基因擴增實驗室建設

2018-5-14?

臨床基因擴增檢驗實驗室發(fā)展及現(xiàn)狀臨床基因擴增實驗室建設和驗收山東省立醫(yī)院檢驗部

張炳昌臨床分子診斷發(fā)展歷程：幾個里程碑臨床基因擴增檢驗實驗室發(fā)展及現(xiàn)狀?

1953年:DNA雙股螺旋的發(fā)現(xiàn)?

1963年:放射免疫測定技術、核酸測序方法?

1972~1973年:重組DNA技術?

1990年：PCR技術在國內(nèi)開始用于臨床檢測?

1990年代中期：假陽性？（假陰性？）?

1996年：衛(wèi)生部科研課題?

1983年:PCR測定技術?

1991-1993年:實時熒光PCR技術和芯片技術?

1998年3月20日：

《臨床PCR實驗室管理專家咨詢會》（北京醫(yī)院第一會議室）?

2003年：人類基因組計劃基本完成。納米和量子標記技術？?

1998年4月16日衛(wèi)生部下發(fā)《關于暫停臨床基因擴增（PCR）檢驗的通知》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[1998]第9號）?

2011年-新一代測序技術臨床基因擴增檢驗實驗室發(fā)展及現(xiàn)狀臨床基因擴增檢驗實驗室發(fā)展及現(xiàn)狀?

1999年4月29-30日：《基因擴增技術臨床應用專家研討會》，針對臨床開展PCR檢驗的問題，達成8點意見：（1）PCR技術本身沒有問題，技術先進。（2）衛(wèi)生部暫停臨床應用有助于規(guī)范管理，應在嚴格管理的基礎上適度開放。（3）限定臨床開展PCR檢驗項目上。（4）加強對PCR實驗室管理。（5）人員上崗培訓。（6）應有室內(nèi)質(zhì)控和參加部中心室間質(zhì)評。（7）SFDA盡管批準試劑文號。（8）成立專家咨詢委員會。???????2002年以前《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2002〕10號）培訓臨床基因檢驗人員開始臨床基因檢驗實驗室的驗收工作2010年《臨床基因擴增實驗室管理辦法》2014年高通量基因測序試點工作《個體化醫(yī)學檢測實驗室管理辦法》（征求意見稿）12018-5-14有關的法律文件??《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)

<2006>73號《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)<2010>194號????《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》《山東省臨床基因擴增檢驗實驗室技術審核辦法》《腫瘤個體化治療檢測技術指南》試行《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南》試行《個體化醫(yī)學檢測實驗室管理辦法》（征求意見稿）??《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法

》

（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）?《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則

》

（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）四代測序技術重點參數(shù)比較Thetimelineofsequencingtechnologydevelopment測序技術不斷發(fā)展……22018-5-14CTCs是最早的液體活檢標記物，也被認為是真正

“完整”的液體活檢標記物，但是因為檢測技術難度較大，所以爭議很多，進展也比較慢。?

基因擴增實驗室建設規(guī)范及標準化要求醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則臨床基因擴增檢驗實驗室的設置?

一、臨床基因擴增檢驗實驗室的設計?

（一）臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設計原則。

原則上臨床基因擴增檢驗實驗室應當設置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。這4個區(qū)域在物理空間上必須是完全相互獨立的，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應當始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當合并。例如使用實時熒光PCR儀，擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并；采用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。各區(qū)的功能是：?

設置依據(jù)：衛(wèi)生部《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》,衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號。附件：醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則。?

對臨床基因擴增檢驗實驗室的分區(qū)及設備配置作了明確規(guī)定32018-5-14醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則（二）臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向??1.試劑儲存和準備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。?

臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向可按照試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)進行，防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域。可按照從試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力遞減的方式進行?？赏ㄟ^安裝負壓排風裝置或其他可行的方式實現(xiàn)。2.標本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規(guī)范的要求。??3.擴增區(qū)：cDNA合成、DNA擴增及檢測。4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)：擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。（三）工作區(qū)域儀器設備配置標準?????????2.標本制備區(qū)。（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。（2）高速離心機。?

1.試劑儲存和準備區(qū)。?

（1）2～8℃和-20℃以下冰箱。?

（2）混勻器。?

（3）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。?

（4）可移動紫外燈（近工作臺面）。?

