【課件】核酸檢測(cè)培訓(xùn)版

核酸檢測(cè)北京萬泰研發(fā)中心2010.04.12

核酸檢測(cè)北京萬泰研發(fā)中心主要內(nèi)容

為什么要做核酸檢測(cè)？核酸是什么？怎樣進(jìn)行核酸檢測(cè)？市場(chǎng)狀況主要內(nèi)容為什么要做核酸檢測(cè)？為什么要做核酸檢測(cè)？為什么要做核酸檢測(cè)？核酸檢測(cè)（基因檢測(cè)）

現(xiàn)知人類的疾病都與基因有直接或間接的關(guān)系。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室所要檢測(cè)和分析的核酸既包括人體本身的基因(DNA)以及反映基因轉(zhuǎn)錄水平的mRNA,也包括侵入人體的致病微生物等所攜帶的外源性基因(DNA/RNA)。

核酸檢測(cè)（基因檢測(cè)）傳統(tǒng)檢測(cè)試劑（酶免ELISA）技術(shù)特點(diǎn)：

檢測(cè)目標(biāo)為蛋白,所檢測(cè)的主要是疾病所引發(fā)的人體抗體而不是病原體本身,是一種間接、滯后的檢測(cè)方式。易操作，成本低。固有不足：不能夠消除對(duì)“窗口期”標(biāo)本(抗體陰性,核酸陽性)的漏檢難于檢測(cè)病原體的不同亞型及突變型不典型血清陽轉(zhuǎn)對(duì)免疫逃避或免疫沉寂的標(biāo)本產(chǎn)生漏檢傳統(tǒng)檢測(cè)試劑（酶免ELISA）技術(shù)特點(diǎn)：核酸檢測(cè)顯著縮短窗口期:HIV窗口期縮短45%，HCV縮短89%，HBV縮短50%。提高靈敏度:理論上擴(kuò)增體系中單拷貝的模板也能被檢測(cè)出。特異性好:使用熒光探針技術(shù)的PCR檢測(cè)，幾乎沒有方法學(xué)的假陽性。直接揭示病原體的存在對(duì)操作者及檢測(cè)環(huán)境的要求較高檢測(cè)成本相對(duì)較高核酸檢測(cè)顯著縮短窗口期:HIV窗口期縮短45%，HCV縮輸血中可傳染病原體的“窗口期”病毒種類ELISA檢測(cè)項(xiàng)目窗口期HCV抗-HCV2.0/3.0EIA

8-10周HIV抗-HIV-1/2EIAandHIV-1抗原EIA

2-4周HBVHBVsAgEIAandHBVcAgEIA

6-8周HTLV抗-HTLVI/IIEIA

8-10周CMV抗-CMVEIA

3-5周輸血中可傳染病原體的“窗口期”病毒種類ELISA檢測(cè)項(xiàng)目窗口窗口期檢測(cè)率國家或地區(qū)HBVHCVHIV加拿大1:153000(~1/15萬)1:2300000(~1/230萬)1:7800000(~1/780萬)法國1:640000(~1/64萬)1:10000000(~1/1000萬)1:3150000(~1/315萬)德國1:230000(~1/23萬)1:670000(~1/67萬)1:2770000(~1/277萬)日本（50混）1:51988(~1/5.2萬)1:348091(~1/35萬)1:2668696(~1/267萬)美國（24混）1:180000(~1/18萬)1:230000(~1/23萬)12:37164054(~1/309萬)香港1:32786(~1/3.3萬)1:5456(~1/0.5萬)1:222(~1/0.02萬)窗口期檢測(cè)率國家或地區(qū)HBVHCVHIV加拿大1:15300核酸檢測(cè)在臨床診斷中的應(yīng)用定性診斷

血液篩查病原體篩查診斷SNP和耐藥突變?cè)\斷基因型分型遺傳病診斷個(gè)體用藥診斷基因鑒定和配型……………定量檢測(cè)病情的評(píng)估和預(yù)后判斷抗病毒藥物療效的觀察新藥驗(yàn)證癌基因表達(dá)差異……………核酸檢測(cè)在臨床診斷中的應(yīng)用定性診斷定量檢測(cè)核酸是什么？

核酸是什么？核酸（NucleicAcid）是一種主要位于細(xì)胞核內(nèi)的生物大分子，其充當(dāng)著生物體遺傳信息的攜帶和傳遞。核酸廣泛存在于所有動(dòng)物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近2000種遺傳性疾病都和DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)。腫瘤的發(fā)生、病毒的感染、射線對(duì)機(jī)體的作用等都與核酸有關(guān)。核酸（NucleicAcid）是一種主要位于細(xì)胞核內(nèi)的生物核酸分類：DNA、RNA；DNA：dATP（A）、dTTP（T）、dCTP（C）、dGTP（G）；RNA：ATP、UTP、CTP、GTP；3’5’磷酸鍵核酸分類：DNA、RNA；DNA結(jié)構(gòu)單鏈DNA形成雙鏈的原則—

