【教學(xué)課件】第2節(jié) 動物細胞工程 示范課件1

第2節(jié)

動物細胞工程第1課時

第2章

細胞工程新課引入

在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個細胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚？新課引入

動物細胞融合動物細胞培養(yǎng)動物體細胞核移植動物細胞工程基礎(chǔ)一、動物細胞培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)是指從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成___________，然后在適宜的培養(yǎng)條件下，讓這些細胞_______和______的技術(shù)。（一）概念單個細胞生長增殖充足的營養(yǎng)

糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等相對穩(wěn)定的環(huán)境條件

溫度（37℃）

pH（7.35~7.45）

滲透壓（血漿滲透壓為770KPa）一、動物細胞培養(yǎng)內(nèi)環(huán)境為體內(nèi)細胞生存提供了哪些適宜的條件？（二）培養(yǎng)條件回顧一、動物細胞培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)是在體外模擬體內(nèi)的生理條件進行的培養(yǎng)。你認為體外培養(yǎng)動物細胞需要哪些條件？（二）培養(yǎng)條件應(yīng)用一、動物細胞培養(yǎng)（二）培養(yǎng)條件1．營養(yǎng)

培養(yǎng)基中應(yīng)含有細胞所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)。如葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、促生長因子、微量元素等。

另外還需加入動物血清等天然成分。

將細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按種類和所需量嚴格配制而成的培養(yǎng)基，稱為合成培養(yǎng)基。培養(yǎng)動物細胞一般使用液體培養(yǎng)基，稱為培養(yǎng)液。一、動物細胞培養(yǎng)（二）培養(yǎng)條件血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等物質(zhì)。動物細胞本身不能合成必需氨基酸，必須由培養(yǎng)液提供。血清有多種激素及生長因子，還含有多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進細胞的生長、增殖和貼附。

因此，在使用合成培養(yǎng)基時，通常會加入動物血清等天然成分。思考1為什么對動物細胞進行培養(yǎng)時通常要添加血清？一、動物細胞培養(yǎng)（二）培養(yǎng)條件2．無菌、無毒的環(huán)境①培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具滅菌處理，無菌操作。②添加一定量的抗生素。③定期更換培養(yǎng)液，防止代謝物積累傷害細胞。一、動物細胞培養(yǎng)（二）培養(yǎng)條件3．溫度、pH和滲透壓哺乳動物細胞培養(yǎng)溫度為36.5±0.5℃pH

7.2～7.4需考慮滲透壓因素一、動物細胞培養(yǎng)（二）培養(yǎng)條件4．氣體環(huán)境

加入95%空氣和5%CO2為什么還要加入5%的CO2呢？——CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。另外，細胞培養(yǎng)時，通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶中，放置在CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。二、動物細胞培養(yǎng)的過程思考1

動物細胞培養(yǎng)的具體過程？二、動物細胞培養(yǎng)的過程思考動物細胞培養(yǎng)的原理是什么？細胞增殖2獲取動物組織制備細胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)收集細胞二、動物細胞培養(yǎng)的過程思考3

幼齡動物的細胞與老齡動物的細胞比較，分化程度低的細胞與分化程度高的細胞比較，哪些細胞更易于培養(yǎng)，為什么？

細胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)。幼齡動物的細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物的細胞則相反。因此，幼齡動物的細胞比老齡動物的細胞易于培養(yǎng)。分化程度越低的細胞，增殖能力越強，越容易培養(yǎng)。二、動物細胞培養(yǎng)的過程思考4

為什么要制備細胞懸液？如何處理？獲取動物組織制備細胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)收集細胞

因為成塊的組織，細胞與細胞靠在一起，彼此限制了生長和增殖。處理時，或用機械方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理。二、動物細胞培養(yǎng)的過程思考5

使用胰蛋白酶分散細胞，這說明細胞間主要是什么成分？

用胃蛋白酶行嗎？細胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。

胃蛋白酶作用的適宜pH值約為2，隨pH值增大，胃蛋白酶活性降低，當(dāng)pH大于6時，胃蛋白酶會失去活性。多數(shù)細胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2~7.4，在此環(huán)境下，胃蛋白酶沒有活性，故不能使用。二、動物細胞培養(yǎng)的過程思考6

什么是細胞貼壁？原代培養(yǎng)？為什么進行傳代培養(yǎng)？

大多數(shù)細胞需要貼附于某些基質(zhì)表面才會生長增殖，稱為細胞貼壁。

人們通常將動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

貼壁細胞生長到表面相互接觸時會停止分裂增殖。稱為接觸抑制現(xiàn)象。懸浮培養(yǎng)的細胞也會因細胞密度過大、有害代謝物積累和培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素而分裂受阻。所以要進行分瓶培養(yǎng)。將分瓶后的細胞培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。二、動物細胞培養(yǎng)的過程思考7

如何收集細胞？懸浮培養(yǎng)的細胞:離心法收集細胞貼壁細胞:胰蛋白酶

處理分散成單個細胞

離心法收集細胞二、動物細胞培養(yǎng)的過程獲取動物組織制備細胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)收集細胞幼齡動物的細胞機械方法胰蛋白酶膠原蛋白酶細胞特點：一類細胞：懸浮生長大多數(shù)細胞：貼壁生長、接觸抑制懸浮細胞離心法收集貼壁細胞先用

