1.2.2 微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)人教版（）高中生物選擇性必修3知識28

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1.2.2微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)

高壓蒸汽滅菌

液體培養(yǎng)基

微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)

1、實驗室培養(yǎng)微生物條件

1）提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件

—培養(yǎng)基

2）確保其它微生物無法混入

—無菌技術(shù)

高壓蒸汽滅菌

溫故知新：

2、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成:

碳源、氮源、水、無機(jī)鹽等

1）碳源：

無機(jī)碳源：

CO2、CO32-、HCO3-

有機(jī)碳源：

葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等

自養(yǎng)微生物

異養(yǎng)微生物

2）氮源：

無機(jī)氮源：

NH4＋、NO3-、NH3等

有機(jī)氮源：

牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等

注：含C、H、O、N的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源

3）無機(jī)鹽：

Ca、K、Mg為大量元素

Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素

類型

適用范圍

操作方法

消

毒

滅

菌

較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）

強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）

煮沸消毒法

日常生活

100℃煮沸5～6min

巴氏消毒法

不耐高溫的液體

62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min

化學(xué)藥劑

生物活體、水源等

擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源

紫外線

紫外線照射30min

灼燒滅菌

接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等

直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒

干熱滅菌

耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等

物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h

濕熱滅菌

培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等,生產(chǎn)和實驗室常用

高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100kPa,溫度121℃,15～30min

無菌的方法：

接種室、接種箱，超凈工作臺

課題背景

自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當(dāng)要分離的微生物在混合菌群中不是優(yōu)勢種群時，更難實現(xiàn)。

稀釋涂布平板法呈現(xiàn)的雜菌群

那么我們又如何達(dá)成這一目標(biāo)呢？

科學(xué)家們應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基解決了這一難題。

二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)

（一）選擇培養(yǎng)基

美國黃石國家公園的一個熱泉

1973年，科學(xué)家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進(jìn)而提取出耐高溫的DNA聚合酶。

為什么水生棲熱菌能從熱泉中篩選出來呢？

實驗室微生物的篩選時，可人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。

在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。

因為水生棲熱菌能在70-80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。

培養(yǎng)基中加氨芐青霉素

具有氨芐青霉素抗性的菌落

沒有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌

培養(yǎng)基應(yīng)有菌落

沒有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌被淘汰

怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌?

舉例1

加入青霉素：

不加氮源：

不加含碳有機(jī)物：

——分離出酵母菌、霉菌等真菌

(青霉素能殺死細(xì)菌、放線菌)

——分離出固氮菌

——分離出自養(yǎng)型微生物

補(bǔ)充資料1-幾種選擇培養(yǎng)基舉例

那么如果讓你分離土壤中分解尿素的細(xì)菌，你應(yīng)該怎么設(shè)計呢？

思考-討論

選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計

尿素的立體結(jié)構(gòu)

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素被土壤中某些細(xì)菌分解成NH3,再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。

這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因為能合成脲酶，來催化尿素分解。

討論：

1、你如何設(shè)計培養(yǎng)基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素

的細(xì)菌分離出來？

2、該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點和不同點？

培養(yǎng)基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。

牛肉膏

5.0g

蛋白胨

10.0g

NaCl

5.0g

瓊脂

20.0g

蒸餾水

定容到1000ml

KH2PO4

1.4g

NaH2PO4

2.1g

MgSO4·7H2O

0.2g

葡萄糖

10.0g

尿素CO(NH2)2

1.0g

瓊脂

15.0g

蒸餾水

定容到1000ml

配方一：培養(yǎng)細(xì)菌

配方二：培養(yǎng)可以分解尿素的細(xì)菌

補(bǔ)充資料2-普通培養(yǎng)基與選擇培養(yǎng)基的比較

1、從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從用途上屬于哪類培養(yǎng)基？

固體培養(yǎng)基

配方二是以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基

2、此培養(yǎng)基中共有哪些成分？在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？

碳源：配方二氮源：

成分：

碳源、氮源、水、無機(jī)鹽

（二）微生物的選擇培養(yǎng)

如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌，還需對土壤菌液進(jìn)行稀釋及科學(xué)的微生物數(shù)量測定方法稀釋涂布平板法。