堿基互補(bǔ)配對(duì)：G-CT-A外部為磷酸和戊糖形成 的骨架內(nèi)部為堿基互補(bǔ)形成的 共價(jià)結(jié)合區(qū)域螺旋結(jié)構(gòu)DNA結(jié)構(gòu)單鏈DNA形成雙鏈的原則—外部為磷酸和戊糖形成核酸在體內(nèi)的復(fù)制核酸在體內(nèi)的復(fù)制DNA的熱變性DNA受熱，會(huì)解開雙鏈互補(bǔ)狀態(tài)，形成單鏈；降溫會(huì)恢復(fù)雙鏈狀態(tài)DNA的熱變性DNA受熱，會(huì)解開雙鏈互補(bǔ)狀態(tài)，形成單鏈；降溫怎樣進(jìn)行核酸檢測(cè)？怎樣進(jìn)行核酸檢測(cè)？核酸檢測(cè)的一般流程核酸樣品的制備：

從血液、體液、組織中提取或PCR擴(kuò)增樣品的檢測(cè)：

核酸雜交、PCR、熒光定量PCR、PCR-ELISA等結(jié)果判讀：

電泳、膜、熒光定量PCR儀等核酸檢測(cè)的一般流程核酸樣品的制備：核酸雜交核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測(cè)樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southernblothybridization）和RNA印跡雜交（Northernblothybridization）。核酸雜交核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小核酸提取PCR擴(kuò)增探針點(diǎn)膜交聯(lián)雜交顯色結(jié)果判讀核酸提取PCR擴(kuò)增探針點(diǎn)膜交聯(lián)雜交顯色結(jié)果判讀PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。DNA的復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainRePCR的產(chǎn)生PCR的產(chǎn)生實(shí)時(shí)熒光PCR

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行分析的方法,可以進(jìn)行定量和定性檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR在PCR反應(yīng)體系中加入【課件】核酸檢測(cè)培訓(xùn)版【課件】核酸檢測(cè)培訓(xùn)版熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光【課件】核酸檢測(cè)培訓(xùn)版

熒光定量PCR標(biāo)記方法

內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)

熒光定量PCR標(biāo)記方法

內(nèi)摻式染料

SYBRGREEN雙探針雜交分子信標(biāo)Taqman引物特異探針性質(zhì)可逆熒光積累熒光熔點(diǎn)分析能不能特異性引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響）引物＋2探針引物＋探針引物＋探針引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響）探針無有有有無通用性通用專用專用專用專用探針特點(diǎn)SYBR雙探針分子Taqman引物特異性質(zhì)可逆熒光積SYBRGreen融解曲線分析

SYBRGreen融解曲線分析

SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對(duì)DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便--不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)TaqMan探針法

TaqMan探針法

TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)

TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)