（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭。?

（6）專用工作服和工作鞋(套)。?

（7）專用辦公用品。備注：增設超凈臺（3）混勻器。（4）水浴箱或加熱模塊。（5）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。（6）可移動紫外燈（近工作臺面）

。（7）生物安全柜。（A2、B2）（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。???（9）專用工作服和工作鞋(套)。（10）專用辦公用品。（11）如需處理大分子DNA，應當具有超聲波水浴儀。?

3.擴增區(qū)。?

4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)。?

（1）核酸擴增儀。?

視檢驗方法不同而定，基本配置如下：?

（1）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl）。?

（2）可移動紫外燈（近工作臺面）。?

（2）微量加樣器（覆蓋0.2-1000μl），（視情況定）。?

（3）消耗品：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。?

（3）可移動紫外燈（近工作臺面）。?

（4）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。?

（4）專用工作服和工作鞋。?

（5）專用辦公用品。?

上述各區(qū)域儀器設備配備為基本配備，實驗室應當根據(jù)自己使用的擴增檢測技術或試劑的特點，對儀器設備進行必要的增減。?

（5）專用工作服和工作鞋。?

（6）專用辦公用品。42018-5-14二、臨床基因擴增檢驗實驗室工作基本原則?(一)進入各工作區(qū)域應當嚴格按照單一方向進行

，即試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→

擴增產(chǎn)物分析區(qū)。?

2002年1月14日衛(wèi)生部下發(fā)《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號)終止使用???(二)各工作區(qū)域必須有明確的標記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品不得混用。(三)不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。(四)實驗室的清潔應當按試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。二、臨床基因擴增檢驗實驗室工作基本原則三、臨床基因擴增檢驗實驗室各區(qū)域工作注意事項?(五)工作結(jié)束后，必須立即對工作區(qū)進行清潔。工作區(qū)的實驗臺表面應當可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應當方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關鍵，因此可使用可移動紫外燈（

254nm波長），在工作完成后調(diào)至實驗臺上60～90cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對（bp），對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。??(一)試劑儲存和準備區(qū)。貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應當直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過擴增檢測區(qū)，試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品不應當保存在該區(qū)，應當保存在標本處理區(qū)。(二)標本制備區(qū)。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，可通過在本區(qū)內(nèi)設立正壓條件，避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管

。對具有潛在傳染危險性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。?(六)實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序，所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。??(三)擴增區(qū)。為避免氣溶膠所致的污染，應當盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走標本采集、運送和保存中的關鍵點動。必須注意的是，所有經(jīng)過檢測的反應管不得在此區(qū)域打開

。(四)擴增產(chǎn)物分析區(qū)。核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法（放射性核素標記或非放射性核素標記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法、質(zhì)譜分析等。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/L

HCl中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應當至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至

1mol/L

HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。?

容器：密閉的、一次性、無菌、無核酸酶及其他擴增抑制物?

采集方法：人（訓練有素）、防污染?

運送保存時間和溫度：盡可能快？低溫？?

合格標本:容器完整、量夠、時間符合要求、外觀符合要求、要采到病原體?由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故應當注意實驗人員的安全防護。52018-5-14臨床標本中PCR反應抑制物臨床標本的接收?

內(nèi)源性的

:免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細胞內(nèi)的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。?

通常的工作流程：標本采集血清分離編號保存或檢測??應在四個測定區(qū)域之外的地方或區(qū)域內(nèi)接收?

外源性的

:如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過度UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標本容器或采樣器材上含有的抑制物。接收的標本應收集在原始容器中?

在核酸提取時帶入至標本制備區(qū)臨床PCR實驗室的驗收學習、落實有關的法律文件??《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)

<2006>73號????人員的培訓、資質(zhì)《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)實驗室的建設<2010>194號（共五章21條）儀器設備配置和基本要求實驗室質(zhì)量管理體系的建立SOP文件的建立????《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》《山東省臨床基因擴增檢驗實驗室技術審核辦法》《腫瘤個體化治療檢測技術指南》試行相應試驗表格的建立《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南》試行《個體化醫(yī)學檢測實驗室管理辦法》（征求意見稿）參加相應的EQA或?qū)嶒炇议g的比對試驗體系的驗證、性能評價??《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法

》

（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）?《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則

》

（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）人員培訓實驗室內(nèi)部培訓存在的問題?

