DB15T 2690-2022青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSICS65.020.01CCSB25內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB15/T2690—2022青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏技術(shù)規(guī)程TechnicalprotocolforisolationandpreservationoflacticacidTechnicalprotocolforisolationandpreservationoflacticacidbacteriastrainsinsilage2022-07-152022-08-15內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC19）歸口。青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏技術(shù)規(guī)程范圍本文件適用于青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏。（GB/T4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB20287農(nóng)用微生物菌劑SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則3術(shù)語和定義3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4基本原則應(yīng)針對(duì)菌種的生物學(xué)性狀選擇分離與保藏方法。應(yīng)使分離和保藏的菌種不染雜菌，使退化和死亡降到最低限度。應(yīng)保證菌種分離和保藏的安全性，不能對(duì)周圍環(huán)境造成污染和危害。5設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱：5℃～60℃。厭氧培養(yǎng)裝置：5℃～60℃。振蕩器：往復(fù)式。冰箱：4℃冰箱、超低溫冰箱（-50℃～-86℃）。分析天平：感量0.001g。光學(xué)顯微鏡：4×～100×。均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。水浴鍋：0℃～100℃。超凈工作臺(tái)。試劑MRS。8.5g1000mL12130min。GB/T6682菌液制備以無菌操作稱取10g樣品置于盛有90mL無菌生理鹽水的聚乙烯均質(zhì)袋內(nèi)，用拍打式無菌均質(zhì)器拍打2min，制成1：10的樣品菌液。菌液稀釋用1mL（1:1019mL1→101→1×1011→1×102、1→1×103、1→1×104，1→1×105（）。菌種培養(yǎng)按照GB20287規(guī)定制備瓊脂培養(yǎng)基，于高壓滅菌鍋滅菌后備用。選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品菌液（20μL20μL3072h）。乳酸菌的分離與純化1～2于MRS30℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h～72h1。乳酸菌的篩選將分離純化的乳酸菌菌液混勻并提取其懸液以6%的濃度接種至MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)（37℃）24h，期間每2h用紫外可見分光光度計(jì)測其在波長620nm的OD值，每個(gè)菌種均重復(fù)3次，最終將測定結(jié)果繪制生長曲線。3.0pH=6.5MRS（37℃培養(yǎng)24h2用pHpH3%MRS44℃培養(yǎng)10d，10℃與30℃培養(yǎng)3d，45℃培養(yǎng)7pH以及濃度為3.0%和6.5%NaCl的MRS30℃培養(yǎng)48620nmD0.小于D.，生長：0.5小于OD值小于0.1OD值小于0.2OD值大于1.0）493圖1菌種分離及篩選程序BCA.2制法A.2制法100H至6.±01115in。附錄A（）A.1MRS乳酸菌培養(yǎng)基見表A.1。表A.1乳酸菌培養(yǎng)基成分組成稱取量蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐溫801.0mLK2HPO4?7H2O2.0g醋酸鈉?3H2O5.0g檸檬酸三銨2.0gMgSO4?7H2O0.2gMnSO4?4H2O0.05g附錄B（）本方法廣泛適用于細(xì)菌、放線菌、真菌等的短期保藏。原料））按照GB/T4789.28和SN/T1538.1執(zhí)行。接種點(diǎn)接（）。用接種環(huán)從斜面中部自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。用接種環(huán)從斜面底部自下而上劃稀“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。之”用接種鏟挖取菌絲體連同少量瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。（）挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)30℃～38培養(yǎng)好的菌種于4℃～6℃保藏，有些菌種（如：部分弧菌、假單胞菌等）4℃～6℃容易死亡，適于25℃室溫保藏。培養(yǎng)好的菌種于4℃～6℃保藏，有些菌種（如：部分弧菌、假單胞菌等）4℃～6℃容易死亡，適于25℃室溫保藏。通常相對(duì)濕度為50%～70%。B.4.5定期移植1～24～6（1～330～38附錄C（）本方法適用于大多數(shù)需要長期保藏的細(xì)菌、真菌、放線菌、病毒等。原理60將2.0mL凍存管（圓底硼硅玻璃安瓶管或螺旋式塑料管）清洗干凈，121℃高壓滅菌15min～20min，備用。也可使用商品化的菌種保藏管。注意凍存管不能有裂紋。保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物的類別選擇，一般采用無菌的10%～20%甘油或脫脂奶粉，或10%二甲亞砜。5mm～10mm），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)；1.2mm～2mm2d～10d將含菌種的凍存管插入保