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文檔簡介
藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)
及過程控制中國藥品生物制品檢定所website:e-mail:mash@tel/p>
地址:北京市天壇西里2號郵編:100050
1藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制藥品因素環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗(yàn)方法驗(yàn)證過程控制2中國藥品生物制品檢定所無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷3中國藥品生物制品檢定所一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)操作環(huán)境關(guān)鍵設(shè)備對照培養(yǎng)基物質(zhì)保障5中國藥品生物制品檢定所(一)、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)潔凈實(shí)驗(yàn)條件有效性:整體10000級、局部100級。安全性:保護(hù)樣品、人員和環(huán)境??刹僮餍裕悍奖?、快捷、順暢。潔凈實(shí)驗(yàn)條件的維護(hù)、驗(yàn)證陽性菌實(shí)驗(yàn)室達(dá)到P2生物安全標(biāo)準(zhǔn)6中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)室改造示例:原布局圖
擬定布局圖
建議布局圖1
建議布局圖2
實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)——中檢所微生物實(shí)驗(yàn)室7中國藥品生物制品檢定所(一)、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的管理與維護(hù):1、屏障系統(tǒng)的有效性壓差、風(fēng)速、微粒、照度(外包服務(wù)合同)2、清潔、靜態(tài)與動態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫酒精棉球分離微生物新潔爾滅分離微生物8中國藥品生物制品檢定所(二)、操作環(huán)境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺10中國藥品生物制品檢定所搽拭實(shí)驗(yàn)菌株菌液計(jì)數(shù)回收計(jì)數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液的誤差為:5.5%表面搽拭操作的回收率大于99%12中國藥品生物制品檢定所(四)、對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性(靈敏度);培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性(標(biāo)準(zhǔn)化)。對照培養(yǎng)基理化評價(jià)(可控性)生物學(xué)評價(jià)(有效性)回收率比較MPN比較生長曲線比較生態(tài)評價(jià)某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法14中國藥品生物制品檢定所二、檢驗(yàn)程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷15中國藥品生物制品檢定所二、檢驗(yàn)程序接受任務(wù)實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備樣品核對實(shí)驗(yàn)操作過程監(jiān)控培養(yǎng)觀察有效的結(jié)果物質(zhì)保障16中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范(軟件)中檢所抗生素室微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系編寫說明及批準(zhǔn)頁1實(shí)驗(yàn)室概況1.1實(shí)驗(yàn)室簡介1.2實(shí)驗(yàn)室通訊資料1.3實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可項(xiàng)目/參數(shù)表1.4實(shí)驗(yàn)室平面圖及功能區(qū)域1.5儀器設(shè)備總覽1.6常備試劑耗材一覽表1.7實(shí)驗(yàn)室發(fā)展目標(biāo)2管理規(guī)范2.1安全管理2.2業(yè)務(wù)流程2.3人員管理(6個(gè)SOP)2.4樣品管理(3個(gè)SOP)3標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程3.1檢驗(yàn)工作SOP(13個(gè))3.2儀器操作SOP(30個(gè))3.3實(shí)驗(yàn)記錄SOP(9個(gè))4實(shí)驗(yàn)室保障4.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、設(shè)備及消耗品供應(yīng)商確定原則4.2實(shí)驗(yàn)室設(shè)施服務(wù)商4.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備供應(yīng)商4.4實(shí)驗(yàn)室消耗品供應(yīng)商17中國藥品生物制品檢定所(一)、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)堅(jiān)持“平戰(zhàn)結(jié)合”,物質(zhì)準(zhǔn)備有備無患,應(yīng)隨時(shí)保證“來之能戰(zhàn)”。尤其注意常備有效期要求的物品:培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實(shí)驗(yàn)器材等。18中國藥品生物制品檢定所(二)、樣品核對盡快取得樣品,確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性;仔細(xì)核對樣品及樣品資料,高度關(guān)注媒體公布樣品(問題樣品),同時(shí)盡量獲取非問題樣品及同類樣品,進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)、比較分析;樣品外觀檢查、完整性檢查。20中國藥品生物制品檢定所樣品外觀檢查——欣弗
樣品外觀檢查——刺五加
樣品外觀檢查——雙黃連
樣品完整性真空檢漏
21中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)操作——物料進(jìn)場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞(風(fēng)淋、紫外照射)雙層無菌包裝核心區(qū)外圍實(shí)驗(yàn)操作——人員進(jìn)場一更二更核心操作區(qū)實(shí)驗(yàn)操作——無菌操作技術(shù)23中國藥品生物制品檢定所(四)、實(shí)驗(yàn)過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控?zé)o菌檢驗(yàn)框架示意圖24中國藥品生物制品檢定所三、結(jié)果判斷
是不是微生物?是什么微生物?微生物來自哪里?幾點(diǎn)思考
參見:《FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗(yàn)潔凈室環(huán)境菌的相似性考察》《藥學(xué)學(xué)報(bào)》,2007,42(11):1189~1194《判斷無菌檢查陽性結(jié)果有效性的實(shí)驗(yàn)探討》《藥物分析雜志》,2008,28(05):66~71