方法原理?

人員少，實際上沒有內(nèi)部培訓?

核酸擴增檢測的關鍵環(huán)節(jié)?

儀器設備使用、維護和校準?

結(jié)果的分析、報告及進一步處理?

質(zhì)控的分析?

形式?

沒有年度培訓計劃?

沒有培訓記錄?

知其然又知其所以然。62018-5-14試劑、方法原理實驗室人員內(nèi)部培訓的重要性內(nèi)部培訓所涉及的范圍質(zhì)量控制方法專業(yè)其他相關領域的新技術理論?

外部培訓提供的是“理念”，是被動的，更多的是“學習”相關法律法規(guī)質(zhì)量管理體系新理念和新進展?

內(nèi)部培訓是主動的，源于實踐，高于實踐，更多的是“思考”儀器設備使用、維護和校準操作實驗操作技能如何培訓書面考試講座實驗考核討論心得培訓評估討論自學論文綜述問題的解決報告咨詢練習臨床基因擴增檢驗實驗室房屋設置標準實驗室的設置分區(qū)?

較理想模式?

常見模式?

最低標準?

通風問題?

實驗物品的傳遞72018-5-14臨床PCR實驗室設計的原則?

各區(qū)獨立?

單一流向（氣流、人流、物流）?

空間適宜?

經(jīng)濟方便目的：“無基因”或“無核酸”污染理想的PCR實驗室設計B理想的PCR實驗室設計A產(chǎn)物分析區(qū)擴增區(qū)空氣流向標本制備區(qū)試劑準備區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)擴增區(qū)空氣流向標本制備區(qū)試劑準備區(qū)空氣流向緩沖間空氣流向緩沖間空氣流向緩沖間空氣流向緩沖間空氣流向?qū)Ｓ米呃瓤諝饬飨驅(qū)Ｓ米呃染彌_間緩沖間工作流向工作流向82018-5-14二、臨床PCR實驗室設計臨床PCR實驗室設計的一般原則?

充分、合理的空間??各區(qū)獨立(1)在物理空間上，必須是完全相互獨立的，各區(qū)域無論是在空間還是在使用中，應始終處于完全的分隔狀態(tài)(2)不能有空氣的直接相通。nnnn工作有序注意風向互不干擾、防止污染、報告及時?

良好的照明?

空調(diào)設備??因地制宜方便工作由清潔區(qū)域向污染區(qū)域流動實驗室應根據(jù)自己的檢驗項目、所采用的檢測技術平臺和工作量來決定分區(qū)的多少及各區(qū)域的空間大小。擴增和產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)擴增區(qū)空氣流向標本制備區(qū)傳遞窗試劑準備區(qū)傳遞窗試劑準備區(qū)其他實驗室其他實驗室其他實驗室傳遞窗空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向走廊走廊空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間其他實驗室空氣流向其他實驗室其他實驗室其他實驗室專用走廊工作流向標本制備區(qū)“無基因”或“無核酸”污染概念的重要性！??！92018-5-14臨床PCR實驗室設計的一般原則案例一、實驗室設計總體要求(1)在物理空間上，必須是完全相互獨立的，各區(qū)域無論是在空間還是在使用中，應始終處于完全的分隔狀態(tài);

(2)不能有空氣的直接相通。?

各區(qū)獨立l

《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法

》l

《分子病理診斷實驗室建設指南（試行）

》l

《測序技術的個體化醫(yī)學檢測應用技術指南（試行）

》l

《個體化醫(yī)學檢測質(zhì)量保證指南》?

注意風向

由清潔區(qū)域向污染區(qū)域流動?

因地制宜?

