鎳酶介紹課件

第九章鎳酶第一節(jié)概述第二節(jié)尿素酶及其模擬第三節(jié)氫化酶及其模擬第四節(jié)一氧化碳脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶第五節(jié)超氧化物岐化酶第六節(jié)甲基輔酶M還原酶第一節(jié)鎳及其鎳酶的概述鎳Nickel原子序數：28，位于過渡系的中央，主要穩(wěn)定氧化數+2,能和許多生物學上感興趣的物質相結合、螯合或鍵合形成配位數為4、5、6的配合物。地殼中的豐度為0.018%,排在21位。土壤中含量約在40mg/kg，海水中含量3納克/L。物種mg/g(干重）物種mg/g(干重）萵苣3.5±2.9歐芹2.7±1.7合葉子草1.9±1.3玉米1.1±0.5洋白菜1.2±0.8甜菜類1.5±0.6一些植物中的鎳含量Ni的概述

在化學化工領域，鎳具有獨特的催化氧化還原作用，在生物體內，鎳存在于多種氫化酶中，催化氫的氧化還原反應，另一方面，鎳是多種酶的激活源，參與多種酶蛋白的合成。

1855年，Forehhammer首次在植物中找到鎳。1925年Berg、Bertrand和Macheboeuf發(fā)現動物體內含鎳。人們很早就猜測鎳是動物(包括人)所必需的微量元素，但由于早期研究對飲食中金屬量的控制技術不完善，結果不可靠，因而未得到肯定的結論;隨著分析技術的發(fā)展，到1974年已基本證明了鎳的必需性。

吸煙與肺癌

在香煙中含有49種微量元素，其中含量較高，危險最大的是鎳和鎘。煙中的鎳能與煙霧中的一氧化碳結合成為強致癌性的羰基鎳。同時，煙中鎳及其氧化物對肺和呼吸道有刺激和損害作用，它們顯然與肺癌，喉癌、舌癌和鼻咽癌等有密切的關系。許多國家的肺癌死亡率正在迅速上升。根據近20個國家的資料證明，吸煙是明顯引起肺癌的一個重要原因。

鎳與鼻咽癌

鼻咽癌在我國南方人群中發(fā)病率較高。廣東省是世界上突出的鼻咽癌高發(fā)中心。而廣東的鼻咽癌死亡率的分布有非常明顯的地區(qū)性。廣東省地質礦產局研究了地質地理環(huán)境中微量元素與鼻咽癌死亡率分布的關系，發(fā)現在鼻咽癌高發(fā)區(qū)的河水中的鎳含量比相對低發(fā)區(qū)高，鎳含量與鼻咽癌死亡率呈正相關。

鎳可能是白血病致病因素之一!!!

急性和慢性白血病患者血清鎳含量均明顯高于健康人。急性白血病初期便有血清鎳明顯升高，隨著病情進展而持續(xù)增高，當病情緩解時則明顯降低。血清鎳含量與慢性白血病的病情變化始終呈正相關。急性白血病血清鎳升高比慢性白血病更明顯，且血清鎳含量過高的患者生存時間較短，提示鎳可能是急性白血病的促發(fā)因素。血清鎳測定可作為急性白血病病因診斷輔助指標并可作為病情嚴重程度及預后判斷指標。鎳在動物體內的主要作用

鎳的生物功能主要是參與代謝及細胞膜的結構。鎳具有刺激生血機能的作用，能促進紅細胞的再生，也發(fā)現鎳對凝血過程中易變因子的穩(wěn)定性也有一定的作用。已經發(fā)現，鎳大量存在于DNA和RNA中，其作用可能是通過與DNA中的磷酸酯結合，使DNA結構處于穩(wěn)定狀態(tài)，影響DAN的合成，RNA的復制及其它蛋白質的合成。鎳在植物中的主要作用

