蛋白質化學中的層析技術

關于蛋白質化學中的層析技術第1頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

層析法也稱色譜法(chromatography)，是1906年俄國植物學家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”。

1941年，英國生物學家Martin和Synge首先提出了色譜塔板理論，為后來各種色譜技術的發(fā)展奠定了基礎。第2頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第一節(jié)層析概述第二節(jié)離子交換層析第三節(jié)親和層析第四節(jié)凝膠過濾第五節(jié)疏水層析第六節(jié)分配層析第七節(jié)吸附層析第3頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第一節(jié)層析概述

第4頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六一、層析的原理

層析技術是一組相關分離方法的總稱，當待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組份的理化性質存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同，而且隨流動相向前移動，各組份不斷地在兩相中進行再分配，從而達到將各組份分離的目的。第5頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

第6頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六二、層析的分類

按固定相基質的形式：柱層析、紙層析和薄層層析第7頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

根據(jù)流動相的形式：液相層析、氣相層析

第8頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

凝膠過濾原理吸附層析疏水層析分配層析親和層析離子交換第9頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六三、層析前蛋白質處理

主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質，但分辨率低。第10頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、鹽析法

鹽離子與水分子作用，原來溶液中大部分的自由水轉變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質極性基團與水分子之間的作用，破壞蛋白質分子表面的水化層，暴露出來的蛋白質表面疏水性區(qū)域相互結合，形成沉淀。

第11頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、等電點沉淀

在溶液pH值等于蛋白質等電點時，蛋白質的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入鹽離子會破壞這些吸引力，使分子散開，溶入水中。第12頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、有機溶劑沉淀

降低水溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質不同電荷之間的靜電引力，使蛋白質產生沉淀；有機溶劑與水作用使蛋白質的表面水化層厚度壓縮，導致蛋白質脫水，蛋白質間的疏水作用增強，從而產生沉淀。第13頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六四、層析基本操作過程

裝置選擇上樣和洗脫結果檢測

上樣均一性洗脫裝置目的不同檢測方法不同活性檢測基質均勻性柱層析的L/d比值第14頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、柱層析的L/d比值

第15頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、洗脫裝置

不改變溶劑體系依靠液面的水位差產生的靜壓力致使洗脫液不斷流經層析柱缺點：隨著溶液的流去，水位差也逐漸減小，流速也在變小。改善：蠕動泵或恒流泵維持流速恒定的簡易裝置第16頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

改變溶劑系統(tǒng)

分級洗脫在一個溶劑系統(tǒng)洗滌后，改用另一溶劑系統(tǒng)。缺點：蛋白質和層析基質的結合強度相差并不很大，溶劑系統(tǒng)的改變又不可能過細過密同一個洗脫級分中就可能含有兩種或兩種以上的蛋白質，達不到分離純化的目的。遞減遞增pH陰離子交換樹脂陽離子交換樹脂離子強度疏水層析離子交換層析第17頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

改變溶劑系統(tǒng)

梯度洗脫

一種溶液以恒定的速度連續(xù)地進入處于溫和攪拌的盛有另一種溶液的容器中，經混合后的液體以同速度沉入層析柱作為洗脫液，在這樣所得到的洗脫液中一種溶液的濃度以線性梯度方式連續(xù)地發(fā)生改變。注意：梯度洗脫呈現(xiàn)一個峰，但有可能存在兩個性質接近的蛋白質。線性梯度洗脫裝置性能未知樣品的蛋白質分離：改變緩慢的梯度洗脫→若為單峰：分級洗脫第18頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、結果檢測活性檢測

比活沒有提高

目的蛋白與雜蛋白并沒有分開比活有所提高，但總活性回收很低

目的蛋白有損失或有失活現(xiàn)象測定蛋白質一級結構時，可不考慮目的蛋白的生物活性第19頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六結果保存薄層層析&紙層析照相保存or掃描儀轉為圖形or積分儀變成數(shù)據(jù)柱層析檢測器、記錄儀和積分儀處理第20頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六4、層析裝置的儀器化HPLC與微機、質譜等連用第21頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第二節(jié)離子交換層析

第22頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六一、原理

離子交換層析技術是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質等樣品為移動相，分離和提純蛋白質、核酸、酶、激素和多糖等的一項技術。

原理：利用物質的電荷和層析載體的電荷間的相互作用，進而達到分離純化的目的。第23頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

高分子聚合物基質、配基和平衡離子↙共價結合平衡離子平衡離子是結合于配基上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團發(fā)生可逆的交換反應。陽離子交換劑：平衡離子帶正電的離子交換劑，能與帶正電的離子基團發(fā)生交換作用陰離子交換劑：平衡離子帶負電的離子交換劑，與帶負電的離子基團發(fā)生交換作用

第24頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六pH值的影響

NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydrogengainedHydrogenlost第25頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六離子溶度影響

→離子濃度增加第26頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

+第27頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六離子取代順序第28頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六離子交換劑的基質

瓊脂糖離子交換劑

離子交換交聯(lián)葡聚糖聚苯乙烯離子交換纖維素第29頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

