蛋白質(zhì)分離純化基礎(chǔ)技術(shù)培訓(xùn)2021推選ppt

蛋白質(zhì)分離純化基礎(chǔ)技術(shù)培訓(xùn)蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和生物功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)在自然界中存在于復(fù)雜的混合體系中，而且許多重要的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的含量極低。要把蛋白質(zhì)從復(fù)雜的體系中分離出來(lái)，同時(shí)又要防止其組成、結(jié)構(gòu)的改變和生物活性的喪失，顯然是有相當(dāng)難度的。概述破碎蛋白溶解酸、堿醇去垢劑尿素……粗提沉淀相分離分子篩……精提各種色譜電泳分離差速離心……研磨超聲滲透壓酶……保存原材料的獲取濃縮保存狀態(tài)保存條件保存期限……培訓(xùn)內(nèi)容蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理蛋白質(zhì)常規(guī)層析技術(shù)FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定培訓(xùn)內(nèi)容蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理蛋白質(zhì)常規(guī)層析技術(shù)FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定預(yù)處理液體材料過(guò)濾離心固體材料洗滌材料破碎破碎方法機(jī)械破碎非機(jī)械破碎攪拌、振動(dòng)研磨壓濾超聲勻漿干燥滲透壓凍融酶超聲破碎頻率高于20000HZ的聲波稱為“超聲波”。缺點(diǎn)：發(fā)熱，剪切力強(qiáng)，體系中會(huì)產(chǎn)生自由基，它可能破壞蛋白的結(jié)構(gòu)。滲透壓破碎滲透沖擊法破碎表達(dá)產(chǎn)物的抽提以滲透沖擊法為宜，沒(méi)有特殊原因不要使用超聲破碎法。不破壞細(xì)胞壁，改變細(xì)胞膜的通透性。0°C，20%蔗糖，10mM左右緩沖液，含，高滲后，加入低滲液，迅速充分懸浮。如果必要，應(yīng)含DTT至2mM左右；均漿液組成原則：離子強(qiáng)度盡量低：≤50mM，有時(shí)需DTT，不一定加EDTA，可考慮加PMSF，但此時(shí)不宜用Tris等胺類(lèi)緩沖劑離心離心是利用離心力，分離液體與固體顆?；蛞后w與液體的混合物中各組分的方法。是根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等因子的不同，而使物質(zhì)分離的技術(shù)。不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離所需的離心力結(jié)構(gòu)離心力g細(xì)胞核800-1000線粒體20,000-30,000葉綠體20,000-30,000溶菌酶20,000-30,000微體20,000-30,000粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)50,000-80,000質(zhì)膜和光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)80,000-100,000cytosolic>100,000游離核糖體、病毒粒體150,000-300,000離心方法差速離心、等密度梯度離心、速率區(qū)帶密度梯度離心平衡等密度梯度離心區(qū)帶離心連續(xù)流離心。。。離心優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，成本較低缺點(diǎn)沉淀的蛋白因?yàn)閿D壓、變性、聚集而失活不適合大規(guī)模操作超濾分子量cutoff的含義如膜對(duì)被截留物質(zhì)的截留率大于90％時(shí)，就用被截留物質(zhì)的分子量表示膜的截留性能，稱為膜的截留分子量。超濾超濾由于剪切力和發(fā)熱的影響，易造成蛋白失活。如果用超濾分離蛋白，只有分子量相差一個(gè)數(shù)量級(jí)才可以分開(kāi)在蛋白濃度低的情況下，超濾膜對(duì)蛋白的吸附比較強(qiáng)?？梢杂肨ween20先鈍化，能降低蛋白吸附雙水相系統(tǒng)：因兩種水溶性聚合物的水溶液，或一種水溶性聚合物水溶液與鹽溶液混合時(shí)的不相容性而形成有明顯界面的兩相系統(tǒng)雙水相抽提