【課件】核酸檢測(cè)培訓(xùn)版市場(chǎng)狀況市場(chǎng)狀況生產(chǎn)廠家檢測(cè)項(xiàng)目使用技術(shù)使用儀器達(dá)安基因HBV、HIV、HCV、HPV、TB、HCMV、淋球菌、解脲脲原體、肺炎支原體、沙眼衣原體、單純皰疹病毒Ⅱ型、ɑ－地中海貧血、缺失型β-地中海貧血、淋球菌、血篩試劑PCR熒光探針法PCR-反向點(diǎn)雜交法熒光定量PCR儀PCR儀上?？迫AHBV、HCV、新型冠狀病毒、血篩試劑PCR熒光探針法PCR-酶免熒光定量PCR儀酶免相關(guān)儀器匹基HBV、HIV、HPV、TB、HCV、沙眼衣原體、新型冠狀病毒PCR熒光探針法熒光定量PCR儀上海華美HBV、HCV、TB、沙眼衣原體、新型冠狀病毒PCR熒光探針法熒光定量PCR儀上?？寺BV、TB、HPVPCR熒光探針法熒光定量PCR儀凱普、港龍以HPV檢測(cè)為主。浩源血篩試劑已進(jìn)入審批階段。羅氏、生物梅里埃公司有HIV檢測(cè)試劑盒，均以各自公司的專利技術(shù)為主研發(fā)。生產(chǎn)廠家檢測(cè)項(xiàng)目使用技術(shù)使用儀器達(dá)安基因HBV、HIV、HC現(xiàn)狀和趨勢(shì)1、現(xiàn)狀：公司多、競(jìng)爭(zhēng)激烈、同質(zhì)化；手工操作為主；缺乏規(guī)范；核心技術(shù)少；2、趨勢(shì)：管理部門逐漸加強(qiáng)管理，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制訂中；進(jìn)口試劑以全自動(dòng)診斷平臺(tái)為主在國內(nèi)推廣，國內(nèi)廠家漸進(jìn)推出自動(dòng)化核酸提取儀器進(jìn)入市場(chǎng)；現(xiàn)狀和趨勢(shì)1、現(xiàn)狀：公司多、競(jìng)爭(zhēng)激烈、同質(zhì)化；手工操作為主；實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的難點(diǎn)1、大規(guī)模適合自動(dòng)化核酸提取的樣品制備技術(shù)2、適合篩查應(yīng)用的多重PCR技術(shù)3、高通量全自動(dòng)的核酸提取設(shè)備和耗材4、高通量檢測(cè)設(shè)備和配套耗材的成本控制5、質(zhì)量控制和質(zhì)量管理方法6、核心原料的成本控制實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的難點(diǎn)1、大規(guī)模適合自動(dòng)化核酸提取的樣品制試劑質(zhì)量控制方法1、實(shí)驗(yàn)室分類和功能化2、人員培訓(xùn)和自我約束3、建立切實(shí)可行的質(zhì)量控制方法和管理體系試劑質(zhì)量控制方法1、實(shí)驗(yàn)室分類和功能化謝謝大家！謝謝大家！

核酸檢測(cè)北京萬泰研發(fā)中心2010.04.12

核酸檢測(cè)北京萬泰研發(fā)中心主要內(nèi)容

為什么要做核酸檢測(cè)？核酸是什么？怎樣進(jìn)行核酸檢測(cè)？市場(chǎng)狀況主要內(nèi)容為什么要做核酸檢測(cè)？為什么要做核酸檢測(cè)？為什么要做核酸檢測(cè)？核酸檢測(cè)（基因檢測(cè)）

現(xiàn)知人類的疾病都與基因有直接或間接的關(guān)系。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室所要檢測(cè)和分析的核酸既包括人體本身的基因(DNA)以及反映基因轉(zhuǎn)錄水平的mRNA,也包括侵入人體的致病微生物等所攜帶的外源性基因(DNA/RNA)。

核酸檢測(cè)（基因檢測(cè)）傳統(tǒng)檢測(cè)試劑（酶免ELISA）技術(shù)特點(diǎn)：

檢測(cè)目標(biāo)為蛋白,所檢測(cè)的主要是疾病所引發(fā)的人體抗體而不是病原體本身,是一種間接、滯后的檢測(cè)方式。易操作，成本低。固有不足：不能夠消除對(duì)“窗口期”標(biāo)本(抗體陰性,核酸陽性)的漏檢難于檢測(cè)病原體的不同亞型及突變型不典型血清陽轉(zhuǎn)對(duì)免疫逃避或免疫沉寂的標(biāo)本產(chǎn)生漏檢傳統(tǒng)檢測(cè)試劑（酶免ELISA）技術(shù)特點(diǎn)：核酸檢測(cè)顯著縮短窗口期:HIV窗口期縮短45%，HCV縮短89%，HBV縮短50%。提高靈敏度:理論上擴(kuò)增體系中單拷貝的模板也能被檢測(cè)出。特異性好:使用熒光探針技術(shù)的PCR檢測(cè)，幾乎沒有方法學(xué)的假陽性。直接揭示病原體的存在對(duì)操作者及檢測(cè)環(huán)境的要求較高檢測(cè)成本相對(duì)較高核酸檢測(cè)顯著縮短窗口期:HIV窗口期縮短45%，HCV縮輸血中可傳染病原體的“窗口期”病毒種類ELISA檢測(cè)項(xiàng)目窗口期HCV抗-HCV2.0/3.0EIA

