生物物理試驗方法

第3講熒光光譜熒光是怎么產生的？有什么用途？常用熒光光譜有哪些？熒光光譜有哪些特征？熒光強度和物質濃度是什么樣的關系?還有哪些因素會影響到熒光強度？熒光光譜的有哪些光譜參數(shù)？有哪些實驗方法？各種熒光測量方法有什么用途？熒光：某些物質受到照射后發(fā)出能量較低的光，一旦光照停止，光線也立即消失，稱為熒光。入射光和發(fā)射光頻率之差稱為斯托克頻移。滿足上述條件即為熒光。因此熒光范圍比較寬，從X射線到紅外光譜區(qū)仍然是熒光。其他的能量如（化學反應、加熱、生物代謝等）也會有熒光。生活中很多現(xiàn)象都與熒光相關。如：鈔票防偽，日光燈管，螢火蟲發(fā)光。1.熒光介紹1）熒光產生及其物理機制S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2內轉換振動弛豫a)光吸收：熒光物質從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，過程約10-15s。此時，熒光分子處于激發(fā)態(tài)。b)內轉換：處于電子激發(fā)態(tài)的分子由于內部的作用，以無輻射躍遷過渡到低的能級。c)外轉換：處于電子激發(fā)態(tài)的分子由于和溶劑以及其他分子的作用，以及能量轉移，過渡到低的能級d)熒光發(fā)射：如果不以內轉換的方式回到基態(tài)，處于第一電子激發(fā)態(tài)最低振動能級的分子將以輻射的方式回到基態(tài)，平均壽命約為10ns左右。e)系間轉換：不同多重態(tài),有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷。如電子自旋改變，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。f）振動馳豫：高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12s。

熒光發(fā)光分為內源熒光和外源熒光。外源熒光應用很廣，如染料結合作為熒光探針與蛋白質結合后吸附在大分子上可以提供微區(qū)極性、疏水區(qū)大小、粘性、分子間距離等。熒光壽命和量子產率：熒光猝滅：熒光能量共振轉移：時間分辨熒光光譜：熒光各向異性：熒光量子點標記，轉基因熒光標記雙光子熒光光譜2）熒光的應用2.常用熒光光譜1）熒光的激發(fā)光譜，發(fā)射譜激發(fā)譜：固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光強度與激發(fā)光波長的關系曲線。

激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大；熒光光譜有瞬態(tài)熒光光譜和穩(wěn)態(tài)熒光光譜兩類。通常熒光光譜指的是穩(wěn)態(tài)熒光光譜。熒光的發(fā)射譜：固定激發(fā)波長，發(fā)射強度與發(fā)射波長的關系。2).熒光光譜的特征

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2,1)，產生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產生波長一定的熒光(如‘2)。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似（振動波函數(shù)一樣）；

基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

3.熒光光譜儀及使用技術光源

激發(fā)單色器樣品池檢測器發(fā)射單色器檢測器

熒光是散射譜，所以一般在垂直入射方向接收。背景是沒有入射光，是“暗背景”，因此靈敏度更高。1）熒光光譜儀I0dF薄層吸收的光強為：溶液發(fā)出的熒光光強正比于吸收光強。如果kcl<<1，進行展開，有2）熒光強度和溶液濃度的關系樣品池長度通常為1cm，因此熒光強度為

熒光隨著濃度增高，強度反而減小，稱為濃度猝滅。原因可能是：a濃度增加，分子碰撞機會增加，增加了非輻射損耗。b溶液中其他雜質吸收發(fā)出的熒光。（內濾光）c吸收譜和發(fā)射譜重疊，熒光又被吸收。（自吸收）d儀器原因3）.熒光光譜的環(huán)境效應4.熒光光譜參數(shù)1）熒光光譜參數(shù)：（1)熒光壽命和熒光量子產率去掉激發(fā)光以后，熒光強度并不是立即消失，而是以指數(shù)形式衰減。定義熒光強度降低到激發(fā)狀態(tài)最大熒光強度的1/e所需要的時間稱為熒光壽命。熒光壽命是個很重要的參數(shù)，可以不再對熒光的絕對強度進行測量。熒光壽命方程：公式中的τ即為熒光壽命熒光壽命和量子產率示意圖Q為量子產率，為熒光發(fā)射速率，knr為非輻射轉移速率,τn為熒光自然壽命.通常量子效率和波長相關，但生化的熒光通常和波長無關。（2).熒光各向異性

熒光偏振：熒光偏振（參數(shù)）：p=(F∥-F⊥)/(F∥+F⊥)