方便工作“十六字口訣”l

《腫瘤個體化治療檢測技術指南》l

《個體化醫(yī)學檢測實驗室管理辦法》二、實驗室平面示意圖案例四、實驗室技術參數(shù)分區(qū)壓力0Pa溫度濕度照明潔凈走廊緩沖區(qū)+5Pa+15Pa試劑準備區(qū)標本與文庫準備區(qū)+10Pa主實驗室≥300LX，其余房間200-300LX分區(qū)壓力0Pa溫度濕度照明DNA打斷區(qū)雜交捕獲區(qū)文庫擴增區(qū)文庫檢測區(qū)測序區(qū)+7Pa-7Pa20-25℃30%-70%潔凈走廊緩沖區(qū)+5Pa+15Pa-10Pa-10Pa-15Pa-20Pa試劑準備區(qū)標本與文庫準備區(qū)+10Pa主實驗室≥300LX，其余房間200-300LX電泳區(qū)DNA打斷區(qū)+7Pa-7Pa20-25℃30%-70%雜交捕獲區(qū)102018-5-14三、技術流程圖打斷區(qū)標本與文庫制備區(qū)加“A”與純化給排水強弱電暖通消防裝飾DNA提取及檢測純化與測OD值末端修復與純化穩(wěn)壓裝置布局設置空調(diào)系統(tǒng)專用走廊分區(qū)獨立緩沖設置排污系統(tǒng)功率：28KV電流：130A煙感系統(tǒng)滅火系統(tǒng)獨立設置新風處理Adapter連接與純化Pre-Captured-PCR與純化OD檢測與Pooling雜交雜交捕獲區(qū)PH:6-9，COD<60BOD<20,S<20用電防護環(huán)境要求水噴淋工藝設置純水系統(tǒng)零地電壓<3V底線抗阻<4Ω氣體:二氧化碳干粉:七氟丙烷墻體:密閉防腐天花:密閉圓弧地面:防滑防腐門窗:閉門帶窗溫度:20-25濕度:30-70氣壓:梯度遞減電阻率：18.2MΩ洗脫與純化Sanger驗證照明裝置供水系統(tǒng)逃生裝置測序區(qū)照度>300LX洗手裝置沖淋裝置洗眼裝置聯(lián)動控制應急燈紫外：254nm文庫擴增及檢測區(qū)指示裝置逃生路線圖實驗家具監(jiān)控系統(tǒng)壓差穩(wěn)定耐酸堿/耐腐蝕承重>200KG數(shù)據(jù)分析結(jié)果解讀視頻/溫度/濕度報告發(fā)放五、分區(qū)功能3

DNA打斷區(qū)主要功能：DNA打斷（片段化）。1

試劑準備區(qū)4

雜交捕獲區(qū)（擴增一區(qū)）主要功能：在PCR、NGS、CTC捕獲過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。主要功能：目的DNA片段的雜交捕獲與純化，測序片段擴增與純化、PCR前準備。2

標本與文庫制備區(qū)5

文庫擴增區(qū)（擴增二區(qū)）主要功能：樣本接收、樣本前處理、CTC捕獲、全基因組DNA提取以及各種樣本DNA或者RNA的提取、DNA片段化、DNA純化、DNA濃度測定、DNA片段的末端修復與純化、接頭連接與純化。主要功能：雜交捕獲后擴增與純化、文庫濃度質(zhì)檢

分析及測序的PCR擴增反應與純化。六、儀器配置6

文庫檢測區(qū)主要功能：檢測文庫質(zhì)量。1

試劑準備區(qū)主要儀器設備：加樣器、冰箱、萬分之一分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器(eppendorf)、可移動紫外燈、生物安全柜等。7

測序區(qū)主要功能：測序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機測序及Sanger測序。2

標本與文庫制備區(qū)8

電泳區(qū)主要儀器設備：NextCTC循環(huán)腫瘤細胞捕獲儀(無錫納奧)、微量臺式離心機、掌上三管離心機、恒溫金屬浴、移液器

(eppendorf)、可移動紫外燈、生物安全柜、冰箱、萬分之一天平、Qubit4.0核酸定量儀、PCR儀、電腦、條形碼打印機、打印機、掃描槍等。主要功能：

片段化DNA電泳檢測及結(jié)果反饋。112018-5-143

DNA打斷區(qū)6

文庫檢測區(qū)主要儀器設備：超聲波打斷儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器(eppendorf)、可移動紫外燈等。主要儀器設備：Qubit

4.0核酸定量儀、可移動紫外燈、生物安全柜、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、冰箱、移液器(eppendorf)等。4

雜交捕獲區(qū)（擴增一區(qū)）7

測序區(qū)主要儀器設備：PCR儀(ABI)、雜交儀、可移動紫外燈、生物安全柜、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、遮光窗簾（

