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PCR技術(shù)的發(fā)明、原理及應(yīng)用什么是PCRPCR:Polymerasechainreaction,即聚合酶鏈反應(yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)
PCR技術(shù)的發(fā)展歷史關(guān)于PCR的文章首次由美國科學(xué)家KaryMullis等人在《Science》雜志上發(fā)表《Science》雜志報道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶(生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到的一種耐熱的DNA聚合酶)的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。1993KaryMullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)的原理1遺傳物質(zhì):細(xì)胞核染色體
DNA(脫氧核糖核酸和磷酸鏈和堿基構(gòu)成)堿基(A、T、C、G)是按雙鏈螺旋排列的,堿基序列的長度和排列的順序決定了生物的多樣性。比如人類體細(xì)胞中共有31億個堿基對,按上述的0.1%的差,人和人之間有3百萬個堿基對的差別。PCR的基本工作原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板,以一對分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。PCR技術(shù)的原理2PCR反應(yīng)的基本成分模板DNA、特異性引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)基本反應(yīng)步驟:變性--退火--延伸最后通過染料如EB染色DNA后在紫外燈下顯色檢出PCR技術(shù)的原理31234522557294時間(min)溫度(℃)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~35輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):
特異敏感快速、簡便易自動化等PCR技術(shù)的局限性為了構(gòu)建特定引物,使特定DNA序列的選擇性擴(kuò)增,必須有一個龐大的已知序列的數(shù)據(jù)庫。
聚合酶鏈反應(yīng)效率差異很大,根據(jù)不同的因素需要優(yōu)化反應(yīng)條件。PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度有限。PCR技術(shù)的應(yīng)用基因克隆、測序和表達(dá)等法醫(yī)學(xué)個體識別和親子鑒定遺傳性疾病檢測、腫瘤診斷、病原體檢測等基因克隆和表達(dá)DNA指紋技術(shù)11984年英國的遺傳學(xué)家AlecJeffreys在進(jìn)行肌紅蛋白的DNA序列研究時,意外發(fā)現(xiàn)非功能DNA(不產(chǎn)生蛋白的DNA)上重復(fù)著一種小片段DNA,這一含15個左右堿基的DNA片段,在不同個體間重復(fù)的頻率及位置有明顯的不同,Jeffreys首先在自己的DNA上進(jìn)行研究,驗證了這一技術(shù),如果我們有血緣關(guān)系,這些不同會大大縮小。Jeffreys命名這一技術(shù)為DNA指紋技術(shù)(DNAfingerprint)。DNA指紋技術(shù)2采集血樣(毛發(fā)、
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