植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料

植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定20學(xué)時安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高俊山植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!花藥培養(yǎng)：是指將未成熟的花藥接種在人工培養(yǎng)基上分化成為植株的過程。

屬于器官培養(yǎng)。

供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!一、實驗?zāi)康呐c原理原理：利用組織培養(yǎng)技術(shù)對植物花藥進行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株。通過形態(tài)觀察和染色體分析鑒定單倍體植株，作為新的遺傳資源和選擇材料。目的：掌握植物花藥離體培養(yǎng)技術(shù)；掌握單倍體植株鑒定的方法；了解單倍體育種的意義。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!花藥培養(yǎng)基本流程：預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集具有胚性小孢子的花藥培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)”形成小植株選擇合適的供體植株單倍體植株鑒定植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!三、實驗器材材料：煙草花藥。試劑：MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋紅、蒸餾水。儀器：電子天平、磁力加熱攪拌器、普通光學(xué)顯微鏡、微波爐、pH計、培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、鑷子、剪刀、解剖針、燒杯、試劑瓶、三角瓶、封口膜、橡皮筋、低溫冰箱。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!一般而言，單核期（次有絲分裂前）對誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感，為最佳培養(yǎng)期。形成雙核后，在合適的條件下，主要由營養(yǎng)細胞分裂產(chǎn)生胚狀體。

花粉發(fā)育時期：被子植物的花粉發(fā)育可分為四分體期、單核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）4個時期。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒煙草花粉發(fā)育時期的檢測：一般將植物的花藥置于載玻片上壓碎，加1-2滴1%醋酸洋紅染色，再進行鏡檢，以確定花粉發(fā)育時期。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!處于不同發(fā)育階段的煙草花芽煙草花粉發(fā)育時期的確定煙草花粉培養(yǎng)，選擇單核靠邊期的花藥，培養(yǎng)效果最好。從煙草花的外部形態(tài)變化來看，當(dāng)花蕾的花冠長度與花萼的長度相等時，花藥里面的多數(shù)花粉粒正處于單核靠邊的階段。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!2.花藥離體培養(yǎng)（1）取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。（考慮供體植物基因型、生理狀態(tài)）（2）消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，70％酒精浸泡15-30s后，在1％次氯酸鈉溶液中浸泡8-10min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒8-10min，無菌水沖洗3-5次。（3）接種剝?nèi)ポ嗥突ò?，將花藥取出。去除花絲，但不應(yīng)使花藥受到損傷。（4）培養(yǎng)先進行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!①預(yù)處理

預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件。

預(yù)處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。

預(yù)處理方法：主要是對花藥進行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。煙草花藥培養(yǎng)，4℃低溫預(yù)處理2-3天。

植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!高濃度的NH4+顯著抑制花粉愈傷組織形成。鐵鹽對花粉胚狀體發(fā)育很重要。活性炭促進胚狀體發(fā)育。

較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織；較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。細胞分裂素可促進胚狀體形成；生長素可誘導(dǎo)愈傷組織形成。細胞分裂素與生長素比值高時可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗。氨基酸有機附加物植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!類別化合物培養(yǎng)基濃度(mg/L)母液擴大倍數(shù)500mL母液中藥品量(g)每升培養(yǎng)基取母液的量(ml)大量元素KNO3

190020倍1950NH4NO3165016.5MgSO4·7H2O3703.7CaCl2

·2H2O4404.4KH2PO41701.7微量元素MnSO4·4H2O22.3200倍2.235ZnSO4·7H2O8.60.86H3BO3

6.20.62KI0.830.083Na2MoO4·2H2O0.250.025CuSO4·5H2O0.0250.0025CoCl2.6H2O0.0250.0025鐵鹽Na2·EDTA37.3200倍3.735FeSO4·7H2O27.82.78有機物鹽酸硫胺素(B1)0.4200倍0.045鹽酸吡哆素(B6)0.50.05甘氨酸20.2煙酸0.50.05肌醇10010MS培養(yǎng)基的配制植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!③培養(yǎng)條件

1、溫度適宜溫度是25～28℃，一般不應(yīng)低于25℃。2、光照每天12小時光照,光強為1800-2000lx。3、接種密度每瓶接種花藥多少，應(yīng)根據(jù)三角瓶的大小來決定。50mL三角瓶一般接種10個花藥。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!單倍體植株的發(fā)育方式植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!A：從裂開的花藥中長出胚狀體;B、C：從藥室中直接長出的幼苗;D、E：具有根、莖、葉的小苗;F：小苗發(fā)達的根系植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!⑤白化苗現(xiàn)象植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!3.單倍體植株的鑒定

通過花藥培養(yǎng)獲得的再生植株的染色體數(shù)目也常發(fā)生變異，其后代常是混倍體，所以必須對其后代進行鑒定。

鑒定方法既可以根據(jù)形態(tài)特征進行間接鑒定，也可以鏡檢體細胞中的染色體數(shù)或花粉母細胞中染色體數(shù)以及染色體配對的情況進行直接鑒定。此外還可以根據(jù)花粉的育性或利用遺傳標(biāo)記性狀進行鑒定。（1）染色體直接計數(shù)法通常取根尖、莖尖等分生組織用醋酸洋紅染色進行制片，直接計數(shù)染色體數(shù)目。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!醋酸洋紅染色法觀察植物根尖細胞染色體實驗步驟：