FISH雜交暗室條件）等。主要儀器設備：高通量測序儀(illumine)、Sanger測序儀(ABI)、PCR儀、PC電腦、打印機、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器(eppendorf)、生物安全柜、可移動紫外燈、磁力架等。5

文庫擴增區(qū)（擴增二區(qū)）主要儀器設備：芯片式數(shù)字PCR儀(南京科維思)、熒光定量PCR儀(ABI)、微量臺式離心機、掌上三管離心機、渦旋震蕩器、移液器(eppendorf)、可移動紫外燈、生物安全柜、冰箱、磁力架等。8

電泳區(qū)主要儀器設備：電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、熒光顯微鏡、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器(eppendorf)、可移動紫外燈等。臨床PCR實驗室的驗收臨床標本接收注意什么??????????人員的培訓、資質(zhì)、授權及規(guī)范操作實驗室的建設及規(guī)范使用?

應在三(四)個測定區(qū)域之外的地方或區(qū)域內(nèi)接收?

接收的標本應收集在原始容器中，不能接收從其它檢測如生化、免疫檢驗等分出來的標本設備的配置及規(guī)范使用試驗體系的建立溯源性試驗體系的驗證、性能評價文件的建立規(guī)范、科學性、實用性、唯一性相應試驗表格的建立、記錄真實性及有效性防污染意識、措施?

在核酸提取時，由基因擴增檢驗實驗室人員將標本帶入至標本制備區(qū)。?

備:標本接受程序、標本拒收程序、唯一編號規(guī)則等參加相應的EQA或?qū)嶒炇议g的比對臨床試驗有效運轉(zhuǎn)及評價規(guī)范標本制備區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)規(guī)范?

標本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規(guī)范的要求。?

本區(qū)是唯一能打開擴增后反應管的地方

。由于本工作區(qū)應設置為負壓狀態(tài)，空氣流向為由外向內(nèi)，以防止擴增產(chǎn)物氣溶膠流出，故本區(qū)可無緩沖間。?

本區(qū)所使用的儀器設備可能有核酸測序儀、酶標儀、洗板機、加樣器和水浴箱等。?

加樣提取的核酸模板樣本，每加完一個即蓋好蓋子122018-5-14報告發(fā)放區(qū)規(guī)范?

四區(qū)之外?

實驗室質(zhì)量管理體系的建立規(guī)范?

保護患者隱私?

報告解讀?

結(jié)果保存基因擴增儀器設備的質(zhì)控規(guī)范實驗室質(zhì)量管理體系的建立規(guī)范儀器設備質(zhì)控方法頻度失控標準?

質(zhì)量手冊擴增儀儀器校驗實驗當儀器移動時每月一次實驗失敗熱電偶監(jiān)測溫度擴增功能檢測如靶溫度或溫度差異超出允許范圍?

質(zhì)量體系程序文件?

標準操作程序?

操作卡每4

個月一次待測孔未出現(xiàn)擴增，檢測溫度程序打印校準每次測定時每年2

次每次實驗每年2

次打印程序不對不符合要求不符合要求不符合要求加樣器水浴箱酶標儀?

記錄表格溫度檢測預防性維護及校準擴增儀的擴增功能檢測離心管、吸頭等的質(zhì)檢?

帶濾芯吸頭的密封性??目的：通過擴增功能來間接獲知孔間的均一性。方法：即將加有一已知的含一定濃度的陽性質(zhì)控樣本的擴增反應管置于擴增儀各孔中按常規(guī)進行擴增檢測，觀察結(jié)果的一致性程度，如果有某一個或幾個孔結(jié)果有問題，則應確定這一個或幾個孔是否會重復性地得到假陰性結(jié)果，如果是，則表明相應孔的熱傳導有損壞。?

離心管PCR抑制物質(zhì)檢132018-5-14理想的試劑和操作方法理想的試劑和操作方法?

試劑盒的質(zhì)檢?

定量測定的精密度是測定組成步驟的變異和的平方根(SD)=上式中SD

、SD

、SD

是步驟a、b、c等（例如試劑準備、標本采集、核酸提取、擴增和產(chǎn)物檢測等）的標準差?