1、離子交換纖維素交換劑名

稱（纖維素）作用基團特

點陰離子交換劑二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基AE+-O-C2H4-NH2胍乙基強堿性、極高pH仍有效陽離子交換劑羧甲基CM—-O-CH2-COO—最常用在pH4以上磷酸P－-O-PO2－

用于低pH磺甲基SM－-O-CH2-SO3－磺乙基SE－-O-C2H4-SO3－強酸性用于極低pH第30頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

常用：DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）

CM-纖維素（羧甲基纖維素）開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結構，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多。親水性，對蛋白質等生物大分子物質吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質的變性和失活。

回收率高優(yōu)點：第31頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

2、交聯(lián)葡聚糖類

型性

能離子基因反離子總交換容量（毫克當量/g）DEAE-sephadexA-25弱堿性、陰離子交換劑DEAE+Cl—3.5±0.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱堿性、陰離子交換劑QAE+Cl—3.0±0.4QAE-sephadexA-50CM-A-sephadex25弱堿性、陽離子交換劑CM—Na+4.5±0.5CM-sephadexA-50SP-sephadexA-25強堿性、陽離子交換劑SP—Na+2.3±0.3SP-sephadexA-50第32頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

優(yōu)點：不會引起被分離物質的變性或失活非特異性吸附少交換容量大

離子交換葡聚糖的選用：

一般根據(jù)蛋白質的分子量而定中等分子量（30000-200000）一般選A50和C50低分子量（＜30000）和高分子量（＞200000）均宜選用A25和C25。第33頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、瓊脂糖離子交換劑

交換劑名

稱特點陰離子交換劑DEE-SepharouseCL-6B弱堿性pH:2-14DEAE-SepharouseFastFLowQ-SepharouseFF陽離子交換劑CM-SepharouseCL-6B弱酸性pH:2-14第34頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六優(yōu)點：對pH及溫度的變化均較穩(wěn)定，可在pH3～10和0～70℃范圍內使用改變離子強度或pH時，床體積變化不大流速快，分辨率高特別適用于相對分子質量大的蛋白質和核酸等化合物的分離。

第35頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六4、聚苯乙烯陰離子交換劑

AmberliteIRA&Dowexleg.Dowexl×4-100陽離子交換劑

AmberliteIRC&Dowex50強陰離子交換劑交聯(lián)度為4%顆粒度為50-100目第36頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六5、其他聚乙烯醇

DEAE-Toyopearl&CM-Toyopearl

富羥基

高親水性兼性離子交換劑基質上連有β-丙氨酸、對氨基苯磺酸、精氨酸等偶極離子

or凝膠網(wǎng)孔中包含陰、陽離子的磷脂的脂質體

第37頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六三、離子交換介質的配基提供了可交換的離子，是由帶電荷的官能團組成通過或長或短的碳氫鏈經醚鍵結合到聚合物骨架上，相應的分別得到了陽離子和陰離子交換劑第38頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

配基結構pK分類簡稱硫酸基(sulphate)-OSO3H<2強酸S磺酸基(sulphonate)-(CH2)nSO3H<2強酸SM(n=1)，SE(n=2)，SP(n=3)，SB(n=4)磷酸基(phosphate)-OPO3H2<2和6中等酸性P羧酸基(carboxylate)-(CH2)nCOOH3.5-4.2弱酸CM(n=1)叔胺基(tertiaryamine)2(CH2)nN+H(C2H5)28.15-9.15弱堿DEAE(n=2)季胺基(quaternaryamine)2(CH2)n-2N+≡(R)3>9強堿Q，QAE第39頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

pK值決定了相應的離子交換劑的pH工作范圍密度在配基密度達到一個極限值之前，蛋白質的吸附容量和保留值隨著配基密度的增加而明顯增加；過了極限值，蛋白質的吸附容量和保留值隨配基密度的增加基本上沒有影響。第40頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六種類一般對同類型的離子交換劑來說，強陽(陰)離子交換劑比弱陽(陰)離子交換劑對蛋白質的結合能力強，需較強的鹽濃度進行洗脫，相對的選擇性較高

第41頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六四、基本操作

緩沖液的選擇層析柱的選擇

洗脫流速↓↙加樣洗脫洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定離子交換劑的清洗、再生和保存

↓↓↓←離子交換劑的處理

↘↑離子交換劑的選擇

第42頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、離子交換劑的選擇配基的選擇取決于被分離的物質在其穩(wěn)定的pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑；如帶負電，則選擇陰離子交換劑。一般分離蛋白質等大分子物質常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。第43頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

基質的選擇價格分辨率和穩(wěn)定性特點纖維素離子交換劑較低較低適于初步分離和大量制備葡聚糖離子交換劑適中適中受外界影響較大，體積可能隨離子強度和pH變化有較大改變，影響分辨率瓊脂糖離子交換劑較貴較高第44頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

顆粒大小

分辨率平衡時間流速應用小顆粒高長慢分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離大顆粒低短快需要高分辨率的分析或分離第45頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、離子交換劑的處理酸堿浸泡進一步去除雜質，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子，一般陽離子交換劑最后用堿NaOH處理，陰離子交換劑最后用酸HCl處理。

