實(shí)驗(yàn)二基因表達(dá)研究的石蠟切片技術(shù)

實(shí)驗(yàn)六基因表達(dá)研究的石蠟切片技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍蠖鄶?shù)生物材料在自然狀態(tài)下是不適合顯微觀察的，也無法看到其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。生物顯微制片是組織學(xué)、胚胎學(xué)、及細(xì)胞學(xué)等學(xué)科研究觀察細(xì)胞、組織的生理、病理形態(tài)變化的一種主要方法。生物顯微制片有許多不同的方法，一般可分為非切片法與切片法兩大類。而切片法又包括石蠟切片法、冰凍切片，和電子顯微鏡觀察的超薄切片法等。石蠟切片顯微標(biāo)本的制作技術(shù)是經(jīng)過固定，脫水，透明，包埋等程序后再把材料切成較薄的片子和用不同的方法染色，以在顯微鏡下清楚地看到不同組織和細(xì)胞的形態(tài)以及其中組分的差異。經(jīng)封片處理后的石蠟切片可以進(jìn)行長期保存。本實(shí)驗(yàn)的目的是了解石蠟切片的制作技術(shù)和程序，掌握石蠟切片技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)器材、材料和試劑1、器材：切片機(jī)、展片儀、烤片機(jī)、毛筆、載玻片、蓋玻片、烤箱、刀片、恒溫箱、熔蠟爐、蠟杯、酒精燈、吸管、鑷子、包埋盒、染色缸、2、材料：胚胎或者成體組織。3、試劑及配制：二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇、石蠟、中性樹脂、蘇木精、伊紅、氨水。三、實(shí)驗(yàn)步驟石蠟切片總的技術(shù)的程序包括：取材——固定——沖洗——脫水——透明——浸蠟——包埋——切片——貼片——復(fù)水——染色——脫水——封片——鏡檢等技術(shù)程序。分述如下：1、取材：根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇相應(yīng)的材料，材料要求新鮮、準(zhǔn)確、完整，材料要避免擠壓、挫傷或者干枯等。所采集材料應(yīng)該立即放入固定劑，并編號(hào)，注明采集的詳細(xì)信息。所采取的組織塊大小要適當(dāng)，要考慮固定劑的穿透能力。一般組織學(xué)取材稍大，細(xì)胞學(xué)取材稍小，植物組織取材稍小，動(dòng)物組織取材要稍大。2、固定：胚胎或者組織被切割后，由于細(xì)胞內(nèi)酶的作用和細(xì)菌的繁殖，可導(dǎo)致組織的自溶和腐壞。因此，應(yīng)立即對(duì)所取材料進(jìn)行固定處理。固定的主要作用是：（1）防止組織自溶和腐壞而盡可能保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)；（2）使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)等各種成分沉淀下來從而保存細(xì)胞的各種組成成分；（3）因沉淀及凝固的關(guān)系，使細(xì)胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學(xué)上的差別使原來在生活情況下看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用，從而使細(xì)胞各部易于染色；（4）固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易變形，有利于操作。固定是制片極為關(guān)鍵的一個(gè)步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣除與材料的新鮮程度有關(guān)外，還取決于最初的固定是否適當(dāng)和完全。固定的方法包括（1）物理方法：干燥、高熱、低溫驟冷等；（2）化學(xué)方法：化學(xué)試劑配制成固定液使之固定，常有酒精、福爾馬林、醋酸、苦味酸等。固定的注意事項(xiàng)：（1）固定的材料越新鮮越好；（2）材料大小以直徑不超過5mm為宜，材料與固定液比例為1：20；（3）根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液；（4）固定時(shí)，要防止材料變形；（5）材料投入固定液后，須經(jīng)常搖晃；（7）容器外需貼標(biāo)簽。3、沖洗：材料固定后，藥劑繼續(xù)留在組織中，易使組織破壞，必須用水或酒精洗去。4、脫水：脫水是用一種即能與水又能與透明液混合的液體來逐漸脫去樣品中游離的水。現(xiàn)采用的脫水劑一般是丙酮或乙醇來進(jìn)行梯度脫水，脫水的時(shí)間可根據(jù)組織的類型大小而定。脫水一般是將材料依次按下列順序放入脫水溶液中處理各10min：30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%→100%→100%。脫水應(yīng)該逐步而不應(yīng)跨越太大，否則將引起組織強(qiáng)烈的收縮或變形，在經(jīng)無水乙醇處理時(shí)，應(yīng)保證試劑的純度。