8-10周HIV抗-HIV-1/2EIAandHIV-1抗原EIA

2-4周HBVHBVsAgEIAandHBVcAgEIA

6-8周HTLV抗-HTLVI/IIEIA

8-10周CMV抗-CMVEIA

3-5周輸血中可傳染病原體的“窗口期”病毒種類ELISA檢測(cè)項(xiàng)目窗口窗口期檢測(cè)率國家或地區(qū)HBVHCVHIV加拿大1:153000(~1/15萬)1:2300000(~1/230萬)1:7800000(~1/780萬)法國1:640000(~1/64萬)1:10000000(~1/1000萬)1:3150000(~1/315萬)德國1:230000(~1/23萬)1:670000(~1/67萬)1:2770000(~1/277萬)日本（50混）1:51988(~1/5.2萬)1:348091(~1/35萬)1:2668696(~1/267萬)美國（24混）1:180000(~1/18萬)1:230000(~1/23萬)12:37164054(~1/309萬)香港1:32786(~1/3.3萬)1:5456(~1/0.5萬)1:222(~1/0.02萬)窗口期檢測(cè)率國家或地區(qū)HBVHCVHIV加拿大1:15300核酸檢測(cè)在臨床診斷中的應(yīng)用定性診斷

血液篩查病原體篩查診斷SNP和耐藥突變?cè)\斷基因型分型遺傳病診斷個(gè)體用藥診斷基因鑒定和配型……………定量檢測(cè)病情的評(píng)估和預(yù)后判斷抗病毒藥物療效的觀察新藥驗(yàn)證癌基因表達(dá)差異……………核酸檢測(cè)在臨床診斷中的應(yīng)用定性診斷定量檢測(cè)核酸是什么？

核酸是什么？核酸（NucleicAcid）是一種主要位于細(xì)胞核內(nèi)的生物大分子，其充當(dāng)著生物體遺傳信息的攜帶和傳遞。核酸廣泛存在于所有動(dòng)物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近2000種遺傳性疾病都和DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)。腫瘤的發(fā)生、病毒的感染、射線對(duì)機(jī)體的作用等都與核酸有關(guān)。核酸（NucleicAcid）是一種主要位于細(xì)胞核內(nèi)的生物核酸分類：DNA、RNA；DNA：dATP（A）、dTTP（T）、dCTP（C）、dGTP（G）；RNA：ATP、UTP、CTP、GTP；3’5’磷酸鍵核酸分類：DNA、RNA；DNA結(jié)構(gòu)單鏈DNA形成雙鏈的原則—

堿基互補(bǔ)配對(duì)：G-CT-A外部為磷酸和戊糖形成 的骨架內(nèi)部為堿基互補(bǔ)形成的 共價(jià)結(jié)合區(qū)域螺旋結(jié)構(gòu)DNA結(jié)構(gòu)單鏈DNA形成雙鏈的原則—外部為磷酸和戊糖形成核酸在體內(nèi)的復(fù)制核酸在體內(nèi)的復(fù)制DNA的熱變性DNA受熱，會(huì)解開雙鏈互補(bǔ)狀態(tài)，形成單鏈；降溫會(huì)恢復(fù)雙鏈狀態(tài)DNA的熱變性DNA受熱，會(huì)解開雙鏈互補(bǔ)狀態(tài)，形成單鏈；降溫怎樣進(jìn)行核酸檢測(cè)？怎樣進(jìn)行核酸檢測(cè)？核酸檢測(cè)的一般流程核酸樣品的制備：

從血液、體液、組織中提取或PCR擴(kuò)增樣品的檢測(cè)：

核酸雜交、PCR、熒光定量PCR、PCR-ELISA等結(jié)果判讀：

電泳、膜、熒光定量PCR儀等核酸檢測(cè)的一般流程核酸樣品的制備：核酸雜交核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測(cè)樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southernblothybridization）和RNA印跡雜交（Northernblothybridization）。核酸雜交核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小核酸提取PCR擴(kuò)增探針點(diǎn)膜交聯(lián)雜交顯色結(jié)果判讀核酸提取PCR擴(kuò)增探針點(diǎn)膜交聯(lián)雜交顯色結(jié)果判讀PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。DNA的復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainRePCR的產(chǎn)生PCR的產(chǎn)生實(shí)時(shí)熒光PCR

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行分析的方法,可以進(jìn)行定量和定性檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR在PCR反應(yīng)體系中加入【課件】核酸檢測(cè)培訓(xùn)版【課件】核酸檢測(cè)培訓(xùn)版熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光【課件】核酸檢測(cè)培訓(xùn)版

熒光定量PCR標(biāo)記方法

內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)

熒光定量PCR標(biāo)記方法

內(nèi)摻式染料

SYBRGREEN雙探針雜交分子信標(biāo)Taqman引物特異探針性質(zhì)可逆熒光積累熒光熔點(diǎn)分析能不能特異性引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響）引物＋2探針引物＋探針引物＋探針引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響）探針無有有有無通用性通用專用專用專用專用探針特點(diǎn)SYBR雙探針分子Taqman引物特異性質(zhì)可逆熒光積SYBRGreen融解曲線分析

SYBRGreen融解曲線分析

SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對(duì)DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便--不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)