胰蛋白酶處理總結(jié)二、動物細胞培養(yǎng)的過程總結(jié)動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)有什么不同之處？內(nèi)容植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理細胞的全能性細胞增殖培養(yǎng)基類型固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基成分蔗糖、植物激素葡萄糖、動物血清環(huán)境條件22℃（菊花為例）pH6.0左右，后期需要光照37℃（哺乳動物細胞）pH7.2左右，不需要光照培養(yǎng)過程離體器官、組織或細胞

脫分化愈傷組織

再分化根、芽

植物體幼齡動物組織

胰蛋白酶

單個細胞

原代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用特點：具有自我更新的能力

具有分化成其他類型細胞的潛能存在部位：存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中。類型：胚胎干細胞和成體干細胞（一）干細胞三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用分布特點研究成果（二）胚胎干細胞1981年，科學(xué)家首次分離得到小鼠ES細胞，目前科學(xué)家已經(jīng)分離了兔、牛、猴和人的ES細胞，并證明了ES細胞可以在體外分化成心肌細胞、神經(jīng)元和造血干細胞等細胞。

早期胚胎

具有分化成成年動物體內(nèi)的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用分布特點

應(yīng)用（三）成體干細胞

將正常造血干細胞移植體內(nèi)，恢復(fù)病人造血和免疫功能，神經(jīng)干細胞在治療神經(jīng)組織和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。ㄈ缗两鹕?、阿爾茲海默?。┑确矫嬗兄匾膽?yīng)用價值。

成體組織或器官內(nèi)，包括造血干細胞（骨髓）、神經(jīng)干細胞（神經(jīng)系統(tǒng)）、精原干細胞（睪丸）

具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用

資料1：胚胎干細胞由于存在于早期胚胎中，因此必須從胚胎中獲取，由于涉及倫理問題，限制了它在醫(yī)學(xué)上的功能。（四）iPS細胞三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用（四）iPS細胞

資料2：2006年，科學(xué)家借助載體將4個特定基因?qū)胄∈蟪衫w維細胞中，獲得類似胚胎干細胞的細胞，稱為誘導(dǎo)多能干細胞（iPS細胞）。

目前科學(xué)家已嘗試采用多種方法來制備iPS細胞，除借助載體將特定基因?qū)爰毎校€會直接將特定蛋白導(dǎo)入細胞中或者用小分子化合物等來誘導(dǎo)形成iPS細胞。另外，iPS細胞最初由成纖維細胞轉(zhuǎn)化而來，后來發(fā)現(xiàn)已分化的T細胞、B細胞等也能被誘導(dǎo)成iPS細胞。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用（四）iPS細胞

資料3：科學(xué)家相繼利用iPS細胞培育出心臟細胞、血液細胞、角膜細胞、神經(jīng)細胞等。

2009年，我國科學(xué)家首次利用iPS細胞克隆出活體實驗鼠，證實iPS細胞與胚胎干細胞一樣具有全能性，能發(fā)育成一個完整的生命體。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用（四）iPS細胞

資料4：科學(xué)家應(yīng)用iPS細胞治療了小鼠的鐮狀細胞貧血，用iPS細胞治療阿爾茨海默病、心血管疾病等領(lǐng)域的研究有了新進展。

2019年7月，全球首例利用iPS細胞培養(yǎng)出的角膜組織移植手術(shù)順利完成，術(shù)后患者視力有所改善，研究小組將用一年時間跟蹤觀察移植的安全性和進展。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用（四）iPS細胞

資料5：iPS細胞在誘導(dǎo)過程中無須破壞胚胎，iPS細胞可來源于病人自身的體細胞，將其移植回人體后，可避免免疫排斥反應(yīng)。所以科學(xué)家認為iPS細胞的應(yīng)用前景優(yōu)于胚胎干細胞。但在臨床治療中還面臨一些問題，如存在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的風(fēng)險。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用（四）iPS細胞

科學(xué)家是怎樣獲得iPS細胞的？

iPS細胞的優(yōu)勢為：無須破壞胚胎，不涉及倫理問題，同時取自病人自身體細胞，可避免免疫排斥反應(yīng)。這種細胞與胚胎干細胞相比，有哪些應(yīng)用優(yōu)勢？通過借助載體將基因?qū)胍呀?jīng)高度分化的細胞中，或是直接將蛋白質(zhì)導(dǎo)入細胞中或者用小分子化合物等來誘導(dǎo)形成iPS細胞。三、干細胞培養(yǎng)及其應(yīng)用（四）iPS細胞

課堂小結(jié)動物細胞培養(yǎng)干細胞培養(yǎng)及應(yīng)用培養(yǎng)條件培養(yǎng)過程iPS細胞的培養(yǎng)和應(yīng)用營養(yǎng)無菌、無毒環(huán)境溫度、pH和滲透壓氣體環(huán)境制備單個細胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)1．作為動物細胞工程常用技術(shù)手段的基礎(chǔ)是（

）A．動物細胞培養(yǎng)B．動物細胞融合

C．單克隆抗體D．動物細胞核移植課堂檢測A2．為使用于培養(yǎng)的動物組織細胞分散開以便配制成一定濃度的細胞懸液，選取的動物組織應(yīng)選用下列哪種物質(zhì)處理（

）A．胃蛋白酶

B．胰蛋白酶

C．鹽酸

D．胰脂肪酶課堂檢測B3．在動物細胞培養(yǎng)過程中，下列處理不合適的是（

）A．培養(yǎng)液和培養(yǎng)用具要進行無菌處理

B．提供