凝膠柱層析分離丙種球蛋白與核黃素課件

凝膠柱層析法分離丙種球蛋白與核黃素制作人：第三組陳文顧香君陳科亦戴遜桑圣月馮伊鷺

一、簡(jiǎn)介二、層析技術(shù)的原理三、層析四、實(shí)驗(yàn)器材五、實(shí)驗(yàn)步驟六、注意事項(xiàng)簡(jiǎn)介核黃素：維生素B2，又稱(chēng)核黃素，維他命B2。分子式C17H20N4O6。作為維生素B族的成員之一，核黃素水溶性較低，但在堿性溶液中容易溶解，在強(qiáng)酸溶液中穩(wěn)定，光照及紫外照射引起不可逆的分解?？扇苡诼然c溶液，維生素B2是機(jī)體中許多酶系統(tǒng)的重要輔基的組成成分，參與物質(zhì)和能量代謝。核黃素在機(jī)體中有遞氫的作用，并是機(jī)體中一些重要的氧化還原酶的輔酶。

利用混合物中各組分的物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩相(固定相、流動(dòng)相)中達(dá)到分離。溶解度分子極性分子大小分子形狀吸附能力分子親合力等層析技術(shù)的基本原理固定相流動(dòng)相物理化學(xué)性質(zhì)兩相固定相(Stationaryphase)

：是色譜的基質(zhì)，可以是固體物質(zhì)（如吸附劑、凝膠、離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些物質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附、溶解、交換等作用。流動(dòng)相(Mobilephase)

：在色譜分離過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體等。層析層析的分類(lèi)（一）按兩相所處的狀態(tài)分類(lèi)

層析氣相層析液相層析氣-固層析氣-液層析液-固層析液-液層析層析的分類(lèi)

（二）按操作方式分類(lèi)1柱層析薄層層析423紙層析12柱層析

1.吸附層析

2.分配層析

3.離子交換層析

4.親和層析

5.凝膠層析層析的分類(lèi)（三）按層析的分離機(jī)制分類(lèi)固定相（凝膠）凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致。G型（G-X:X數(shù)字代表交聯(lián)度與吸水量）LH型葡聚糖凝膠（Sephadex）聚丙稀酰胺凝膠（Polyacrylamide）瓊脂糖凝膠（Sepharose）二、凝膠層析的原理

比孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，首先流出。較小的分子則可以滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，然后再擴(kuò)散出來(lái)，經(jīng)歷的流程長(zhǎng)，流動(dòng)速度慢，后流出。分子篩效應(yīng)三、試劑、器材：

3.1層析介質(zhì)：SephadexG-50；3.2樣品（包含2個(gè)組分）：①核黃素（黃色），②丙種球蛋白，上樣量：0.5ml/柱。3.3洗脫液：0.1mol/L,Ph7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）3.4層析柱、分光光度計(jì)等。四、實(shí)驗(yàn)步驟凝膠的溶脹裝柱上樣洗脫、收集及測(cè)定四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）凝膠的準(zhǔn)備稱(chēng)取SephadexG-503g，置于錐形瓶中，加PBS約50ml，在沸水浴中加熱2h溶脹凝膠，用PBS漂洗，去除飄浮的細(xì)小顆粒，冷卻到室溫后再裝柱。3.將凝膠懸液（約40ml）沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝膠沉積2cm高時(shí)，再打開(kāi)出口，繼續(xù)加入凝膠懸液至凝膠沉積約8cm的高度即可，關(guān)閉出口（要求凝膠床無(wú)氣泡、無(wú)斷層、表面平整）。4.新柱裝好后，加3-5倍體積PBS流過(guò)柱床，然后平衡10min。（注意：始終層析柱與水平面垂直）（三）上樣1.先將柱的出口打開(kāi)，讓PBS逐漸流出，待液面與凝膠床面平齊時(shí)，關(guān)閉出口（注意：不可使凝膠柱表面干涸）。2.用刻度吸管取樣品混合液0.5ml，沿管壁小心加于柱床表面，打開(kāi)層析柱出口端，待樣品完全滲入膠內(nèi)，開(kāi)始收集流出液，同時(shí)小心加洗脫液（PBS），控制流速：1滴/5-6秒。（注意柱床上要不斷加PBS，保持1cm高水層）五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)裝柱時(shí)需保持柱體垂直于水平面，不可隨意晃動(dòng)層析柱，以保持凝膠柱表面平整。加樣時(shí)吸管伸入柱內(nèi)，接近液面處沿管壁加入，動(dòng)作要輕柔，不要將床面沖起。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需密切注意保持層析柱中的凝膠始終處于PBS中，