EMSA原理流程綱要大綱

EMSA原理流程綱領(lǐng)綱領(lǐng)EMSA原理流程綱領(lǐng)綱領(lǐng)EMSA原理流程綱領(lǐng)綱領(lǐng)凝膠遷徙或電泳遷徙率實(shí)驗(yàn)〔EMSA〕能夠：〔1〕研究DNA聯(lián)合蛋白和其有關(guān)的DNA聯(lián)合序列互相作用；〔2〕可用于DNA定性和定量分析；〔3〕用于研究RNA聯(lián)合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。實(shí)驗(yàn)方法原理凝膠遷徙或電泳遷徙率實(shí)驗(yàn)〔EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay〕是一種研究DNA結(jié)

合蛋白和其有關(guān)的DNA聯(lián)合序列互相作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最先用于研究DNA聯(lián)合蛋白，當(dāng)前已用于研究RNA聯(lián)合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。平常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)志的DNA或RNA探針一起保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分別復(fù)合物和非聯(lián)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非聯(lián)合的探針挪動(dòng)得慢。同位素標(biāo)志的探針依研究的聯(lián)合蛋白的不一樣樣，但是雙鏈或許是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類(lèi)的DNA聯(lián)合蛋白，可用純化蛋白，局部純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在

檢測(cè)RNA聯(lián)合蛋白時(shí)，依照目的RNA聯(lián)合蛋白的地點(diǎn)，可用純化或局部純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采納含蛋白聯(lián)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段〔特異〕，和其余非有關(guān)的片段〔非特異〕，來(lái)確立DNA或RNA聯(lián)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依照復(fù)合物的特色和強(qiáng)度來(lái)確立特異聯(lián)合。試劑、試劑盒[γ-32P]ATPT4多聚核苷酸激酶Nuclease-FreeWaterT4多聚核苷酸激酶緩沖液醋酸銨TE無(wú)水乙醇TBEbuffer重蒸水甲叉雙丙烯酰胺丙烯酰胺甘油過(guò)硫酸銨TEME〔D四甲基乙二胺〕EMSAGel-Shift聯(lián)合緩沖液溴酚藍(lán)儀器、耗材水浴鍋PCR儀離心計(jì)電泳儀電泳槽實(shí)驗(yàn)步驟一、探針的標(biāo)志1.?以下設(shè)置探針標(biāo)志的反應(yīng)系統(tǒng)：〔1〕待標(biāo)志探針(1.75pmol/微升)：2微升?！?〕T4PolynucleotideKinaseBuffer(10X)：1微升?！?〕Nuclease-FreeWater：5微升?！?〕[γ-32P]ATP(3000Ci/mmolat10mCi/ml)：1微升?！?〕T4PolynucleotideKinase(5-10u/微升)：1微升。

〔6〕整體積10微升〔7〕依照上述反應(yīng)系統(tǒng)挨次參加各樣試劑，參加同位素后，Vortex混勻，再參加T4PolynucleotideKinase，混勻。2.?使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。3.?參加1微升探針標(biāo)志停止液，混勻，停止探針標(biāo)志反應(yīng)。4.?再參加89微升TE，混勻。此時(shí)能夠取少許探針用于檢測(cè)標(biāo)志的效率。平常標(biāo)志的效率

在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo)志到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單起見(jiàn)，平常不用測(cè)定探針的標(biāo)志效率。5.?標(biāo)志好的探針最好立刻使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超出3天。標(biāo)志好的探針能夠保留在-20℃。二、探針的純化平常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單起見(jiàn)，能夠不用純化標(biāo)志好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改良EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，能夠依照以下步驟操作：1.?關(guān)于100微升標(biāo)志好的探針，參加1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再參加2體積即200微升的無(wú)水乙醇，混勻。2.?在-70℃至-80℃積淀1小時(shí)，或在-20℃積淀留宿。3.?在4℃，12000g-16000g離心30分鐘。當(dāng)心去除上清，切不能夠涉及沉。4.?在4℃，12000g-16000g離心1分鐘。當(dāng)心吸去節(jié)余液體。微晾干積淀，但不宜過(guò)分干燥。5.?參加100微升TE，完滿(mǎn)溶解積淀。標(biāo)志好的探針最好立刻使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超出3天。標(biāo)志好的探針能夠保留在-20℃。

三、EMSA膠的配制1.?準(zhǔn)備好倒膠的模具。能夠使用常例的灌制蛋白電泳膠的模具，或其余適合的模具。最好選擇能夠灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為獲得更好的結(jié)果，能夠選擇可灌制較大EMSA膠的模具。2.?依照以下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不一樣樣比率的Acr/Bis