膨化將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的配基充分暴露出來。水懸浮去除雜質和細小顆粒第46頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、緩沖液的選擇保證各個待分離物質的穩(wěn)定；使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結合，而盡量使雜質不與離子交換劑結合或結合不穩(wěn)定；注意平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結合力強的離子，否則會大大降低交換容量，影響分離效果。離子強度和pH第47頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六4、層析柱的選擇親和力相差不多而需要交換劑的體積較大增加柱長為宜，使待分離的組分被洗脫后再結合于交換劑上的概率增加，柱的直徑與高度的比以1：20左右為宜。第48頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六采用離子強度較大的梯度洗脫選用粗而短的柱子為宜。因為當柱上洗脫液的離子強度高到足以完全取代被吸附的離子時，這些被置換的離子則以同洗脫液等速率從柱上向下移動，如果柱細長，即從脫附到流出之間的距離長，使脫附的離子擴散的機會增加，結果造成分離峰過寬，降低分辨率。用交聯(lián)葡聚糖離子交換劑和纖維素離子交換劑時，常用的柱高為15～20cm。第49頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六5、上樣樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。不溶物應在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。

第50頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第八次課第51頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六6、洗脫改變溶液的pH或改變離子強度當使用陰離子交換劑時，增加鹽離子濃度，則降低pH值。當使用陽離子交換劑時，增加鹽離子濃度，則升高pH值

親和洗脫目的蛋白與加入離子發(fā)生特異性相互作用而被置換添加置換劑能置換基質上所有蛋白質洗脫方法階段洗脫和梯度洗脫

第52頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六7、洗脫速度洗脫速度通常要保持恒定洗脫速度慢比快的分辨率好如果洗脫峰相對集中某個區(qū)域造成重疊，則應適當縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當提高洗脫速度。第53頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六8、洗脫液的監(jiān)測收集及組分鑒定監(jiān)測

用紫外檢測儀進行，在280nm處觀察洗脫液的光吸收收集

用分布收集器收集，可以自動收集，也可以手動收集鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳、測定活性等第54頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六9、離子交換劑的清洗、再生和保存

可溶于堿的污染物

0.1mol/LNaOH洗滌Milli-Q純化的蒸餾水洗滌

結合緩沖液洗滌可以除去諸如脂類、蛋白質和核酸這類的污染物。對于疏水性污染物乙醇溶液（如70%的乙醇）或非離子型的去污劑洗滌可以除去脂類和其他的疏水性物質?！?5頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六金屬污染物

EDTA飽和的10mmol/LHCL（即pH=2）處理柱子沉淀物雜質

去污劑、尿素和鹽酸胍，可將柱子在6mol/L

的尿素中平衡和溫育，然后用去離子水和緩沖液洗滌。第56頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

再生

對使用過的離子交換劑進行處理，使其恢復原來性狀的過程。酸堿交替浸泡保存處理洗凈蛋白等雜質后，加入適當?shù)姆栏瘎?，一般加?.02%的疊氮鈉，4°C下保存。第57頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六五、應用實例陰離子交換層析

從人血漿中分離得到血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG)

25mmol／L的乙酸鈉緩沖液充分透析血漿

用乙酸將血漿的pH調至5.2

，除去沉淀

上陰離子交換柱

pH5.2的乙酸緩沖液洗脫等電點較高的IgG

pH為4.5的同樣濃度的同一緩沖液，以階段洗脫的方式得到HSA

降低pH至4.0，同時升高緩沖液的濃度至150mmol/L，洗脫得到其他的糖蛋白↓↓↓↓↓第58頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

用DEAE-SepharoseCL-6B柱大量分級人血漿蛋白

第59頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

陽離子交換層析用CM纖維素分離雞蛋清中的蛋白質組份第60頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

表雞蛋清中一些蛋白質用CM纖維素分離結果的分析級分中的蛋白質pI洗脫緩沖液的pH洗脫峰pH產量（mg）活性回收（%）A．擬卵粘蛋白3.9-4.34.34.342.287B．擬卵粘蛋白3.9-4.34.44.40.9C．卵蛋白A14.584.554.5173.889D．卵蛋白A24.654.754.6537.2E．卵蛋白A34.755.04.8511.0F．“球蛋白”5.55.23.6G．卵轉鐵蛋白6.5-6.86.05.842.587H．卵轉鐵蛋白6.5-6.86.76.116.1I．“球蛋白”8.58.07.5J．“球蛋白”9.59.32.4K．“球蛋白”10.09.41.1L．抗生物素蛋白>1010.09.50.939M．“球蛋白”10.09.91.2N．溶菌酶10.010.02.192第61頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第三節(jié)親和層析

第62頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六一、原理親和力生物分子間存在很多特異性的相互作用，如抗原－抗體、酶－底物或抑制劑、激素－受體等，它們之間都能夠專一而可逆的結合。分離原理通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。第63頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六重組蛋白

用基因工程的方法引入特殊結合位點（如金屬結合位點），將其加在重組目的蛋白的氨基端或羧基端。緊鄰結合位點的位置加入蛋白酶切割位點，以便在用親和層析純化之后，將多余的蛋白質片段去掉。第64頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