熒光各向異性:γ=(F∥-F⊥)/(F∥+2F⊥)XYZF⊥F∥μaμeIp和同時描述熒光偏振。從對稱性考慮，F(xiàn)x=Fy,通常用描述熒光偏振各向異性與偏振度轉換：5.熒光實驗方法及其用途熒光猝滅熒光各向異性熒光能量共振轉移時間分辨熒光光譜熒光標記雙光子熒光光譜

熒光猝滅泛指任何可以減低樣品熒光強度的過程。狹義主要指那些由于熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用所引起的熒光強度降低的情況。原因：溶劑猝滅劑和熒光物質之間發(fā)生相互作用而引起熒光效率降低或激發(fā)態(tài)壽命縮短，導致強度降低。鹵素離子、重金屬離子、氧分子都是猝滅劑。研究主要集中在可測量的“狹義熒光猝滅”。生化方面主要應用猝滅現(xiàn)象指示分子之間的相互作用。揭示發(fā)色團和猝滅劑的接近程度，反映發(fā)色團在蛋白和膜上的局域位置，質子的通透性和膜的通透性。碰撞猝滅可以用來確定猝滅及的擴散系數(shù)。采用Stern-Volmer方程來解釋1）.熒光猝滅（1）碰撞猝滅分析Lackowicz“Principleoffluorescentspectroscopy”Chapt8,p237-p265碰撞猝滅的Stern-Volmer方程F0/F=1+kqτ0

[Q]＝1＋KD[Q]

其中kq是猝滅速率

τ0是無猝滅劑存在時的熒光壽命

[Q]是猝滅劑的濃度

F0/F～[Q]曲線。單一線性猝滅曲線預示所有發(fā)色團和猝滅劑是具有相同的可接近性。如果其中有一種不可接近，則Stern-Volmer曲線不是線性的。熒光發(fā)色團和猝滅劑形成不發(fā)熒光的復合物，吸收光以后，以無輻射躍遷的形式回到基態(tài)。解離常數(shù)為：

與動力學猝滅的形式相仿，然而熒光壽命并沒有發(fā)生改變。靜態(tài)猝滅也是和猝滅劑呈線性關系，因此需要通過改變溫度或測量熒光壽命來區(qū)分。kq～T/η（因為和擴散系數(shù)相關）另外可以通過測量吸收譜的方法確定。（2)靜態(tài)猝滅2）熒光偏振（1）熒光偏振現(xiàn)象及用途一旦用偏振光照射，從許多樣品出射的光也是偏振的。當樣品各個方向出射的偏振光是不相同的，可以說樣品顯示出偏振的特性。研究偏振可以提供分子及周圍環(huán)境更多的信息：

偏振光照射到熒光分子上，分子對光的吸收和發(fā)射過程與分子框架相對偏振光的偏振方向相關。熒光偏振可以用來測量蛋白質的變形，蛋白質的結合以及蛋白質的內部動力學。與膜結合的熒光發(fā)色團用來估計膜的內部粘性以及居于相變溫度之上的磷脂復合物的特性。XYZθφF∥F⊥設發(fā)射振子和Z軸夾角為Y為熒光檢測方向（2）.熒光偏振的定量描述p=(F∥-F⊥)/(F∥+F⊥)（1）能量轉移：Fluorescentresonanceenergytransfer（FRET)術語：F?rsterresonanceenergytransfer紀念德國科學家TheodorF?rster3）.熒光能量共振轉移TheodorF?rster簡介

1910生于德國法蘭克福，1933獲Ph.D。1942年前，一直在研究有機復合物的光吸收。二次大戰(zhàn)后，于1945年加入馬克思普朗克研究所。1946年發(fā)表第一篇能量轉移的文章。能量轉移與供體的發(fā)射譜和受體的吸收譜的重疊、量子產率、距離、相對取向相關。激發(fā)態(tài)的供體能量被受體吸收，熒光強度下降。能量轉移可能以兩種方式：輻射和非輻射。共振轉移的機制：偶極子相互作用通過非輻射進行能量轉移（<10nm)。熒光能量轉移的先決條件：1)供體和受體有一定譜重疊（共振能量轉移）。2)供體和受體距離比較近（正比于R6)。3）供體和受體躍遷偶極距的方向不能垂直（2）.能量轉移的物理機制F?rster公式：kT=kD(R0/R)6,kD=1/