改善測定精密度的措施必須首先著重在最不精密的步驟上，應對試劑準備、標本收集、核酸提取、測定方法和儀器操作寫出

“標準操作程序”(SOP)SDa

SD

SD

......22b2cabc實驗室質(zhì)量管理的內(nèi)涵實驗室質(zhì)量管理體系的建立?

質(zhì)量手冊?寫你所應做的?做你所寫的?

質(zhì)量體系程序文件?記錄你已做的?分析你已做的?

標準操作程序(相關記錄表格)質(zhì)量體系文件的三大特性編號：XXX單位XXX實驗室XXX標準操作程序啟用日期：版本：第

頁

共

頁?

法規(guī)性、唯一性和適用性。怎樣編寫SOP？?

法規(guī)性:是指文件一旦制定完成并批準實施，就必須認真執(zhí)行，按照相應的文件去完成日常檢驗工作，也就是前面所說的做你所寫的。并且文件的修改不能隨意，只能按規(guī)定的程序進行。一目的：二適用范圍：三職責或責任人：四（方法原理）五（檢測設備和試劑）六（所需的環(huán)境條件）七操作步驟：1．?

唯一性:則是指（1）一個實驗室只能有一個質(zhì)量體系文件系統(tǒng)；（2）一項檢驗活動只能有唯一的操作程序；（

3）一項規(guī)定只能有唯一的理解，不產(chǎn)生歧義；（4）只能使用文件的有效版本，無效版本在實驗室的任何地方都不能使用。2．3．?

適用性:是指質(zhì)量體系文件無統(tǒng)一格式；無標準文本；怎么做怎么寫，切合實際，具有可操作性，不拘一格。所有文件的規(guī)定均應保證在臨床實際檢測工作中能完全做到。當發(fā)現(xiàn)文件有不適合情況時，則應立即按規(guī)定程序?qū)ξ募M行修改。五、本操作程序變動程序：六、相關的文件七、相關的記錄表格和報告編寫人審核人批準人142018-5-14SOP

（5W和1H）儀器設備的維護和校準SOP?

誰來做(Who)：責任人?

責任人?

維護和校準的基本方面：光路、濾光片、波長、加熱模塊的清潔、具體的校準點選擇（如加樣器的校準體積點選擇、溫度計的校準溫度點選擇等）、維護和校準的具體方法包括用具?

做什么(What)：適用范圍?

何時（When）：適用范圍?

何地（Where）：適用范圍?

為什么做（Why）：目的?

如何做（How）：操作步驟?

校準合格的判斷標準?

維護和校準的間隔時間存在問題?

表格種類繁多?

重復記錄實驗記錄表格的設計規(guī)范?

表格無實用性，用于檢查的痕跡很重152018-5-14記錄表格設計的基本原則?

信息充分?

簡單明了?

臨床標本的檢測信息能有機聯(lián)系起來?

融入LIS系統(tǒng)？試劑準備區(qū)（1區(qū)）臨床PCR檢驗流程記錄表實驗前冰箱溫度：冷藏室（2~8℃）實驗室溫度：

℃（允許范圍：10~30℃）；相對濕度：

（允許范圍：30%~70%）PCR試劑來源：

（可直接列出有關廠家名稱）

批號：檢驗項目：

本次實驗用量：

人份，剩余量：其他有關試劑配制：：打開通風設備實驗臺面清潔（水或70%酒精擦拭）檢驗日期檢驗項目：擴增儀中保存文件名：℃；

冷凍室（18℃2℃）℃使用說明：1．本記錄表須嚴格遵循試劑準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)（產(chǎn)物分析區(qū)）單一流向移動，嚴禁逆向移動。2．各項工作執(zhí)行后，在相應敘述前的“

”內(nèi)打“”。3．本記錄表最后與相應的標本接收記錄等歸檔保存于擴增區(qū)的專用文件柜內(nèi)，以備查找。人份。按XXX（將有關SOP編號列出）SOP配制1%含氯消毒液按XXX（將有關SOP編號列出）SOP配制4％NaOH溶液毫升；毫升；毫升；實驗前準備試劑在有效期內(nèi)擴增儀、加樣器和溫度計在校準的有效期XXXSOPSOP配制0.1%按（將有關編號列出）焦磷酸二乙酯毫升；內(nèi)按XXX（將有關SOP編號列出）SOP配制生物安全柜的濾膜在使用有效期內(nèi)沖眼器內(nèi)無菌生理鹽水在有效期內(nèi)消毒溶液在有效期內(nèi)離心管、帶濾芯吸頭已經(jīng)過質(zhì)檢合其他：儀器設備使用：操作者：離心機：