2、實驗的具體操作：

2）土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。

取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌

1）制備培養(yǎng)基：

制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基

1、稀釋涂布平板法

是將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。

6支試管，分別加入9ml無菌水

1ml

102

1ml

103

1ml

104

1ml

105

1ml

106

1ml

107

3）樣品梯度稀釋：

微量移液器

稀釋10倍菌液

101

土壤10g

在火焰旁稱取土壤10g，加入90ml無菌水中，搖勻，制成稀釋10倍的土壤菌液。

分別取1ml上清液，加入盛有9ml無菌水的試管中，制成不同稀釋倍數(shù)的菌液。

取6支試管，分別加入9ml無菌水。

1、將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中

滴

2、取少量稀釋液（不超過0.1ml），滴加到培養(yǎng)基表面

灼

3、將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8-10s。

涂

4、用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻

各梯度分別涂布3個平板

1個不涂布作空白對照

浸

4）取樣涂布平板：

放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)1～2d

5）培養(yǎng)與觀察

稀釋103倍

稀釋104倍

稀釋105倍

空白對照

恒溫培養(yǎng)箱

（三）微生物的數(shù)量測定

稀釋涂布平板法除用于分離微生物外，也常用于統(tǒng)計樣品中活菌數(shù)。在稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基上表面生長的一個單菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，可推測出樣品中大約有多少活菌。

1、原理：

2、計數(shù)原則：

一般選擇菌落數(shù)在30—300的平板上進(jìn)行計數(shù)。

注意事項

①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30—300的平板上進(jìn)行計數(shù)。

②為增強(qiáng)實驗說服力與準(zhǔn)確性，設(shè)計實驗時，需要涂布至少三個平板作為重復(fù)組。

③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。

④分析實驗結(jié)果時，要考慮重復(fù)組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作

有誤，需重新實驗。

實例分析1：

甲同學(xué)做此實驗在稀釋倍數(shù)105獲得3個平板，菌落數(shù)分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細(xì)菌數(shù)目？

3、計算：

每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M

其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。

（80+90+100）/3

0.1

×105=9×107個

兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋

倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。

1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。

2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、

212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。

你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？

甲：沒有重復(fù)實驗（至少涂布3個平板）

乙：其中一個平板計數(shù)結(jié)果與其他兩個相差太大，操作過程可能出現(xiàn)了錯誤。

實例分析2：

1、顯微鏡直接計數(shù)：

這種方法是利用特定細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量

每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)

缺點：

不能區(qū)分死菌與活菌

不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)

（比例計數(shù)法）

待測樣品

等量的已知含量的紅細(xì)胞

混勻

涂抹

測定：

紅細(xì)胞數(shù)目

細(xì)菌數(shù)目

計算單位體積內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目

將含已知數(shù)目的紅細(xì)胞液體與待測的菌液按1：1均勻混合，在顯微鏡下數(shù)出各自的數(shù)目，然后求菌液中的細(xì)胞數(shù)目。

細(xì)菌

紅細(xì)胞

2、顯微鏡直接計數(shù)是測定微生物的方法。

舉例：已知紅細(xì)胞濃度為M個/mL，從體積為NmL的大腸桿菌培養(yǎng)液中取出大腸桿菌液與紅細(xì)胞液等量均勻混合后，涂片，染色，鏡檢。在同一視野中發(fā)出有紅細(xì)胞W個，大腸桿菌Y個，求NmL大腸桿培養(yǎng)液中大腸桿菌的個數(shù)X是多少？

X＝N×

M×Y

W

(個)

觀察到的紅細(xì)胞平均數(shù)/觀察到的細(xì)菌平均數(shù)＝紅細(xì)胞含量/細(xì)菌含量

公式

思考-討論

土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)

尿素的立體結(jié)構(gòu)

課題目的

1、從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌

2、統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌

研究思路

土壤取樣

制備培養(yǎng)基

樣品稀釋與取樣涂布

微生物的培養(yǎng)與觀察

1、土壤取樣

1）取樣的位置：

土壤含有大量的微生物，，是微生物的天然培養(yǎng)基。細(xì)菌適宜在酸堿度接近

中性的潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)的細(xì)菌分布距地表3?8cm的土壤層。

2）取樣要求：先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。

2、制備培養(yǎng)基

制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。

3、樣品的稀釋

測土壤中細(xì)菌數(shù)量，一般選用1x104、1x105和1x106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。

4、微生物的培養(yǎng)與觀察

30-370C溫度下培養(yǎng)1-2d，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)。

3、操作提示

2）無菌操作

3）做好

本實驗使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前要做好

4）制定計劃

對于耗時較長的生物實驗，要事先規(guī)劃時間，以便提高工作

效率，在操作時更加有條不紊

1）不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。

a、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。

b、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入

錐形瓶中，塞好棉塞。

c、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。

結(jié)果分析與評價

1、結(jié)合對照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。

2、你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)目在30-300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數(shù)接近？