鎳最明確的生物功能是在脲酶中的作用。脲酶存在于許多植物、藻類、真菌及細菌中。脲酶種類繁多，都含有鎳，但含鎳的數量互相有差異。Ni的生物功能早在1975年就引起了人們的廣泛關注，因為當時發(fā)現尿素酶的活性中心含有Ni，自然界選擇鎳作為酶的活性中心非常令人驚奇，因為Zn是比Ni更能好的Lewis酸，而Fe和Cu的單電子氧化還原在生物學中也極為普遍。在大氣中O2變得豐富以前，許多過渡金屬都以硫化物的形式存在，而在這些過渡金屬硫化物中NiS更可溶，這也許是自然界選擇鎳作為酶的活性中心的原因之一。1926年就結晶分離出尿素酶，但50年之后人們才通過分光技術測得酶活性中心二價Ni的存在。此后又有一系列含鎳的酶被發(fā)現，下面僅簡要介紹幾種常見的鎳酶：①尿素酶;②氫化酶;③一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合成酶;④甲基輔酶M還原酶;⑤鎳超氧化歧化酶Activesiteofurease

Ni2:

Ni-Ni(3.5?);Ni1:2His,1Lys(bridge);Ni2:2His,1Lys(bridge),1Asp;

1995，Unclear

1999，rightStructure，1999,7:205–216Bacilluspasteuriiureaseisatrimeroftrimers

Hydrolysismechanismofurea乙酰氧肟酸乙酰氧肟酸

脲酶抑制劑

脲酶抑制劑是指能夠直接或間接抑制脲酶活性的一類物質，大體上可分為天然和人工合成兩大類，目前使用較多的屬人工合成的有機化合物。常用的有乙酰氧肟酸（AcetohydroxamicacidAHA）和辛酰氧肟酸（CaprylohydroxamicacidCHA），其中AHA是目前認為最有效的一種脲酶抑制劑，國內外已有工業(yè)化合成AHA的成熟技術，我國已批準AHA作為飼料添加劑使用。在目前家畜的營養(yǎng)中，蛋白質是最短缺的營養(yǎng)物質。由于反芻動物能利用非蛋白氮（NPN）合成微生物蛋白（MCP）供機體利用，因此尿素可用作反芻動物的蛋白質資源。但尿素在瘤胃內的分解速度很快，極大地限制了反芻動物對其的利用，為提高尿素等NPN的利用率，國內外學者做了大量工作。通過使用脲酶抑制劑，延緩尿素的釋放，提高其利用率以充分利用氮源。為什么使用脲酶抑制劑？第一，添加尿素可代替部分價格較貴的餅粕類蛋白質飼料，節(jié)約了蛋白質飼料，降低飼料成本。脲酶抑制劑的使用可提高尿素的利用率。第二，即使日糧中不含尿素，使用脲酶抑制劑，同樣具有增加微生物蛋白質合成量，節(jié)約蛋白質飼料的效果。這是因為約80％的蛋白質在瘤胃內降解成氨，同樣也受脲酶催化，而瘤胃微生物利用氨的速度相對較慢，導致兩種速度不協(xié)調而使大量氨不能被微生物利用造成氮源浪費。第三，在農業(yè)生產中，脲酶抑制劑的使用同樣可提高植物對尿素的利用率。脲酶抑制劑的種類及其抑制機理1.1氧肟酸類化合物1.2二胺、三胺類化合物1.3重金屬類1.4絲蘭提取物1.5醌類化合物1.6異位酸類化合物1.7多聚甲醛大體分為兩個途徑：一是使脲酶結構發(fā)生變化，而使脲酶變性失活，此類抑制劑包括重金屬鹽類和多聚甲醛；二是與脲酶的活性中心相結合，使之失活，從而達到控制氨氣釋放的作用。尿酶的模擬尿素酶的模型化合物已有不少報道，雖然從羧酸根橋連雙核鎳結構特征來看與活性中心的結構相似，但在生物催化功能方面仍有很大差距，這方面的工作仍有很大空間。兩個尿素酶模擬物的結構：[Ni2(OAc)2(tmen)2](OTf)[Ni2(Hshi)(H2shi)(Py4)(OAc)]第三節(jié)氫化酶(hydrogenase)1931年，Stephenson和Stickland首先發(fā)現了氫化酶。它們廣泛存在于原核生物及低等真核生物體內。其催化作用是可逆分裂和重組氫分子。氫化酶自20世紀70年代以來就引起科學家的高度重視。酶的模擬工作寄希望于得到燃料細胞（電池），或利用類似的功能模型化合物通過光的作用產生氫能源。因此對這類酶活性中心結構和催化機理方面的研究一開始就引起廣泛關注。各種氫化酶在它們的蛋白結構和所利用的電子載體的種類（如鐵氧化還原蛋白，紅素氧化蛋白和奎寧等）上有著很大的差異。目前發(fā)現的氫化酶有：NiFeSe，NiFe，FeonlyandMetalfree其中對鎳鐵氫化酶研究的最為深入。鎳鐵氫化酶