葡聚糖（Dextran）與聚乙二醇（PEG）按一定比例與水混合，溶液混濁，靜置平衡后，分成互不相溶的兩相，上相富含PEG、下相富含葡聚糖各種類(lèi)型的雙水相體系類(lèi)型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非離子型聚合物/非離子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子電解質(zhì)/非離子型聚合物羧甲基纖維素鈉聚乙二醇高分子電解質(zhì)/高分子電解質(zhì)葡聚糖硫酸鈉羧甲基纖維素鈉聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/無(wú)機(jī)鹽聚乙二醇磷酸鉀硫酸銨特點(diǎn)：兩相均含有大量的水（高達(dá)80%以上），界面張力小，一般只有-4mN/m，萃取環(huán)境和條件溫和，生物相容性好，有時(shí)有穩(wěn)定作用；分配系數(shù)可控：聚合物修飾、相系統(tǒng)組成

操作條件容易放大幾百倍。選擇雙水相的原則能夠獲得高的產(chǎn)物回收和生物活性回收，高的分離純化倍數(shù)；系統(tǒng)的物理化學(xué)性質(zhì)有利于大規(guī)模的應(yīng)用，有良好的工藝性能，系統(tǒng)黏度低，相分離快，達(dá)到相平衡時(shí)間短，工藝參數(shù)容易控制，工藝條件可調(diào)性范圍大；系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)，成本低，無(wú)毒，適合大規(guī)模應(yīng)用。優(yōu)點(diǎn)直接從cell碎片勻漿中萃取prot、而無(wú)需將細(xì)胞碎片分離雙水相系統(tǒng)平衡時(shí)間短，含水量高，界面張力低，成相聚合物對(duì)蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用，為生物活性物質(zhì)提供了溫和的分離環(huán)境操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)省時(shí)，易于放大.由于很容易達(dá)到平衡，用商業(yè)上的離心機(jī)能使相分離完全，分配系數(shù)的值重演性很好，故可直接放大改變體系的pH和電解質(zhì)濃度可進(jìn)行反萃取通常將蛋白質(zhì)分配在上相，而細(xì)胞碎片分配在下相（鹽）缺點(diǎn)雙水相技術(shù)雖然在生物物質(zhì)分離中有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但雙水相萃取技術(shù)體系并不完善，有很多需要解決的問(wèn)題，其中很主要的一個(gè)是萃取劑的回收。在生物分子回收和純化以后，怎樣從含有目標(biāo)產(chǎn)物殘留物水溶液中回收聚合物和鹽就成為重要問(wèn)題。目前聚合物的回收采用的一些方法是：超濾、滲析膜過(guò)濾離子交換吸附，但這些方法都存在自身缺點(diǎn)，不能使聚合物很完全的回收，仍然使成本較高。雙水相萃取技術(shù)雖然有技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，但其原料成本較高，使其產(chǎn)業(yè)化成了問(wèn)題。另外，雙水相萃取技術(shù)至今還沒(méi)有一套完善的理論體系，不能很好的解釋大分子在體系中分配的機(jī)理。培訓(xùn)內(nèi)容蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理蛋白質(zhì)常規(guī)層析技術(shù)FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定層析的概念流動(dòng)相流出組分固定相洗脫峰例如葡聚糖凝膠、纖維素、樹(shù)脂等層析介質(zhì)生物兼容性：親水性，大孔徑，不會(huì)使生物大分子失活，沒(méi)有生物化學(xué)毒性—過(guò)強(qiáng)吸附、泄露?；瘜W(xué)穩(wěn)定性：在生物大分子存在的化學(xué)條件下是穩(wěn)定的。必要的機(jī)械性能：流體中的耐壓性、彈性。層析前需要了解蛋白質(zhì)純化表蛋白質(zhì)含量、目標(biāo)活性的含量、比活性、純化倍數(shù)、活性回收率、產(chǎn)率等需要關(guān)注過(guò)程相關(guān)雜質(zhì)或污染物明確關(guān)鍵雜質(zhì)，哪一步去除了哪些雜質(zhì)，體現(xiàn)質(zhì)量源于設(shè)計(jì)綜合考慮樣品的各種性質(zhì)穩(wěn)定性、等電點(diǎn)、分子量、疏水性、產(chǎn)品濃度純化經(jīng)濟(jì)學(xué)一般3步到4步純化，步驟如果再多，可能不經(jīng)濟(jì)常用層析技術(shù)親和層析離子交換層析疏水層析凝膠過(guò)濾層析親和層析原理：