正常不正常振蕩器：

正常不正常實驗后：

按XXX（將有關SOP編號列出）SOP清潔實驗室臺面、地面、加樣器和離心機，并進行紫外照射30分鐘以上。按XXX（將有關SOP編號列出）SOP處理實驗廢棄物。操作者：標本制備區(qū)（2區(qū)）實驗臺面清潔（水或70%酒精擦拭）冰箱（柜）溫度：冷藏室（2~8℃）

℃；冷凍室（18℃2℃）實驗室溫度：

℃（允許范圍：10~30℃）；相對濕度：

（允許范圍：30%~70%）擴增及產(chǎn)物分析區(qū)（3區(qū)）實驗前：打開通風設備實驗前打開通風設備實驗臺面清潔（水或70%酒精擦拭）（允許范圍：℃實驗室溫度：℃（允許范圍：10~30℃）；相對濕度：30%~70%）陽性室內(nèi)質(zhì)控物來源：陰性室內(nèi)質(zhì)控物來源：濃度及批號：批號：擴增位置：擴增位置：擴增儀操作：設定標準曲線計算值：Slope值：開機自檢及運行正常按XXX（列出編號）SOP進行編程、參數(shù)（）Intercept值：（）r值：（）所取理的標本（對應標本接收的唯一編號）及擬擴增位置：1917181920212223242526272829303132室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果：結(jié)果：□填寫室內(nèi)質(zhì)控記錄、描質(zhì)控圖

是否失控：□否□是234567810111213141516失控原因及分析：（失控判斷標準及原因分析按

XXXSOP進行）核酸提取及加樣過程：按XXX（列出編號）SOP進行。儀器設備使用：

生物安全柜：正常不正常正常恒溫儀溫度校準：不正?！鎸嶒灲Y(jié)果：見所附擴增儀打印結(jié)果實驗后：

按XXX（將有關SOP編號列出）SOP清潔實驗室臺面、地面及儀器設備。按XXX（將有關SOP編號列出）SOP處理實驗廢棄物。離心機：實驗后：正常不正常振蕩器：按XXX（將有關SOP編號列出）SOP清潔實驗室臺面、地面及儀器設備。操作者：按XXX（將有關SOP編號列出）SOP處理實驗廢棄物。操作者：162018-5-14質(zhì)控物濃度的選擇理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件?

基質(zhì)與待測樣本一致；?

所含待測物濃度接近試驗的決定性水平；?

穩(wěn)定；?

定量測定：測定線性范圍內(nèi)的高、中、低三種濃度?

靶值或預期結(jié)果已定；?

無已知的生物傳染危險性；?

單批可大量獲得；?

定性測定：接近方法測定下限的濃度?

陰性質(zhì)控物?

價廉臨床基因擴增檢驗IQC統(tǒng)計每次（批）測定質(zhì)控物的數(shù)量及放置計算問題?

可使用質(zhì)控樣本擴增后的IU/ml來進行統(tǒng)計計算，也可用其對數(shù)值進行。?

標本數(shù)量如小于30，弱陽性和陰性質(zhì)控各1份，標本數(shù)量增加，質(zhì)控物數(shù)量相應按比例增加?均勻分散于臨床標本中，與臨床標本一同處理（核酸提?。?

由于基因擴增結(jié)果的原始數(shù)據(jù)通常很大，可能不呈正態(tài)分布，故使用其對數(shù)值來進行質(zhì)控統(tǒng)計分析。?

擴增時的排列順序，可排于標準品或校準品之后，臨床樣本之前。但在擴增儀中的位置，不應永久性的固定的在一個孔，而應在每次擴增檢測時，進行相應的順延，以使在一定的時間內(nèi)，可以盡可能的監(jiān)測每一個孔的擴增有效性。陰性質(zhì)控樣本的種類陰性原血清樣本的功能?

監(jiān)測實驗室的以前擴增產(chǎn)物的

“污染”?

陰性原血清樣本?

由實驗操作所致的標本間的交叉污染。具體地說，如強陽性標本氣溶膠經(jīng)加樣器所