26中國藥品生物制品檢定所1、長菌與否?渾不渾濁?物理變化、化學(xué)變化還是生物變化?一靠經(jīng)驗(yàn)二靠實(shí)驗(yàn)三靠嚴(yán)格程序控制避免干擾27中國藥品生物制品檢定所是不是微生物?(1)、液體培養(yǎng)基渾濁物理變化?化學(xué)變化?生物學(xué)變化?(2)、平板上的菌落瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層
菌落or藥渣?28中國藥品生物制品檢定所2、分離鑒定(1)立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng);(2)取5支凍存管,每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物,-80℃保存;(3)取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線,分離污染微生物;(4)如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁,還應(yīng)增加血平板劃線,并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應(yīng)進(jìn)一步鑒定,并逐一保藏。30中國藥品生物制品檢定所是什么微生物?宏觀:生長形態(tài)微觀:鏡檢鑒定:生化鑒定(API、BD)核酸鑒定(16sRNA、DNA)……31中國藥品生物制品檢定所3、溯源調(diào)查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株檢驗(yàn)過程監(jiān)控菌株環(huán)境菌(近期、遠(yuǎn)期)現(xiàn)場調(diào)查收集菌株鑒定與相似性分析相結(jié)合傳統(tǒng)方法與新技術(shù)相結(jié)合不同方法的交叉驗(yàn)證32中國藥品生物制品檢定所微生物來自哪里?
相似性分析同源性分析脈沖場電泳(PFGE)、傅立葉紅外(FTIR)
33中國藥品生物制品檢定所SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms圖不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關(guān)系34中國藥品生物制品檢定所TheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells35中國藥品生物制品檢定所36中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件
圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢37中國藥品生物制品檢定所編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁,產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種(Klebsiellapneumoniaessppneumoniae);2、粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)0206G渾濁,劇烈產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種(Klebsiellapneumoniaessppneumoniae);2、粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)0112G致密片狀、絮狀物,振搖不散G+長鏈桿菌(液體培養(yǎng)物直接涂片)0104L顆粒狀懸浮物,振搖能散G+長鏈桿菌(液體培養(yǎng)物直接涂片)298L;298G渾濁,產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種(Klebsiellapneumoniaessppneumoniae);2、粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)303L;303G渾濁,產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種(Klebsiellapneumoniaessppneumoniae);2、陰溝腸桿菌(Enterobacter
cloacae)305L;305G渾濁,產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種(Klebsiellapneumoniaessppneumoniae);2、粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)306L;306G渾濁,產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種(Klebsiellapneumoniaessppneumoniae)307G渾濁,產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種(Klebsiellapneumoniaessppneumoniae)308L渾濁(Alcaligenesfaecalis)308G致密片狀、絮狀物,振搖不散G+長鏈桿菌(液體培養(yǎng)物直接涂片)309L渾濁(Alcaligenesfaecalis)309G致密片狀、絮狀物,振搖不散G+長鏈桿菌(液體培養(yǎng)物直接涂片)304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)38中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種(Staphylococcus
capitissspcapitis)溶血葡萄球菌(Staphylococcus
haemolyticus)緩癥鏈球菌(Streptococcus
mitis)科氏葡萄球菌科氏亞種(Staphylococcus
cohniissp
cohnii)藤黃微球菌(Micrococcus
luteus)溶血葡萄球菌(Staphylococcus
haemolyticus)。監(jiān)測到的環(huán)境菌株39中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例2編號BD鑒定走廊1B.pumilus走廊2M.luteus走廊3/無菌室4C.urealyticum無菌室5K.kristinae無菌室6C.urealyticumC1524-FS.capraeC1524-BS.capraeC1525-B1-1S.warneriC1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidisC1526-F2S.haemolyticus菌株16sRNA鑒定可信度C1524-FS.haemolyticus99%C1524-BS.haemolyticus98%C1526-F2S.haemolyticus100%雙黃連注射液利巴韋林注射液FTIR相似性分析DuPontRiboPrinter基因指紋分析40中國藥品生物制品檢定所幾點(diǎn)思考(1)、怎樣才算是同一株菌?
需要深入認(rèn)識微生物本身微生物變異與保守的相對性;分析方法的可變性與微生物本身的可變性;生物學(xué)先鋒琳恩·馬古利斯(LynnMargulis)曾表示:“如果將一個(gè)特殊的質(zhì)粒植入大腸桿菌,大腸桿菌便會突然間變成克雷伯氏桿菌”。41中國藥品生物制品檢定所幾點(diǎn)思考(2)、什么是最適宜的技術(shù)?
需要深入認(rèn)識分析微生物的技術(shù)和手段形態(tài)學(xué)分析與相似性分析(生化反應(yīng)譜、片段相似性、FTIR光譜相似性等),在權(quán)衡方法本身的邊界和微生物變異性邊界的基礎(chǔ)上,似乎更適合對親緣關(guān)系
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