1、取材：煙草根尖。

2、預(yù)處理：冷凍處理。

根尖置于冰水浴中，放到4℃的冰箱中處理24小時。3、固定

沖洗干凈處理的材料，卡諾氏液（冰乙酸：無水乙醇=1：3或冰乙酸：氯仿：無水乙醇=1；3：6）固定24h。4、解離

取出4-5條根置于表面皿中，用蒸餾水沖洗3-4次，加入數(shù)滴1N鹽酸于表面皿中，在酒精燈上間歇式加熱2-4分鐘。5、染色

加幾滴醋酸洋紅于表面皿內(nèi)，在燈上加熱。取一根已染過色的根放在載玻片上，加一滴1%醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片輕敲蓋玻片，使根尖壓成一薄層。

6、鏡檢

先在10倍下找到分裂相后，再換40倍觀察。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!胚狀體形成：MS培養(yǎng)基（1/2大量元素+基本成分）+NAA0.2mg/L+6-BA2mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+1g/L活性炭，pH值5.5-5.8）分化成苗：MS培養(yǎng)基（1/2大量元素+基本成分）+NAA2mg/L+6-BA0.2mg/L+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH值5.5-5.8）植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!二、實驗內(nèi)容1、鏡檢花粉發(fā)育時期2、花藥離體培養(yǎng)2.1取樣2.2消毒2.3接種2.4培養(yǎng)3、單倍體植株的鑒定植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!四、實驗步驟1.適期花藥的選擇花藥中的花粉是由生殖細胞（體細胞）經(jīng)過減數(shù)分裂而來，其染色體只是體細胞中的一半，如果通過一定的途徑將花粉培養(yǎng)成植株，獲得單倍體植株。再經(jīng)過染色體加倍，得到純合的二倍體，大大縮短育種進程。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!四分體時期單核靠邊期花藥切片顯微觀察花粉的發(fā)育營養(yǎng)細胞生殖細胞精子植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!單核晚期液泡第一次有絲分裂后期雙核早期雙核中期生殖核生殖核營養(yǎng)核植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期發(fā)育時期物種減數(shù)分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍四分孢子期至雙核期玉米植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!花藥培養(yǎng)過程取花蕾（鏡檢）預(yù)處理取花藥消毒接種培養(yǎng)愈傷組織發(fā)生植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!②培養(yǎng)基

主要為MS、H、N6、B5和Nitsch培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上發(fā)展出一些其它的培養(yǎng)基。

H培養(yǎng)基（基本成分+6-BA/KT2mg/L+NAA/2,4-D0.2mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+1g/L活性炭，pH值5.5-5.8）上誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織形成后轉(zhuǎn)移到H培養(yǎng)基（

基本成分+NAA2mg/L+6-BA0.2mg/L+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂）上分化成苗。1/2MS培養(yǎng)基+激素+蔗糖+瓊脂+活性炭植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!類別化合物培養(yǎng)基濃度(mg/L)母液擴大倍數(shù)500mL母液中藥品量(g)每升培養(yǎng)基取母液的量(ml)大量元素KNO3

95020倍9.550NH4NO37207.2MgSO4·7H2O1851.85CaCl2

·2H2O1661.66KH2PO4680.68微量元素MnSO4·4H2O25200倍2.55ZnSO4·7H2O101.0H3BO3

101.0Na2MoO4·2H2O0.250.025CuSO4·5H2O0.0250.0025鐵鹽Na2·EDTA37.3200倍3.735FeSO4·7H2O27.82.78有機物鹽酸硫胺素(B1)0.5200倍0.055鹽酸吡哆素(B6)0.50.05甘氨酸20.2葉酸0.50.05煙酸50.5生物素(維生素H)0.050.005肌醇10010H培養(yǎng)基的配制植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!激素名稱濃度（mg/mL）100mL母液中藥品量（g）配方NAA101先少量95%乙醇或1當(dāng)量的NaOH溶解，后加水定容6-BA101先少量濃HCl或1當(dāng)量的鹽酸溶解，后加水定容2,4-D101先少量95%乙醇或1當(dāng)量的NaOH溶解，后加水定容KT101先少量濃HCl或1當(dāng)量的鹽酸溶解，后加水定容植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!1、胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。④花粉植株形態(tài)發(fā)生方式植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株。煙草花藥培養(yǎng)植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機理1、內(nèi)因

供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時期。2、外因

預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時間等。3、機理

核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無性系變異也可能是原因之一。（二）白化苗的控制 通過對花粉發(fā)育時期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進行調(diào)控。植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015資料共35頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!（2）間接鑒定（1）植株形態(tài)學(xué)鑒定法單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實。（2）細胞形態(tài)學(xué)鑒定法葉片