5、透明：透明是用一種既能與乙醇又能與包埋介質(zhì)互溶的液體來置換樣品中的乙醇，從而為最終的包埋創(chuàng)造一個(gè)有利的條件?，F(xiàn)在采用的透明劑一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。透明的過程依次在1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯各處理15min。二甲苯是使用最為廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強(qiáng)，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊大小及質(zhì)地酌情而定。6、浸蠟：將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，不斷的提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換了組織塊中的透明劑，便于今后的包埋和切片。石蠟有液態(tài)與固態(tài)兩種狀態(tài)，透蠟要在恒定溫箱（60℃7、包埋：樣品經(jīng)過石蠟浸透后，其內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，此時(shí)還需要用同種硬度的石蠟包埋成蠟塊以利于后邊的切片，包埋可用相同的器具，也可以折疊一牛皮紙盒（圖6-1）。將液態(tài)石蠟緩緩倒入紙盒中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒中，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。至此，一塊組織已完成前處理過程，可以切片。由于生物材料的個(gè)體差異，化學(xué)試劑的多樣性，因此操作技術(shù)相當(dāng)細(xì)致而煩雜，方法也很多，每一步驟的失誤都可導(dǎo)致整體的失敗，因此需要耐心細(xì)致，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，多加練習(xí)，才能取得較好的結(jié)果。圖6-1石蠟包埋紙盒的制作示意圖圖6-2固定的蠟塊樣品及切片機(jī)8、切片：切片包括修塊，固著，切片等過程，分述如下：（1）修塊：切片前需要修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。（2）固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺(tái)上，以便于固定在切片機(jī)上。（3）切片：調(diào)整蠟塊組織切片恰好與刀口接觸，旋緊刀架，根據(jù)需要調(diào)整切片厚度，一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)，切片的蠟片連成一條長蠟帶。切下的蠟帶放在一干凈紙上。切片的厚度一般為6-10um。9、貼片：將切好的蠟帶光面向下用毛筆挑起，輕放于干燥潔凈的紙上，用小刀根據(jù)需要切成數(shù)段，用毛筆挑起輕放于37℃展片機(jī)水浴中，待蠟帶充分展開后，用載玻片從底部向上撈起蠟帶，每張載玻片可放置數(shù)條蠟帶。在恒溫烤片機(jī)上，37℃10、復(fù)水：在染色之前需要先將蠟帶上石蠟去除，因此必須先用二甲苯去除石蠟再用酒精去除二甲苯，再進(jìn)入水中才能染色。處理步驟為：100%二甲苯5min；100%二甲苯5min；無水乙醇2min；無水乙醇2min；95%乙醇2min；70%乙醇2min；去離子水2min；去離子水2min。11、染色：染色的方法很多，要根據(jù)每張標(biāo)本要求顯示的目的選擇不同的染劑，最常用的是蘇木精，伊紅染色。蘇木精使細(xì)胞核顯深紫色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)顯粉紅色，以此顯示清晰的細(xì)胞形態(tài)和核的大小，位置。處理步驟為：將上述玻片放于10%伊紅染液中，染色約30s，若染色過重，可用95%乙醇稀釋染液，或縮短染色時(shí)間。12、脫水：染色后將切片樣品依次放入100%乙醇2min；100%乙醇2min；100%二甲苯2min；100%二甲苯2min中進(jìn)行脫水處理。13、封片：將完成制片全過程的組織材料用封藏劑封固以便長期保存。一般用中性樹脂封片。14、鏡檢：封片好后干燥、鏡檢、貼標(biāo)簽，拍照。作業(yè)：拍攝所做材料的石蠟切片照片。附錄：蘇木精和伊紅染料的配制蘇木精染液：蘇木精（2g），冰醋酸（10ml），甘油（100ml），95%酒精（100ml），蒸餾水（100ml），硫酸鋁鉀（5g）配制步驟：1.將蘇木精溶于少量酒精中，加冰醋酸后攪拌，加速其溶解；2.加入甘油及其余酒精；3.研碎鉀礬，溶于水中并加溫；4.將加溫的鉀礬溶液一滴滴地加入染色劑中，并不斷攪動(dòng)；5.瓶口用雙層紗布包扎，放于通風(fēng)處，并經(jīng)常搖動(dòng)，直到顏色變?yōu)樽霞t時(shí)即可使用，成熟時(shí)間約需2-4周以致數(shù)月之久，若加0.2g碘酸鈉即可立即成熟。已成熟的原液，須用瓶塞密封，置低溫暗處長期保存。使用時(shí)以原液1份加入50%酒精與冰醋酸等量混合液1份或2份即可。伊紅染液：（1）水溶性伊紅染液伊紅