的插入，破壞了LacZ’藍(lán)色化合物，所以平板上消滅白色菌落，白色菌落為陽性克隆的菌落。DNA重組:DNA分子通過共價(jià)連接〔磷酸二酯鍵〕而組合成的DNA分子的過程?！?〕克隆載體表達(dá)載體穿梭載體*原核表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)元件是：啟動子--核糖體結(jié)合位點(diǎn)--克隆位點(diǎn)--轉(zhuǎn)錄終止信號3個(gè)系統(tǒng)：DNA復(fù)制及重組體的選擇系統(tǒng)：復(fù)制子、選擇標(biāo)記外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)：啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、抑制物基因蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)：核糖體結(jié)合位點(diǎn)〔SD序列、翻譯起始密碼子、翻譯終止密碼子穿梭載體〔shuttlevector)：原核細(xì)胞復(fù)制所需的序列構(gòu)造。真核細(xì)胞表達(dá)所需的構(gòu)造元件和相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因。基因序列未知承受不同方法獵取目的基因〔簡答題基因組DNA文庫基因序列未知cDNA文庫基因序列聚合酶鏈反響基因序列化學(xué)合成法 基因組DNA文庫〔名解：基因組DNA的集合。PCR反響體系：1、模板DNA；2、dNTP；3、引物；4、TagDNA聚合酶；5、緩沖液。步驟：DNADNA與引物退火；引物延長。人工合成基因局限性：1、長度：<60bp；2、中性突變：密碼子選擇需留意；3、二級構(gòu)造和重復(fù)構(gòu)造影響拼接；4、合成費(fèi)用高。載體與目的基因的連接主要有以下5〔選擇簡答〕1、粘性末端連接2、平頭末端連接〔linker〕技術(shù)4、同源多聚尾連接法5、人工接頭〔adaptor〕技術(shù)〔選擇〕1、插入失活法〔單酶切〕2、定向克隆法〔雙酶切〕5’端脫磷法〔CIP〕基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較〔10分：基因組DNA文庫的構(gòu)建：組織或細(xì)胞染色體DNA限制性內(nèi)切酶基因片段克隆載體重組DNA分子受體菌

cDNA文庫的建立：mRNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA第一鏈復(fù)制雙鏈cDNA載體含重組分子的轉(zhuǎn)化菌〔基因文庫〕

重組DNA分子受體菌cDNA文庫1、cDNA文庫比基因組DNA文庫小得多。2、從cDNA文庫篩選基因比較簡潔。3、基因組DNA文庫：內(nèi)含子和外顯子4、cDNA文庫：只有外顯子感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)：用特別方法〔CaCL2〕處理后，受體細(xì)胞才具DNA的力量，這種細(xì)胞稱感受態(tài)細(xì)胞。重組基因?qū)朐思?xì)胞：CaCl2轉(zhuǎn)化法重組基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞的方法：1、磷酸鈣轉(zhuǎn)染；2、電穿孔；3、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染；4、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；5、顯微注射。重組體的篩選鑒定方法主要有：1、遺傳學(xué)方法2、核酸雜交法〔鑒定〕3、免疫學(xué)方法〔鑒定〕4PCR方法篩選重組子5、酶切鑒定6、DNA測序〔鑒定〕核酸分子雜交法主要包括：〔一〕菌落原位雜交〔二〕Southern印跡〔DNA〕〔三〕斑點(diǎn)印跡〔四〕Northern印跡〔RNA〕PCR的根本原理是什么?PCR擴(kuò)增某一基因，必需預(yù)先得到什么樣的信息?答：DNA半保存復(fù)制的原理，在體外進(jìn)展DNA的變性、復(fù)性和引物延長。(2)DNA序列?；虮磉_(dá)(geneexpression)生物學(xué)功能產(chǎn)物的過程。可誘導(dǎo)基因：在特定環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導(dǎo)基因。誘導(dǎo)(induction)：(induction)。這種基因是可阻遏基因。阻遏(repression)可阻遏基因表達(dá)產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏(repression)基因表達(dá)的調(diào)控方式:阻遏負(fù)調(diào)控:調(diào)控蛋白+DNA序列 基因的表達(dá)(相應(yīng)蛋白質(zhì)降低)促進(jìn)正調(diào)控:調(diào)控蛋白+DNA序列 基因的表達(dá)(相應(yīng)蛋白質(zhì)增加)順式作用元件：與相關(guān)基因處在同一個(gè)DNA分子上，起調(diào)控作用的DNADNA序列。對一個(gè)基因的表達(dá)具有調(diào)控作用的另一個(gè)基因的產(chǎn)物。乳糖操縱子色氨酸操縱子〔轉(zhuǎn)錄翻譯偶聯(lián)對基因表達(dá)的調(diào)控〕誘導(dǎo)產(chǎn)生各種熱休克蛋白，與σ32有關(guān)。沉默子(silencer)：某些基因的負(fù)性調(diào)整元件，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。真核生物的基因表達(dá)調(diào)控：一、染色體重排的調(diào)控二、染色質(zhì)水平調(diào)控〔一〕活性染色質(zhì)DNA拓?fù)錁?gòu)造變化；2.對核酸酶〔DNaseI)敏感〔二〕組蛋白的修飾乙?；揎?作用：降低核小體的穩(wěn)定性磷酸化修飾 作用：降低與DNA的親和力三、DNA水平調(diào)控〔一〕基因的喪失、擴(kuò)增與重排〔二〕DNA的甲基化和去甲基化四、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控〔一〕順式作用元件：啟動子；增加子；沉默子〔二〕反式作用因子轉(zhuǎn)錄調(diào)整因子分類〔按功能特性〕 根本轉(zhuǎn)錄因子特異轉(zhuǎn)錄因子五、翻譯水平調(diào)控〔一〕5’UTR構(gòu)造〔UTR非翻譯區(qū)〕〔帽子構(gòu)造、mRNA二級構(gòu)造、先導(dǎo)序列〕〔二〕蛋白因子磷酸化〔三〕3’UTR構(gòu)造RNA對基因表達(dá)調(diào)控〔P299〕小干擾RNA與基因沉默微小RNA與基因沉默轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)造： DNA結(jié)合域

α螺旋-β轉(zhuǎn)角-α螺旋鋅指構(gòu)造堿性亮氨酸拉鏈螺旋-環(huán)-螺旋〔填空〕 酸性激活域轉(zhuǎn)錄激活域 谷氨酰胺富活域脯氨酸富含域基因表達(dá)(geneexpression)生物學(xué)功能產(chǎn)物的過程?？烧T導(dǎo)基因：在特定環(huán)境信號刺