對(duì)結(jié)果影響不大)。〔1〕TBEbuffer(10X)：1毫升。

重蒸水16.2毫升。〔2〕39:1acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)：2毫升。〔3〕80%甘油：625微升。〔4〕10%過(guò)硫酸銨(ammoniumpersulfate)：150微升?！?〕TEMED：10微升3.?依照上述序次參加各個(gè)溶液，參加TEMED前先混勻，參加TEMED后立刻混勻，并立刻參加到制膠的模具中。防備產(chǎn)生氣泡，并加上梳齒。假如發(fā)現(xiàn)特別簡(jiǎn)單形成氣泡，能夠把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化辦理。四、EMSA聯(lián)合反應(yīng)1.?以下設(shè)置EMSA聯(lián)合反應(yīng)陰性比較反應(yīng)：(1〕Nuclease-FreeWater：7微升。〔2〕EMSA/Gel-Shift聯(lián)合緩沖液(5X)：2微升。〔3〕細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：0微升?！?〕標(biāo)志好的探針：1微升。〔5〕整體積：10微升。樣品反應(yīng)：〔1〕Nuclease-FreeWater：5微升?！?〕EMSA/Gel-Shift聯(lián)合緩沖液(5X)：2微升。〔3〕細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。

〔4〕標(biāo)志好的探針：1微升?！?〕整體積：10微升。探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：〔1〕Nuclease-FreeWater：4微升?！?〕EMSA/Gel-Shift聯(lián)合緩沖液(5X)：2微升?！?〕細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升?！?〕未標(biāo)志的探針：1微升。

〔5〕標(biāo)志好的探針：1微升。〔6〕整體積：10微升。突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：〔1〕Nuclease-FreeWater：4微升?！?〕EMSA/Gel-Shift聯(lián)合緩沖液(5X)：2微升?！?〕細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升?！?〕未標(biāo)志的突變探針：1微升?！?〕標(biāo)志好的探針：1微升?！?〕體積：10微升Super-shift反應(yīng)：〔1〕Nuclease-FreeWate：r4微升?！?〕EMSA/Gel-Shift聯(lián)合緩沖液(5X)：2微升。

〔3〕細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。〔4〕目的蛋白特異抗體：1微升?！?〕標(biāo)志好的探針：1微升?！?〕整體積：10微升。2.?依照上述序次挨次參加各樣試劑，在參加標(biāo)志好的探針前先混勻，而且室溫(20-25℃)放

置10分鐘，進(jìn)而除去可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性聯(lián)合，或許讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。此后參加標(biāo)志好的探針，混勻，室溫(20-25℃)擱置20分鐘。3.?參加1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無(wú)色，10X)，混勻后立刻上樣。注意：有些時(shí)候

溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的聯(lián)合，建議盡量使用無(wú)色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。假如關(guān)于使用無(wú)色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺(jué)到?jīng)]法上樣，能夠在無(wú)色上樣緩沖液里面增添很少許的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能察看到藍(lán)顏色即可。五、電泳分析1.?用0.5XTBE作為電泳液。依照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候假如有空余

的上樣孔，能夠參加少許稀釋好的1X的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以察看電壓能否正常進(jìn)行。2.?把混淆了上樣緩沖液的樣品參加到上樣孔內(nèi)。在節(jié)余的某個(gè)上樣孔內(nèi)參加10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍(lán)色)，用于察看電泳進(jìn)行的狀況。3.?依照10V/厘米的電壓電泳。保證膠的溫度不超出30℃，假如溫度高升，需要適合降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。4.?剪一片大小和EMSA膠大小周邊或略大的比較厚實(shí)的濾紙。當(dāng)心取下夾有EMSA膠的膠

板，用吸水紙或一般廁紙大概擦干膠板邊沿的電壓液。當(dāng)心打開(kāi)兩塊膠板中的上邊一塊(注：平常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)漸漸覆遮住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠輕輕浸潤(rùn)后(大概缺少1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來(lái)。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上邊覆蓋一層保鮮膜，保證保鮮膜和膠之間沒(méi)有氣泡。5.?干膠儀器上無(wú)聊EMSA膠。此后用X光片壓片檢測(cè)，或用其余適合儀器設(shè)施檢測(cè)。其余一、常有問(wèn)答1.什么是凝膠遷徙或電泳遷徙率實(shí)驗(yàn)？凝膠遷徙或電泳遷徙率實(shí)驗(yàn)〔EMSA〕是一種研究DNA聯(lián)合蛋白和其有關(guān)的DNA聯(lián)合序列互相作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最先用于研究DNA聯(lián)合蛋白，當(dāng)前已用于研究RNA聯(lián)合蛋白和特定的RNA序列的互相作用。平常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)志的DNA或RNA探針一起保溫，在非變性

的聚丙烯凝膠電泳上，分別復(fù)合物和非聯(lián)合的探針。DNA復(fù)合物或RNA復(fù)合物比非聯(lián)合的探針挪動(dòng)得慢。同位素標(biāo)志的探針依研究的聯(lián)合蛋白的不一樣樣，但是雙鏈或許是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類(lèi)的DNA聯(lián)合蛋白，可用純化蛋白，局部純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。