第65頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六二、親和層析用基質具有較好的物理化學穩(wěn)定性能夠和配體穩(wěn)定的結合結構為均勻的多孔網(wǎng)狀結構與樣品中的各個組分均沒有明顯的非特異性吸附

第66頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、各類基質優(yōu)缺點優(yōu)點缺點纖維素價格低、活性基團較多非特異性吸附強、穩(wěn)定性和均一性較差交聯(lián)葡聚糖穩(wěn)定性較好孔徑較小、穩(wěn)定性不好聚丙烯酰胺同上同上瓊脂糖非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當、宜于活化多孔玻璃機械強度好，化學穩(wěn)定性好活性基團較少、對蛋白質有較強的吸附作用

第67頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、基質的活化溴化氰活化環(huán)氧乙烷基活化

指通過對基質進行一定的化學處理，使基質表面上的一些化學基團轉變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結合的活性基團。第68頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六溴化氰活化

生成亞胺碳酸活性基團，它可以和伯氨(NH2)反應，主要生成異脲衍生物缺點：

非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。與配體結合不夠穩(wěn)定溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，操作不便。

第69頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六環(huán)氧乙烷基活化

活化后的基質都含有環(huán)氧乙烷基，可以結合含有伯氨基(NH2)、羥基(OH)和硫醇基(SH)等基團的配體第70頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六優(yōu)點

不引入電荷基團，與配體形成的N－C、O－C和S－C

鍵都很穩(wěn)定，使用壽命長

缺點與配體偶聯(lián)時需要堿性條件，溫度為20~40℃，對于一些比較敏感的配體可能不適用第71頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六多種商品化的活化基質

第72頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六三、配體與待分離的物質有適當?shù)挠H和力與待分離的物質之間的親和力要有較強的特異性與基質穩(wěn)定的共價結合自身應具有較好的穩(wěn)定性第73頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六配體的分類特異性配體只與單一或很少種類的蛋白質等生物大分子結合的配體

eg.抗原和抗體、酶和它的抑制劑

通用性配體特異性不是很強，能和某一類的蛋白質等生物大分子結合的配體

eg.凝集素可以結合各種糖蛋白

第74頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六配體待純化的蛋白質配體待純化的蛋白質抗原特定單克隆抗體或多克隆抗體肝素凝聚因子、脂酶、結締組織蛋白酶、DNA聚合酶單克隆抗體特定抗原膽固醇膽固醇受體、膽固醇結合蛋白蛋白質A/蛋白質G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸結合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶核苷酸核苷酸結合蛋白、需核苷酸的酶磷酸磷酸酶苯基硼酸鹽糖蛋白三嗪染料脫氫酶、激酶、聚合酶、限制酶、干擾素凝集素糖蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶蛋白質親和層析中的合適配體第75頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六四、基本操作選擇適當?shù)呐潴w將配體固定化到基質上將目的蛋白混合液加樣到基質上除去非特異性結合的蛋白質洗脫純的目的蛋白第76頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第77頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、上樣層析柱較短，通常10cm左右樣品液的濃度不宜過高上樣時流速比較慢樣品緩沖液中有一定的的離子強度上樣時選擇適當較低的溫度第78頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、洗脫特異性洗脫指利用洗脫液中的物質與待分離物質或與配體的親和特性而將待分離物質從親和吸附劑上洗脫下來。

非特異性洗脫指通過改變洗脫緩沖液pH、離子強度、溫度等條件，降低待分離物質與配體的親和力而將待分離物質洗脫下來。

第79頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六特異性洗脫

第80頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

優(yōu)點：

特異性強，可以進一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率?？杀苊獾鞍踪|變性缺點：較常的時間、較大的洗脫條件。改善方法：選擇親和力強的物質洗脫、加大洗脫液濃度

特異性洗脫第81頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六非特異性洗脫與配體親和力較小

連續(xù)大體積平衡緩沖液沖洗，不影響活性，但洗脫體積較大，待分離物質濃度較低。配體結合較強時

適當?shù)膒H、離子強度洗脫，注意盡量不影響待分離物質的活性與配體結合非常牢固時

使用較強的酸、堿或在洗脫液中加入脲、胍等變性劑，使蛋白質等待分離物質變性，洗脫后再復性第82頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、吸附劑的再生和保存

再生

用大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡嚴重的不可逆吸附時，使用高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑或加入適當?shù)姆菍Ｒ恍缘鞍酌副４?/p>

加入0.01%的疊氮化鈉，4°C

下保存第83頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六五、親和層析用于蛋白質分離的實例

免疫親和層析凝集素和糖蛋白親和層析含有輔酶的酶類的親和層析酶和蛋白類型抑制劑的親和層析肝素為配體的親和層析染料配體親和層析金屬螯合層析第84頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、免疫親和層析

小鼠血清不同亞型IgG

的分離1m1的A蛋白SepharoseCL-4B柱用1.5mol/L的甘氨酸-NaOH，pH8.9的緩沖液(內含3mol／LNaCl)平衡

5m1小鼠血清同等體積的平衡液稀釋后上柱

洗去不吸附的蛋白質

用不同pH的0.1mol/L檸檬酸洗脫

↓↓↓第85頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

第86頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、凝集素和糖蛋白的親和層析分離

凝集素是在自然界廣泛存在的一大類糖結合蛋白。它們具有不同的糖結合專一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖鏈結構的糖蛋白，可以有效地分離純化不同型的凝集素，也可應用固定化的凝集素分離純化各種糖蛋白。第87頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六用10mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.0，含0.15mol/LNaCl)平衡酸處理的Sepharose6B(AT-6B)