D

如果波長采用cm，采用摩爾消光系數(shù)則：R0=9780(J(λ)к2n-4ΦD)1/6（單位為0.1nm)J=∫f(λ)ε(λ)λ4dλ（譜重疊積分）（3）Fret分析Lakowicz，JR.PrinciplesofFluorescentSpectroscopy,2ndEd,Chapt.13，p369.能量轉移經常用于測定供體和受體的距離，稱為“光譜尺”（spectroscopicruler），有時也會受到供體和受體的擴散影響。能量轉移效率4).時間分辨光譜：輸入脈沖，然后進行對接收的信號進行相應分析。時間分辨壽命；時間分辨各向異性。

熒光各向異性可以采用穩(wěn)態(tài)測量，也可以用瞬態(tài)方法進行測量。穩(wěn)態(tài)測量是得到的是一個平均值，雖然容易解釋，但需要做很多假設。瞬態(tài)測量是測量脈沖激發(fā)后的時間相關各向異性?？梢灾苯訌膶嶒灁?shù)據(jù)中觀察得到并進行解釋。各向異性與樣品尺寸、形狀以及標記分子的柔性相關，需要從各種分子模型進行計算擬合。各向異性衰減可以從TD或FD方法得到。目前還是采用時間分辨進行測量。一般情況下，要用水合體積進行計算旋轉相關時間。如果是球形的樣品，將會有單一衰減指數(shù)；大多數(shù)情況將會有多個衰減指數(shù)。原因主要是樣品為非球形蛋白質或樣品中有不同運動狀況的熒光發(fā)色團。衰減時間與沿各分子軸的旋轉相關。如果樣品內部某些片斷是柔性的，衰減時間也會改變。因此熒光各向異性可用于研究蛋白的內部動力學。

能量轉移也會影響各向異性衰減。在膜蛋白的研究中，通過各向異性衰減也有很多信息。

（1）各向異性的時間相關特性所得到的是平均結果。一般來講，樣品不會是完全均勻分布也不是高度有序。利用瞬態(tài)測量壽命時，式中的時間壽命是基于只有一個衰減時間的假設。但如果有多組分，則需要取平均壽命。另外采用有供體和受體時的熒光強度，用的是積分強度。在固體樣品中，可以克服樣品在溶劑中旋轉擴散的影響。熒光猝滅，熒光能量共振轉移都可以影響熒光的壽命，因此用時間分辨譜進行研究。（2）時間分辨壽命5.熒光標記有些物質不發(fā)熒光，而且生化分子中如氨基酸中只有少數(shù)殘基發(fā)熒光，成為內源熒光。如染料與與研究對象結合，作為探針應用熒光方法與蛋白質結合后吸附在大分子上可以提供微區(qū)極性、疏水區(qū)大小、粘性、分子間距離等。加入染料不應影響大分子的結構加入染料不應影響大分子的功能標在不同位置，效果不同。標記方法：1）有轉基因標記：單點轉基因標記:把某個氨基酸改變成Trp,或者轉變成Cys再與熒光探針結合。熒光蛋白：在蛋白中插入含發(fā)色團的熒光蛋白，GFP,YFP,1）綠色熒光蛋白（GFP,greenfluorescentprotein）BFP2）量子點熒光標記量子點：QuantumDot量子點又可稱為半導體納米微晶體。目前研究較多的主要是硫化鎘、硒化鎘和碲化鎘（CdS、CdSe和CdTe）。量子點由于粒徑很小(約1～100nm)，因此光學行為與一些大分子相似,可以發(fā)射熒光。量子點的體積大小嚴格控制著它的光吸收和發(fā)射特征。晶體顆粒越小,比表面積越大,分布于表面的原子就越多,量子尺寸效應越強

,從而使其光吸收帶藍移,熒光發(fā)射峰位也相應藍移。單獨的量子點顆粒容易受多種因素影響,熒光量子產率很低。但是當以其為核心,用另一種半導體材料包覆,形成核-殼結構后,就可將量子產率提高到約50%,甚至更高,因而有很強的熒光發(fā)射。目前已合成了多種核-殼結構的納米顆粒,如CdS/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdS/ZnS、ZnS/CdSe、ZnSe/CdSe、CdS/HgS、CdS/PbS等，以及多層結構的CdS/HgS/CdS。

1.激發(fā)量子點的激發(fā)光波長范圍很寬,因此不同大小的(CdSe)ZnS量子點可以由同一波長的光激發(fā)。

2.量子點具有較大的半徑位移和狹窄對稱的熒光譜峰,這樣就允許同時使用不同光譜特征的量子點,而發(fā)射光譜不出現(xiàn)