親和層析是利用生物高分子與配基可逆結(jié)合的原理，將配基通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合于載體上而制得的層析系統(tǒng)。這種可逆結(jié)合的作用主要是靠生物高分子對(duì)它的配基的空間結(jié)構(gòu)的識(shí)別。常用的生物親和關(guān)系有酶-底物、抗體-抗原、外源凝集素-糖蛋白等。

親和層析純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高。對(duì)分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本法必須針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制。原理：

以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離。通過(guò)靜電相互作用而使帶正電荷的樣品結(jié)合到陽(yáng)離子交換介質(zhì)上，而帶負(fù)電荷的介質(zhì)則可結(jié)合到陰離子交換介質(zhì)上，再采用改變鹽濃度或者緩沖液的pH值的方法進(jìn)行洗脫。

離子交換層析(ionexchangechromatography)因此可利用疏水層析結(jié)合目標(biāo)蛋白而去除熱原。高分子電解質(zhì)/非離子型聚合物脫鹽/換液常用SephadexG-25，其最大上樣量為30%。蛋白質(zhì)在自然界中存在于復(fù)雜的混合體系中，而且許多重要的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的含量極低。在進(jìn)行pH梯度洗脫時(shí)，盡量避免跨越蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。50,000-80,000FDA規(guī)定:一個(gè)生產(chǎn)程序,每次必須產(chǎn)出相同數(shù)量和品質(zhì)的產(chǎn)品,否則不會(huì)被認(rèn)可;因此可利用疏水層析結(jié)合目標(biāo)蛋白而去除熱原。0°C，20%蔗糖，10mM左右緩沖液，含，高滲后，加入低滲液，迅速充分懸浮。離心是利用離心力，分離液體與固體顆?；蛞后w與液體的混合物中各組分的方法。FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定20,000-30,000界面張力小，一般只有-4mN/m，

影響因素：緩沖液的鹽濃度和pH值。在進(jìn)行pH梯度洗脫時(shí)，盡量避免跨越蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。流速高的情況下，分辨率低經(jīng)驗(yàn)離子交換后，采用疏水層析，可省去緩沖液交換步驟（BufferExchange）；電導(dǎo)率更能反映影響離子交換的強(qiáng)度。離子交換平衡液應(yīng)采用盡量低的離子強(qiáng)度，上樣體積不限。吸附層析造成的失活所有的吸附都是動(dòng)態(tài)的，吸附時(shí)間越長(zhǎng)，失活的比例越大高密度的配基造成蛋白質(zhì)溶液在洗脫時(shí)形成聚集體，造成失活通常蛋白質(zhì)在PH8-10的弱堿性條件下比在pH6-4的弱酸性條件下要更穩(wěn)定一些，因此蛋白質(zhì)在陰離子交換的變性情況要比陽(yáng)離子交換要少得多