天花粉的丙酮粉制劑用平衡液抽提后，上AT-6B柱洗去不吸附的雜蛋白

用0.2mol/L的半乳糖溶液洗脫花粉凝集素↓↓↓ⅰ.用含有半乳糖的天然多糖-瓊脂糖的交聯(lián)產物分離天花粉凝集素第88頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

第89頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六ⅱ.糖蛋白親和層析

不同的糖蛋白具有不同的單相組分和糖鏈結構，它們和不同的凝集素呈現(xiàn)出不同的結合能力。常用的凝集素：

ConA、LCA

對甘露糖專一

WGA對N-乙酰氨基葡萄糖專一第90頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六人血色素結合蛋白(hemopexin)的分離

用50mmol/L的磷酸緩沖液，pH7.0(含0.2mol/LNaCl)平衡固定化的WGA柱離子交換層析得到含有血色素結合蛋白和轉鐵蛋白的級分上柱平衡液洗脫不結合在柱上的轉鐵蛋白含有100mg／m1N-乙酰氨基葡萄糖的平衡液洗脫血色素結合蛋白↘↙↓↓回收率達91％

第91頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六豬淋巴細胞質膜糖蛋白的分離1％的脫氧膽酸鈉增溶膜蛋白

上固定化的LCA柱(1cm×8cm)

用1％的脫氧膽酸鈉洗滌親和柱，除去雜蛋白用含2％α-甲基甘露糖苷的1％的脫氧膽酸鈉洗脫膜糖蛋白↓↓↓第92頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、含有輔酶的酶類的親和層析

很多的酶中都含有不同類型的輔酶，最為常見的是氧化還原酶和脫氫酶含有NAD。為此用固定化的NAD可以分離不同類型的氧還酶和脫氫酶，或激酶

↓↓↓固定化NAD柱

第93頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六4、酶和蛋白類型抑制劑的親和層析

一些酶及其抑制劑間存在著非常專一的相互作用。一些酶的抑制劑被固定化以后，就可用于一些酶的分離純化。一些固定化的酶也被應用于蛋白類型的抑制劑的分離。為了避免位阻現(xiàn)象，在酶類的小分子抑制劑固定化時，常要插入一些不同長度的“手臂”，如插入8-9個原子第94頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六胰蛋白酶抑制劑的分離純化

部分純化的牛卵巢胰蛋白酶抑制劑溶于2mlpH4.0的乙酸緩沖液

流經用同一緩沖液平衡的固定化胰蛋白酶柱

平衡液可洗去雜蛋白

用0.1mol／L的HCl，pH約1.2的溶液(內含0.5mol／LNaCl和10mmol/LCaCl2)洗脫胰蛋白酶抑制劑

↓↓↓第95頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六大腸桿菌EcoPl的分離

將大腸桿菌抽提液經monoQ柱和固定化的肝素柱純化至80%純度上用特定序列(AGACC)的寡脫氧核苷酸和溴化氰活化的交聯(lián)瓊脂糖偶聯(lián)成的親和層析柱用10體積平衡液(10mmol/LTris-HCl，pH7.6，0.3mol/LNaCl，lmmol／LEDTA)充分洗滌用2體積的lmol/LKCl解析吸在親和柱上的EcoP1↓↓↓第96頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六5、肝素為配體的親和層析

肝素是蛋白聚糖中的一種，可以和許多類型的蛋白質結合。第97頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六6、染料配體的層析

染料樹脂不專一的親和介質優(yōu)點穩(wěn)定、和許多類型的酶結合，但又不被酶所作用、價格低廉

eg.Cibacron藍F3GA第98頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六酵母中含有NAD酶的分離

面包酵母抽提液加入硫酸銨至75％飽和度，離心后，取220mg沉淀溶于10m1起始緩沖液流經用起始緩沖液平衡的藍色交聯(lián)瓊脂搪凝膠CL-4B柱

pH8.6的緩沖液中加入10mmol/L的NAD+洗脫甘油醛-3-磷酸脫氫酶在起始緩沖液中加入5mmol/LNAD+洗脫醇脫氫酶在起始緩沖液中加入20mmolNADP+洗脫葡萄糖-6-磷酸脫氫酶洗脫液的pH升至8.6時，解析己激酶↓↓↓↓↓第99頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六堿性磷酸單酯酶的分離

小牛小腸粘膜抽提液用DEAE離子交換纖維素除去部分雜蛋白酶活性的級分再上平衡的活性染料艷藍K-GRS和交聯(lián)瓊脂糖4B偶聯(lián)的染料層析柱平衡液洗除雜蛋白含有0.1mol/L磷酸鹽的緩沖液可洗脫堿性磷酸單酯酶再吸附在活性染料Procion紅HE-33與交聯(lián)葡聚糖凝膠G-100偶聯(lián)的基質柱上用含有0.1mol/L磷酸鹽的緩沖液對緩沖液梯度洗脫，酶活性出現(xiàn)在5mmol/L磷酸鹽濃度時↓↓↓↓↓回收率62％回收率96％

