蛋白質(zhì)的定性定量分析

關(guān)于蛋白質(zhì)的定性定量分析第1頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六

蛋白質(zhì)定性分析

(qualitativeanalysis)

確定樣品中是否有蛋白質(zhì)存在，以及存在的是何種蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)定量分析

(quantitativeanalysis)

確定樣品中總蛋白含量，或者某種單一蛋白成分的含量第2頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六

蛋白質(zhì)含量的測定方法（重點(diǎn)掌握）

蛋白質(zhì)相對分子量測定(SDS)

等電聚焦電泳(IEF)（一般了解）

蛋白質(zhì)的免疫印跡分析

(westernblot)第3頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六第一章蛋白質(zhì)的含量測定蛋白質(zhì)的含量測定基于蛋白質(zhì)的元素組成特點(diǎn)基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)基于蛋白質(zhì)的光吸收特性第4頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六

蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％

由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%第5頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六一、紫外光譜(A280)吸收法

這一方法可用來快速檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)成分。通常用于柱層析過程中檢測蛋白質(zhì)的洗脫峰第6頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六原理

色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近

大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收第7頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六優(yōu)點(diǎn)

快速缺點(diǎn)

核酸可引起強(qiáng)干擾作用芳香族氨基酸含量差異可以起誤差

對蛋白質(zhì)無破壞性

不是嚴(yán)格的定量，適用于測定蛋白質(zhì)粗提液第8頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六計算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事項(xiàng)

石英比色杯

調(diào)零所用溶液

配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶液

光密度范圍第9頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六二、考馬斯亮藍(lán)G-250檢測法

這是一種迅速、可靠的通過染色法測定溶液中蛋白質(zhì)含量的方法第10頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六原理

該法是基于考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。藍(lán)色復(fù)合物在595mn波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測595mn的光吸收值大小計算蛋白的含量第11頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六所需時間10min優(yōu)點(diǎn)

快速（反應(yīng)時間僅需2min）

敏感，幾乎沒有蛋白質(zhì)損失缺點(diǎn)

用這種測定方法對蛋白質(zhì)引起不可逆的變性

對各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不同第12頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六計算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法注意事項(xiàng)

反應(yīng)10～15min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀

若選用目的蛋白來做標(biāo)準(zhǔn)曲線或用另一種方法來校正，所測蛋白濃度較準(zhǔn)確第13頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六三、Lowry檢測法

這一標(biāo)準(zhǔn)、快速的蛋白質(zhì)定量檢測方法已得到廣泛應(yīng)用.第14頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六原理

首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計算蛋白質(zhì)的含量第15頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六優(yōu)點(diǎn)

一種可靠的蛋白質(zhì)定量方法

不同蛋白質(zhì)之間差別很小缺點(diǎn)

某些試劑不穩(wěn)定

干擾物質(zhì)多

使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性第16頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六計算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法注意事項(xiàng)

在加入試劑30min后呈色達(dá)到飽和，時間延長顏色信號減弱

許多干擾物質(zhì)降低顏色反應(yīng)

高鹽濃度可引起沉淀第17頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六四、BCA(二喹啉甲酸)檢測法

這是近年來新研制的一種改進(jìn)的Lowry測定法第18頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六原理

在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡(luò)合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計算蛋白質(zhì)的含量第19頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六優(yōu)點(diǎn)

檢測敏感性高缺點(diǎn)

蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性

終產(chǎn)物穩(wěn)定巰基試劑和去垢劑干擾第20頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六第二節(jié)蛋白質(zhì)相對分子量測定分子量測定(molecularweight,MW)排阻層析沉降平衡超速離心動態(tài)彈性光散射孔徑梯度電泳質(zhì)譜(ESI-MS)第21頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六一、SDS測定蛋白質(zhì)的相對分子量1.不連續(xù)系統(tǒng)原理2.SDS凝膠的制備制備分離膠制備濃縮膠加樣裝板電泳卸板并進(jìn)行凝膠染色第22頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六3.SDS基本原理SDS

影響遷移率的因素

十二烷基硫酸鈉

(SodiumDodecylSulfate)

十二烷基磺酸鈉

(SodiumDodecylSulfonate)

第23頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六SDS作用：與蛋白牢固結(jié)合，當(dāng)其濃度大于1mmol/L時，SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合比例為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)，由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電荷，使得樣品中各種蛋白質(zhì)與SDS形成的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)分子間天然的電荷差異第24頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同(雪茄煙形的長橢圓棒狀的復(fù)合物)，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SDS中，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子量有關(guān)，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對數(shù)線性關(guān)系WatchSDS原理第25頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六4.SDS測定分子量的操作

標(biāo)準(zhǔn)品的選擇及處理

待測樣品的制備

電泳分離及染色

相對遷移率的計算WatchSDS操作第26頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六AnalysisforSDSelectrophoresis第27頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六5.注意事項(xiàng)