四類氫化酶中NiFe氫化酶的研究最為廣泛和深入。迄今為止其活性中心結構已基本弄清楚，對其催化機理也提出很多合理方案，但還有待進一步確證。在化學模擬方面，雖做了大量研究，也取得了很多成果，但要達到利用類似結構的功能模擬配合物通過光作用產生氫能源H2的目的，還有很長的路要走。這一節(jié)將主要介紹國際上對NiFe氫化酶的活性中心結構、催化機理及化學模擬研究的一些成果。CoordinationChemistryReviews249(2005)1609

鎳鐵氫化酶為異二聚酶，兩個亞基緊密相連形成一個近乎球星的分子。較大的亞基含有兩個Cys-X-X-Cys氨基酸序列，一個在N端附近，另一個在C端附近,都含有Cys并與活性中心成鍵;而較小的亞基是鐵蛋白類物質，含有幾種在排列上非常適合構成Fe/S簇的半胱氨酸殘基序列。小亞基有三個不同的類型的Fe/S簇，它們呈線性排列，相距1.2nm，遠端為Fe4S4簇，中間為Fe3S4簇，近端為Fe4S4簇，距鎳中心1.3nm。Fe/S簇和活性中心的位置顯示在活性中心和小亞基表面有一個易于電子運輸的通道。NiFe活性中心在大亞基上，也含有鐵離子簇。Ni-Fe相距0.29nm,兩個Cys通過硫橋連兩個金屬。另外，O2

或H2O所提供的氧原子作為橋連配體的可能性也是存在的。Nickel-ironhydrogenasestructure

[Fe4S4]dist=bottom,[Fe3S4]=middle,[Fe4S4]prox=top,Ni-Fecentre=toprightX=SorO;Y=OorNSpeciesNiterminalligandsNi-FebridgingligandsFeterminalligandsDesulfovibriogigasS

(Cys-65,Cys-530)S

(Cys-68,Cys-533);O;(Hˉ)CO,CNˉ,·NO,N2orCCHˉDesulfovibriovulgarisMiyazakiS

(Cys-81,Cys-546)S

(Cys-84,Cys-549);SorO;(Hˉ)L1=SO;L2,L3=COorCNˉSchematicshowingthereactionofhydrogenandoxygenwithinahydrogenasemolecule.Thestudyofgaspathwaysinproteinscouldbeimportantforfutureapplicationsinareassuchasrenewableenergysources,butitiscurrentlynotwellunderstoodandrequirestheanalysisoflargenumbersofproteins.Howarethereadyandunreadystatesofnickel-ironhydrogenaseactivatedbyH2?Phys.Chem.Chem.Phys.,2006,

8,4086-4094

FeFe

hydrogenase

SynthesisoftheH-clusterframeworkofiron-onlyhydrogenase,Nature,2005,433,610

第四節(jié)一氧化碳脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶

一氧化碳脫氫酶(CODH)實際上有兩種類型：一種含有一氧化碳脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶(ACS)兩種亞基，雖然兩個亞基可以分開，但分開的ACS亞基不具有活性；另一種只含有CODH亞基。一氧化碳脫氫酶催化CO的雙電子氧化還原反應：

CO+H2OCO2+2H++2e

對于這種酶的，Ni不是必需的。需氧微生物使用一種含有Mo,Fe和黃素的酶在呼吸時氧化CO，而厭氧微生物則利用含有Ni和Fe/S簇的酶去氧化CO。產乙酸菌利用CO和一種提供甲基的化合物(CH3CoFeSP)及輔酶A去合成乙酰輔酶A。