第100頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六7、金屬螯合層析

基于蛋白質的組氨酸咪唑基和半胱氨酸巰基能與銅、鋅、鎳離子間形成穩(wěn)定的螯合物而進行分離的。第101頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六人銅鋅超氧化物歧化酶的分離

酶純化34倍，活力回收92％酶純化2000倍，活力回收約58％人紅細胞濃縮裂解液上DEAE-CL-交聯(lián)瓊脂糖凝膠-6B柱

純化的酶液流經固定化的亞氨基二乙酸柱

用20mmol/L乙酸緩沖液，pH5.0洗滌層析柱

用同樣濃度和同樣pH的檸檬酸緩沖液洗脫人銅鋅超氧化物歧化酶

↓↓↓第102頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六人血漿中α2巨球蛋白(α2M)

的純化

人血漿經硫酸銨分級后，取40％-55％的級分過Zn配位的固定化亞氨基二乙酸柱洗脫不吸附的蛋白質用20mmol/L磷酸緩沖液，150mmol／LNaCl,pH5.0溶液洗脫α2M↓↓↓第103頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第四節(jié)凝膠過濾第104頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據(jù)是多孔的載體對不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同，從而對混合物進行分離。第105頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六優(yōu)點：凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，溫度范圍廣，不需要有機溶劑，分離效果好缺點：樣品被不斷稀釋，上樣量不能太大，否則分辨率變差第106頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六一、原理

凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結構的物質，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，小分子可以進入凝膠網(wǎng)孔，而大分子則排阻于顆粒之外。第107頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六大分子物質沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先被洗出層析柱小分子物質可通過凝膠網(wǎng)孔進入顆粒內部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，最后被洗出層析柱第108頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第109頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、體積參數(shù)

分子在柱中移動的速度取決于該分子在固定相和流動相間的分配系數(shù)Kd，Kd表示某一分子在特定的凝膠柱內的洗脫行為。Kd＝(Ve一Vo)／ViVe洗脫體積Vo外水體積Vi內水體積第110頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第111頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六Ve=Vo該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，因而洗脫速度最快。即該成分的Kd＝0。Vi＝Ve-Vo該成分不被排阻而可完成進入凝膠顆粒內部,

因而洗脫速度最慢。即該成分的Kd=l。Kd值介于0-l之間，物質的洗脫速度隨其Kd值的增加而降低一般物質的Kd值是0<Kd<l。

洗脫行為可以有三種可能的情況:第112頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

凝膠Kd＝0Kd=l0<Kd<l第113頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、影響分離效果的因素流速加樣體積樣品濃度離子強度第114頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六①流速

影響洗脫液流速的因素洗脫液加在柱上的壓力

為保持層析過程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。凝膠交聯(lián)度凝膠顆粒大小

第115頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六流速過低樣品橫向擴散增大，峰變寬，分辨率降低，洗脫時間長流速過高

洗脫峰重疊，柱壓增大，分離效果變差線性流速控制在2～10cm/h第116頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六②加樣體積體積過大

平臺洗脫峰或相鄰峰重疊體積過小目的蛋白收集量少、稀釋倍數(shù)大、濃度低第117頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六③樣品濃度進樣前，樣品應高度濃縮，濃度為10～20mg/ml分組分離&脫鹽除雜適當提高樣品濃度分級分離&分析性實驗濃度低第118頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六④離子強度可防止蛋白質與蛋白質之間或與凝膠介質之間的相互作用常用鹽溶液：

20-100mmol/LNaCl濃度過高引起凝膠柱床體積變化第119頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六二、凝膠過濾層析的介質

葡聚糖系列瓊脂糖系列聚丙烯酰胺系列多孔硅膠第120頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、葡聚糖系列以微生物產生的葡聚糖Dextran為原料用環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑，在堿性條件下交聯(lián)而成商品的凝膠，稱為Sephadex先制成丙烯基的衍生物，然后再用N，N’-甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)，得到商品化的凝膠，被稱為Sephacryl第121頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第122頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第123頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、瓊脂糖系列

較常用的是Pharmacia和BioRad兩家的產品，前者生產的稱為Sepharose，后者的產品為BioGelA。BioGelA系列的產品有不同的顆粒度，有粗、中和細三檔，它們的顆粒度分別為l50μm～300μm，80μm～150μm和40μm～80μm。

第124頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第125頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、聚丙烯酰胺系列

由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺混合物聚合得到的多孔性物質。產物也是固體粉末，用前先溶漲。第126頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第127頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六4、多孔硅膠優(yōu)點：

物理化學穩(wěn)定性高，耐熱耐壓，使用壽命長缺點：

柱效較低、表面具有離子性，對蛋白質有吸附性、不能在強堿性環(huán)境中使用

剛性親水性填料，具有一定直徑的多孔網(wǎng)狀結構的球狀顆粒第128頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六三、基本操作

凝膠的選擇凝膠柱的制備上樣洗脫凝膠柱的重復使用與保存第129頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、凝膠的選擇