選擇合適的膠濃度

樣品中高濃度的陽離子可能會導(dǎo)致SDS的沉淀，應(yīng)在加入樣品緩沖液之前將其除去SDS與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合程度

蛋白質(zhì)的分子量范圍15～200KD之間

二硫鍵是否完全被還原

溶液中SDS的濃度

溶液的離子強(qiáng)度第28頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六

多亞基蛋白質(zhì)分子量檢測

用其它方法測定分子量進(jìn)行參照SDS和巰基乙醇SDS測定的準(zhǔn)確性

電荷異常或構(gòu)象異常

帶有較大輔基的蛋白質(zhì)

某些結(jié)構(gòu)蛋白第29頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六二、凝膠過濾層析測定蛋白質(zhì)的相對分子量1.基本原理2.凝膠過濾測定分子量的操作

分子篩效應(yīng)

洗脫體積與相應(yīng)分子量的關(guān)系裝柱平衡加樣平衡洗脫收集樣品并計算Ve繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線第30頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六第31頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六3.注意事項(xiàng)

柱床表面不能干燥

凝膠的選擇Sephadex溶脹G值的意義

凝膠柱的再生與保存第32頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六第三節(jié)

等電聚焦電泳測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)第33頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)兩性電解質(zhì)性質(zhì)支持介質(zhì)(supportingmedia)FigureofIEF第34頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10IsoelectricFocusing第35頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六ReadyStripTMIPGStrips3–104–73–65–87–103–10NL3.9–5.14.7–5.9High-puritymonomersNarrowrangesforresolutionoflow-abundanceproteinsOverlappinggradientsfor“cybergels”Threelengths7cm,11cmand17cm0.5mmx3.3mm第36頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六BroadRangepH3-10NarrowRangepH4-7MicroRange31044774.75.94.75.9第37頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六注意事項(xiàng)

兩性電解質(zhì)的選擇

電極緩沖液

對樣品的要求

樣品必須無鹽

加樣的量要適當(dāng)

加樣方法

加樣位置第38頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六第四節(jié)

蛋白質(zhì)的免疫印跡分析第39頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六

印跡技術(shù)(blotting)是指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）于或直接放在固定化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)

1975年，EdwenSouthern提出了分子印跡(漬)的概念目前這種技術(shù)已被廣泛用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)的檢測第40頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用

DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析

RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析

蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究由于蛋白質(zhì)常用抗體來檢測，因此也被稱為免疫印跡技術(shù)(immunoblotting)第41頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六一、免疫印跡分析的應(yīng)用對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析對蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分析信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析生物大分子相互作用分析第42頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六將蛋白質(zhì)固定在膜上的其他應(yīng)用

結(jié)構(gòu)域分析斑點(diǎn)印跡抗體純化為制備抗體時獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原蛋白質(zhì)鑒定：氨基酸組成分析和序列分析第43頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六二、免疫印跡分析的基本流程

電泳分離蛋白

轉(zhuǎn)移至固相膜

封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)

與第一抗體溫育反應(yīng)

與第二抗體交聯(lián)物溫育反應(yīng)

顯色制備蛋白樣品蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移抗體檢測第44頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六免疫印跡操作流程圖第45頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六1.樣品的制備

組織或細(xì)胞中提取

裂解

去污劑(SDS、TritonX-100、NP-40、Tween-20)

蛋白酶抑制劑(PMSF、EDTA、Pepstatin、

Leupeptin、Aprotinin)

蛋白質(zhì)的定量(Bradford、BCA、Lowry)

基因工程表達(dá)重組產(chǎn)物第46頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六2.電泳分離

SDS

非變性PAGEEIF第47頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六3.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移方法：半干法、濕法

作用：將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上

注意：在疊放硝酸纖維素膜、聚丙烯酰胺凝膠時，膜與膠之間要緊密貼在一起，中間不能有任何氣泡！？第48頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六常用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移膜種類微孔大小結(jié)合能力特點(diǎn)NC膜0.45um80-100ug/cm2應(yīng)用廣泛<20kD易丟失PVDF膜0.22um0.45um80-100ug/cm2170-200ug/cm2<20kD不易丟失容量大、強(qiáng)度高尼龍膜480ug/cm2用于核酸第49頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六電轉(zhuǎn)移裝置第50頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六電轉(zhuǎn)移示意圖第51頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六電轉(zhuǎn)移裝置第52頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六4.靶蛋白的免疫學(xué)檢測

封閉

—對轉(zhuǎn)移膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉，防止抗體非特異性結(jié)合在膜上，降低背景顏色BSA、脫脂奶粉第53頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六第54頁，共59頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)46分，星期六

靶蛋白與第