CH3-CoFeSP+CO+CoAacetyl-CoA+CoFeSP

需氧細菌中的一氧化碳脫氫酶是一類含鉬（Mo）金屬蛋白，需氧細菌利用它們在呼吸作用中氧化一氧化碳來獲得能量。而在厭氧微生物，包括厭氧細菌和古菌中，其屬于含鎳（Ni）金屬蛋白，在不同種屬的微生物中發(fā)揮著不同的作用。特別在厭氧微生物固定一氧化碳和二氧化碳的Wood-Ljungdahl代謝途徑中，一氧化碳脫氫酶可以與乙酰輔酶A合成酶（同為鎳蛋白）結合形成雙功能酶，共同發(fā)揮作用，將一氧化碳和二氧化碳轉化為重要的代謝中間物乙酰輔酶A。

由于一氧化碳脫氫酶能夠高效地催化對動物和人體有很高毒性的一氧化碳氧化為二氧化碳，因此對于其催化機理的研究有助于治理環(huán)境中的一氧化碳污染。

Ni-CODH廣泛存在于以一氧化碳為碳源和能源的厭氧微生物中，如乙酸生成細菌（acetogenicbacteria）、光養(yǎng)細菌（phototrophicbacteria）、氫氣生成細菌（hydrogenogenicbacteria）、硫酸還原細菌和古菌（sulfate-reducingbacteriaandarchaea）以及甲烷生成古菌（methangenicarchaea）。

不同來源的Ni-CODH差別很大：既有單功能的一氧化碳脫氫酶只負責催化CO的氧化；又有雙功能酶，即同時具有一氧化碳脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶（ACS）的活性，生理狀態(tài)下需要Ni-CODH與ACS結合共同發(fā)揮功能。因此，又常常以CODH/ACS復合物的名稱來代替Ni-CODH。與Mo-CODH相似的是，CODH/ACS也需要形成二聚體來發(fā)揮催化作用。

從熱醋酸棱菌中提純得到的一氧化碳脫氫酶研究得較為清楚，它包括有6個鎳離子，三個鋅離子、32～40個鐵和硫化物硫原子。一氧化碳脫氫酶是從甲烷菌和醋酸菌中兩個碳碎片合成乙酰輔酶A的關鍵催化劑，這種酶也是醋酸營養(yǎng)細胞中醋酸酯碎片降解作用過程的中心，這一過程到CH4和CO2終止。ACSisolatedfromM.thermoaceticaisa310kDa*α2β2tetramer(itismadeoffourstrandsofprotein:twoidenticalstrandscalled'alpha'andtwocalled'beta').

Eachαβdimercontainsthreemetal-sulfurclusterscalledA,B,andC.

TheA-clusterislocatedinthe81kDaαsubunitwhiletheB-andC-clustersarefoundinthe71kDaβsubunit.一氧化碳脫氫酶(CODH)一氧化碳脫氫酶的晶體結構分析表明，它是有兩個完全相同的相互纏繞的亞基共價連接而成。每個亞單位都含有Ni,Fe和S組成的雜金屬簇(C簇)，整個酶分子呈蘑菇狀。在C簇中，一個鎳原子，四個鐵原子和五個易變的硫原子排列為不對稱的[Ni-4Fe-5S]簇。C簇中的金屬離子與五個半胱氨酸殘(Cys295,Cys333,Cys446,Cys476,Cys526)和一個組氨酸殘基(His261)通過共價鍵相連。所有的鐵原子都與硫原子形成四面體配位方式，鎳與四個硫原子配位通過μ2-S和μ3-S與鐵橋連。鎳中心為畸變平面四方形配位方式。第五節(jié)鎳超氧化物歧化酶Ni-SOD主要從各種細菌中分離得到。Ni-SOD與其他SOD的主要區(qū)別在于氨基酸組成上的不同。它除了含有大量的甘氨酸外，半胱氨酸殘基也有所不同。

Ni是催化超氧化物歧化反應的中心，如果將Ni從酶中除去，酶蛋白只剩下了殘基活性。NiSOD的晶體結構已經報道。其中6個螺旋束以頭尾-頭尾的形式