分組分離

根據(jù)樣品中的大分子和小分子分配系數(shù)上的顯著差異，將其分開?？蛇x用SephadexG-25和G-50

小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。第130頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六分級分離

將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離。選用分級范圍較窄的凝膠，且中間值接近于目的蛋白的分子量第131頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

顆粒大小的影響優(yōu)點缺點小顆粒分離效果好流速慢分離時間長大顆粒流速快區(qū)帶擴散洗脫峰平而寬第132頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、凝膠柱的制備

用于分組分離

短而粗L/D值＜10

用于分級分離

L/D值比較大對很難分離的組分一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1～5cm范圍內，小于1cm產生管壁效應，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴重。柱L/D值的選擇第133頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六裝柱前，凝膠基質用蒸餾水或洗脫液中充分溶脹。凝膠柱填裝后通常可以采用一種有色的物質，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，以檢測凝膠柱的均勻程度。第134頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、上樣粘度因素粘度過大，分子因運動受限制，影響進出凝膠孔隙，洗脫峰形寬而矮，有些可分離的組分因此重疊。分級分離

加樣體積約為凝膠柱床體積的1％～5％左右分組分離

加樣體積約為凝膠柱床體積的10％～25％

第135頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六4、洗脫水

分離不帶電荷的中性物質電解質溶液（酸、堿、鹽的溶液）

分離帶電基團的樣品水與有機溶劑的混合液（水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮）

用于吸附較強的組分洗脫液第136頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六5、凝膠柱的重復使用與保存當樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可以加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存液相中保存：于凝膠懸液中加入防腐劑或高壓滅菌后

4℃保存。在半收縮狀態(tài)下保存：60%-70%酒精液洗沖，凝膠體積縮小干燥狀態(tài)保存：長期不用，水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇第137頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六四、凝膠層析的應用

脫鹽分離提純測定高分子物質的分子量高分子溶液的濃縮蛋白質復性研究第138頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、脫鹽高分子溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。優(yōu)點：操作簡便、快速、蛋白質和酶類等不易變性適用的凝膠：

SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6第139頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡上樣用同樣緩沖液洗脫收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類蛋白質不會因為脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上

第140頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、分離提純凝膠過濾的載體可以根據(jù)它們的孔徑分為很多種不同的規(guī)格。每種規(guī)格都有其特定的分級的范圍，一旦超出分組范圍，不論是其上限還是下限，即使分子量有大有小，但載體的排阻情況基本相同，就不能分離。在凝膠過濾層析時，要根據(jù)所要純化的樣品的分子量選擇所用的凝膠過濾的基質。第141頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六天花粉毒蛋白的凝膠過濾分離交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50柱(1.8cm×100cm)用50mmol/LTris-HCl,pH7.8緩沖液平衡天花粉硫酸銨糊(90％飽和度的沉淀)溶于2m1平衡緩沖液中上樣洗脫天花粉毒蛋白除去不溶物↓↘↘↓第142頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

第143頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、測定高分子物質的分子量測大于所用載體上限分子的洗脫體積測小于下限的分子的洗脫體積標定凝膠過濾柱的Vo標定凝膠過濾柱的Vi測定一系列已知分子量的標淮樣品在柱上的洗脫體積Ve以(Ve-Vi)／(Vo-Vi)和1ogMw

作圖測得了待測分子量的樣品的Ve由(Ve-Vi)／(Vo-Vi)從標準曲線上可以求得未知樣品的分子量藍色葡聚糖氨基酸、有色鹽類↓↓↓↓↓↘↙以標準樣品的分子量的1ogMw對Ve作圖or第144頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

洗脫液中蛋白質濃度第145頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第146頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六4、高分子溶液的濃縮將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外離心或過濾，去除溶脹的凝膠濃縮的高分子溶液↓第147頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六5、蛋白質復性研究變性蛋白加入凝膠柱高濃度變性劑存在，蛋白呈無規(guī)則卷曲變性蛋白體積大，只能進入顆粒間隙，遷移速度快變性劑分子量小，進入顆粒內部，遷移速度慢緩沖液洗脫蛋白變性劑濃度降低，轉成復性緩沖液變性蛋白復性，以天然形態(tài)洗脫出柱↓↓↓↓↓↓第148頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第九次課第149頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第五節(jié)疏水層析第150頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六一、原理

疏水作用層析（HIC）是根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。

疏水性弱的物質，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當離子強度降低時，疏水性強的物質才隨后被洗脫下來。

第151頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

WatermoleculesSoluteSurfaceexposedhydrophobicgroupsLigandWatermoleculesinbulk第152頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六二、疏水配基

烷基鏈配基芳基配基

高分子配基

第153頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

柱：HiPrep16/10

樣品:細胞色素C(1),溶菌酶（2），核糖核酸酶（3），靡蛋白酶原（4）第154頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六三、疏水基質人工合成聚合物類瓊脂糖纖維素聚苯乙烯聚丙烯酸甲酯類多糖類殼聚糖

應用最廣泛

良好的生物相容性和化學穩(wěn)定性

第155頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六最常用：正辛基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠更強的疏水作用，一些疏水性較強的蛋白質被吸附后不易解析苯基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠

應用于疏水性較強的蛋白質

第156頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第157頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六四、基本操作

平衡Equilibration上樣

Sampleapplication洗雜Washing洗脫Elution第158頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六Equilibration1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionWatermoleculesHydrophobicligandGelmatrix第159頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六Sampleapplication1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionGelmatrixProteinsHydrophobicgroups

第160頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六Washingoutunboundmaterial1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-boundproteins第161頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionElutionTargetelutesConc.saltAbs第162頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六Elution1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsMorestronglyboundproteins第163頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六1、層析柱的選擇柱床高度通常為5～15cm對一個優(yōu)化好的分離方案進行規(guī)模放大時，可保持柱高不變，增加柱的直徑粗柱子（內徑為1.6～

5.0cm）適合進行HIC層析。第164頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、緩沖液的選擇往平衡的緩沖液和樣品中加入一種鹽析鹽，有利于固定化配基與蛋白質的相互作用。隨著鹽濃度的提高，結合到固定化配基上的蛋白質量也相應提高。最常用的鹽：Na2SO4、NaCl和(NH4)2SO4第165頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、緩沖液的選擇隨著pH的升高，疏水作用相應下降由于pH升高時，被中和的帶點基團增加，從而導致蛋白質的親水性增加在中性pH條件下與疏水相互作用介質不結合的蛋白質，在酸性pH條件下則能夠結合

第166頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六4、蛋白質的洗脫

低濃度的水溶性乙醇、去污劑和具有鹽溶作用的鹽破壞水的結構、降低表面張力，從而削弱疏水相互作用。乙醇或去污劑的非極性區(qū)與結合的蛋白質競爭疏水性配基，從而將蛋白質替代下來。第167頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六5、HIC柱的再生、清潔和貯存

輕度污染時蒸餾水洗滌污染物緊密結合時6mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍洗滌＋起始緩沖液或貯存緩沖液洗滌NaOH可用于溶解變性和沉淀的蛋白質及脂類未使用的介質儲存在封閉的容器中，在4-25℃的條件下保存用過的介質應貯存在含有適當抑菌劑的溶液中，在4～

8℃的條件下保存，不得冷凍

第168頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六五、應用實例

1、大麥β淀粉酶的分離純化14倍大麥粉的0.01mol/L磷酸緩沖液，pH6.8的抽提液，加入硫酸銨至25％飽和度0.01mol／L磷酸緩沖液pH6.8，含25%飽和度硫酸銨平衡辛基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠柱上清液過辛基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠柱平衡液洗滌柱兩重梯度法，降低硫酸銨濃度從25％至0，升高乙二醇濃度從0％至50％，洗脫大麥β淀粉酶↓↓↘↘第169頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六2、凝集素的疏水層析

凝集素常含有疏水結合位點，可以用苯基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠從一些材料中分離得到凝集素豌豆凝集素天花粉凝集素半夏凝集素羊水凝集素第170頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

利用親和層析分離凝集素時所用的基質，應用疏水層析的原理同樣可以分離豌豆凝集素蓖麻凝集素麥胚凝集素荊豆凝集素交聯(lián)葡聚糖G-75柱交聯(lián)瓊脂糖凝膠6B柱固定化的N-乙酰氨基葡萄糖柱固定化的L-巖藻糖柱

第171頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六3、鈣依賴的疏水層析一些鈣結合蛋白，如鈣調蛋白等，在和鈣結合后，空間構象發(fā)生變化，疏水區(qū)域暴露在分子表面。在鈣存在時，使鈣結合蛋白結合到苯基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠柱上并除去雜蛋白后，可用EGTA等鰲合劑，將鈣結合蛋白從柱上洗脫下來。第172頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六從玉米胚芽鞘中分離鈣調蛋白和鈣激活的蛋白激酶

玉米胚芽鞘抽提液上平衡的苯基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠柱

用緩沖液B洗滌柱至276nm的光吸收基本恒定緩沖液C洗去非專一吸附的蛋白質用緩沖液E洗脫鈣調蛋白用緩沖液F洗脫大部分鈣依賴的蛋白激酶↓↓↓↓第173頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六4、固定化酶的制備辛基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠柱可以牢固地吸附β半乳糖苷酶，后者就可用作固定化酶，可連續(xù)使用幾星期。如果酶的活性有所降低，可通過解析低活性的酶，代之以高活性的酶。第174頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六5、用作“去垢劑交換層析”

在研究膜蛋白的結構和功能時，經常要使膜蛋白和不同的去垢劑結合，觀察不同去垢劑對照蛋白活性的影響。運用了疏水層析可以很方便地使同一膜蛋白樣品和不同的去垢劑結合。將和某一種去垢劑結合的膜蛋白吸附在苯基交聯(lián)瓊脂糖凝膠柱上所需的去垢劑通過疏水層析柱，取代原先和膜蛋白結合的去垢劑將膜蛋白從疏水柱上解析下來，完成去垢劑的交換↓↓第175頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六第六節(jié)分配層析第176頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六

第177頁，共199頁，2022年，5月20日，7點46分，星期六一、原理分配層析是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不