在檢測(cè)RNA聯(lián)合蛋白時(shí)，依照目的RNA聯(lián)合蛋白的地點(diǎn)，可用純化或局部純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采納含蛋白聯(lián)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段〔特異〕，和其余非有關(guān)的片段〔非特異〕，來(lái)確立DNA或RNA聯(lián)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依照復(fù)合物的特色和強(qiáng)度來(lái)確立特異聯(lián)合。2.實(shí)驗(yàn)中需要用到什么試劑？凝膠遷徙實(shí)驗(yàn)需要的聯(lián)合蛋白，可根源于純化或局部純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必然制備同位素標(biāo)志的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用32P和T4多核苷酸激酶來(lái)作尾端標(biāo)志，同位素標(biāo)志的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標(biāo)志的核苷酸在體外合成。Promega企業(yè)的Riboprobe/sup系統(tǒng)〔a,b〕可用于同位素標(biāo)志的RNA的體外合成，DNA5'末

端標(biāo)志系統(tǒng)，用于制備DNA探針，聯(lián)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液〔氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀〕、緩沖系統(tǒng)〔Tris-HCl或HEPES〕、還原劑〔DTT〕、甘油、非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA〔poly〔dI:dC〕dI:dC〕，也可能含非離子去污劑。在聯(lián)合蛋白和同位素標(biāo)志的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分別復(fù)合物，隨后將凝膠無(wú)聊并放射自顯影，或用PhosphorImage/sup分析。3.凝膠遷徙實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)供給了什么試劑？Promega企業(yè)供給一種凝膠遷徙實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)DNA聯(lián)合蛋白，系統(tǒng)可作為這種實(shí)驗(yàn)的一種陽(yáng)

性比較。系統(tǒng)包含目的寡核苷酸，比較DNA聯(lián)合蛋白，聯(lián)合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標(biāo)志所需的試劑。Core系統(tǒng)包含含重組AP2蛋白〔AP2抽提液〕的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達(dá)AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。其余，Core系統(tǒng)還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷徙聯(lián)合緩沖液，和能作20次比較實(shí)驗(yàn)的HeLa核抽提液。Complete系統(tǒng)含其余5個(gè)雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、TFIID聯(lián)合位點(diǎn)的同源序列。這些寡核苷酸能夠在尾端標(biāo)志后用作特異性探針，或在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)頂用作非特異性探針。4.成功進(jìn)行凝膠遷徙實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化哪些要素？凝膠遷徙實(shí)驗(yàn)在理論上很簡(jiǎn)單也很迅速，但要成功地進(jìn)行凝膠遷徙實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受聯(lián)合蛋白的根源和探針聯(lián)合位點(diǎn)特色的影響。以下是需要優(yōu)化的要素：抽提液的制備〔核酸酶和磷酸酶污染會(huì)使探針降解〕，聯(lián)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH，聚丙烯凝膠電泳的特色和電泳條件，保溫時(shí)間和溫度，載體蛋白，能否有協(xié)助因子〔比方鋅，或鎘等金屬離子，或激素〕?？傊?，反應(yīng)整體積應(yīng)最小〔20μ〕l。為知足一般要求，聯(lián)合緩沖液含4%甘油，1mMMgCl2，0.5mMEDTA，0.5mMDTT，50mMNaCl，10mMTris-HCl〔〕，0.05mg/mlpolydI:dC，或10mMHEPES〔〕，50mMKCl，1mMDTT，1mMEDTA，10%甘油，0.05mg/mlpolydI:dC可作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的初步。5.在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要要素？目的DNA的長(zhǎng)度應(yīng)小于300bp，以有益于非聯(lián)合探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分別。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷徙實(shí)驗(yàn)頂用作探針。如目的蛋白已被判斷，那么應(yīng)用短的寡核苷酸片段〔約為25bp〕，這樣聯(lián)合位點(diǎn)可和其余因子的聯(lián)合位點(diǎn)差別開(kāi)。長(zhǎng)

的限制性酶切片段可用于對(duì)推定的啟動(dòng)子/加強(qiáng)子地區(qū)內(nèi)的蛋白聯(lián)合位點(diǎn)定位。隨后可用DNaseI印跡對(duì)蛋白聯(lián)合的特異地區(qū)在DNA序列水平上作出分析。6.用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)理因子和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：AP1,AP2,CREB,NFkB,Oct1,Sp1,TFIID,TFIIB。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為聯(lián)合蛋白的根源時(shí)，每1個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)理因子和它有關(guān)的DNA同源序列聯(lián)合形成特色型的聯(lián)合形態(tài)。以下的文字描繪了每一個(gè)獨(dú)自的轉(zhuǎn)錄調(diào)理因子，包含鑒識(shí)的同源序列，因子的大小，特定的聯(lián)合條件，以及和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)量。1．細(xì)胞核蛋白提?。喝〖s8.8×106個(gè)HSC-T6細(xì)胞，5mlPBS/PhosphataseInhobitors沖刷，采集細(xì)胞。參加0.25ml1×Hypotonicbuffer重懸，冰浴15min；參加25μlNP-40，震蕩10s；14000×g離心，30s，4℃；采集上清即胞漿蛋白，于‐70℃保留。將積淀重懸于50μlLysisbuffer〔含DTT和ProteaseInhibitorCocktail〕中，震蕩10s；置于搖床中冰浴30min，150次/min；再次震蕩30s，14000×g離心，10min，4℃；取上清即為核蛋白，于‐70℃保留，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。2．寡核苷酸探針的標(biāo)志和純化:rat：NF-κB：5′AGTTGAGGG