原理：

根據(jù)分子表面疏水性差別來(lái)分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種方法。蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團(tuán)，稱為疏水補(bǔ)丁，疏水補(bǔ)丁可以與疏水性層析介質(zhì)發(fā)生疏水性相互作用而結(jié)合。溶液中高離子強(qiáng)度可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水作用。疏水層析hydrophobicinteractionchromatography，HIC影響因素：鹽類(lèi)，鹽可增加水相的極性，提高界面的表面張力，同時(shí)可使蛋白質(zhì)暴露出臨近界面的非極性基團(tuán)，容易形成疏水作用。所以鹽濃度越高，促疏水作用越強(qiáng)。有機(jī)溶劑，同鹽作用相反，減少疏水作用。表面活性劑也能減少疏水作用。不同鹽增強(qiáng)疏水配基和蛋白質(zhì)之間的相互作用洗脫策略：在吸附時(shí)應(yīng)適當(dāng)增強(qiáng)鹽濃度以增強(qiáng)蛋白質(zhì)與層析劑之間的疏水作用力，洗脫可采用低濃度的鹽溶液洗脫。對(duì)于結(jié)合較強(qiáng)的蛋白質(zhì)可以在洗脫劑中添加一些溫和的有機(jī)溶劑如多元醇或表面活性劑來(lái)洗脫。疏水層析不適合在高流速下運(yùn)行去除內(nèi)毒素和DNA：核酸在高鹽條件下會(huì)和蛋白解離,利用疏水層析介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白,去除核酸。熱原含脂肪A、糖類(lèi)和蛋白，其脂肪A部份有很強(qiáng)的疏水性，但在高鹽下會(huì)凝集，無(wú)法上疏水層析。因此可利用疏水層析結(jié)合目標(biāo)蛋白而去除熱原。原理：

凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)被分離物分子大小和形狀的差異進(jìn)行分離。填料含有許多不同大小的孔，體積大的分子不能進(jìn)入體積小的孔，而體積小的物質(zhì)可進(jìn)入大孔，也可進(jìn)入小孔，因此在柱中保留的時(shí)間比體積大的物質(zhì)長(zhǎng)。整個(gè)樣品按分子量的大小順序分開(kāi)，體積最大的物質(zhì)最先出峰，體積最小的物質(zhì)最后出峰。因此，凝膠過(guò)濾層析又被形象地稱為分子篩層析。凝膠過(guò)濾層析gelchromatography

影響因素與洗脫策略：對(duì)于凝膠過(guò)濾層析，其主要影響因素有上樣體積和流動(dòng)相的鹽濃度。鹽濃度過(guò)低，會(huì)引起生物分子和介質(zhì)之間的產(chǎn)生非特異性結(jié)合，可以適量的提高流動(dòng)相的鹽濃度，一般大于。脫鹽/換液常用SephadexG-25，其最大上樣量為30%。上樣體積太大，會(huì)導(dǎo)致樣品脫鹽/換液不徹底；除多聚體或降解產(chǎn)物，根據(jù)分子量不同選擇，其最大上樣量?jī)H為2%-5%。超過(guò)上樣量會(huì)降低分辨率，導(dǎo)致目的蛋白和聚體等不能徹底分開(kāi)。經(jīng)驗(yàn)：具有3000個(gè)理論塔板的凝膠過(guò)濾可近似的將分子量相差2倍的蛋白質(zhì)完全分開(kāi)，而具有6000個(gè)理論塔板的凝膠過(guò)濾可近似的將分子量相差倍的蛋白質(zhì)完全分開(kāi)常壓的分子篩從下往上走比較好優(yōu)點(diǎn)

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以凝膠本身不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

2.凝膠層析的操作條件較溫和，不易引起生物物質(zhì)的變性，即使用來(lái)分離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞。

3.樣品得率高，重復(fù)性好。如果按比例擴(kuò)大柱的體積和高度，可進(jìn)行大量樣品的分離純化。缺點(diǎn)1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限，所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)某些溶質(zhì)分子具有吸附作用，如芳香族化合物與脂蛋白等。培訓(xùn)內(nèi)容蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理蛋白質(zhì)常規(guī)層析技術(shù)FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定FDA要求:對(duì)于用于注射用的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，純度至少要達(dá)到99.99%,而且要保證產(chǎn)品純度和活性的重現(xiàn)性;FDA要求:如果原材料中有不尋常的物質(zhì)(unusualmaterial),則生產(chǎn)者必須建立相應(yīng)的檢測(cè)方法來(lái)特異的檢測(cè)這個(gè)物質(zhì);FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定FDA認(rèn)為:電泳的單一條帶還不足以作為蛋白質(zhì)純度的證據(jù),要結(jié)合其他更靈敏