植物組織原位雜交protocol

PAGEPAGE13植物材料的固定、包埋和制片一、 植物材料的固定和包埋在此過程應(yīng)注意避免Rnase的污染。所使用的熔蠟管（管蓋高壓濕熱滅菌）

、燒杯、量筒180C5小時以上。所用蒸餾水無需用

DEPC處理。所固定的材料越小越好，盡可能切除多余的材料。切割后應(yīng)立即固定。取材后若不能立即固定，則應(yīng)置于冰上運(yùn)輸。配試劑前請計算一下所需用量，用多少配多少，節(jié)約試劑。第一天第一天一、配制甲醛溶液（按300ml量為例）1300mlPBS1NaOH搖動溶化。°2、把上述溶液在微波爐中加熱（通常用 600W,1分鐘，一般不超過60C）?！?、在通風(fēng)櫥中往三角瓶中加入 4%多聚甲醛（12g）、0.1%Tween-20（300ul）和Triton（300ul），然后用parafilm封口，搖勻直到完全溶解（包埋水稻時還要再加3ml25%的戊二醛）。4、置于冰上降至室溫，用硫酸調(diào) pH至7.0（參見第三部分之“一”）。5、把配制好的甲醛溶液分裝到小瓶中， （一般用20ml的小瓶，倒?jié)M至18ml左右）。6、分裝好的甲醛溶液應(yīng)放置在冰浴中當(dāng)天使用，或 二、 固定材料

保存?zhèn)溆茫ㄖ荒軆鋈谝淮危°C1、取植物新鮮材料，切至適當(dāng)大小。注意：所固定的材料越小越好，盡可能切除無用多余的部分。2、把切塊投入裝有甲醛溶液的小瓶中（此時小瓶應(yīng)在冰浴中） 。注意每瓶中的切塊數(shù)太多固定不好；太少則浪費(fèi)固定液（一般切塊為 15X5X3mm時，每瓶中的切塊數(shù)不多于5個；固定液：材料》20:1）。3、材料放入固定液后，應(yīng)通過抽真空（1至數(shù)分鐘，視具體情況而定：盡可能短時間，以材料沉入固定液中為準(zhǔn)），幫助固定液進(jìn)入組織中，以達(dá)到迅速固定植物材料的目的。抽氣減壓時，盡量不要使液體過分沸騰。抽真空時，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料應(yīng)該沉入固定液中，有時可能要反復(fù)多次抽真空，直至材料沉沒在固定液中。一般抽真空多于 5分鐘大部份材料還不沉沒在固定液中的情況極少見如果此情況發(fā)生，建議抽真空達(dá) 10分鐘后，繼續(xù)做步驟4。4、抽真空后需要更換一次新鮮的固定液。5、更換新鮮固定液后，材料在4C過夜。注意：甲醛有劇毒，因此藥品的稱取和溶液的配置必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行！ 多聚甲醛極易飛散;稱取時通風(fēng)櫥可暫不抽風(fēng)；要避免將多聚甲醛灑落在天平或臺面上造成污染，如有灑落，要及時清理第二天|按以下序列對材料進(jìn)行脫水（水為高壓滅過菌的雙蒸水，所用溶液預(yù)冷） 。1、0.85%NaCl2、50%/0.85%NaCl3、70%/0.85%NaCl4、85%/0.85%NaCl第三天注：進(jìn)入50%乙醇后，材料應(yīng)開始脫色。第三天1、95%乙醇/水 42、100%乙醇 43、100%乙醇（換新瓶子） 4

冰浴，30分鐘冰浴，5浴，54C,過夜C,5C,5C,過夜注：第三天起，每個脫水步驟時間可延長至天。兩次

100%^醇脫水后，材料應(yīng)為無色。第四天第四天1、100%乙醇室溫，2小時2、50%乙醇/50%二甲苯（換新瓶子）室溫，1小時3、100%二甲苯室溫，1小時4、100%二甲苯室溫，1小時5、100%二甲苯室溫，1小時6、50%二甲苯/50%石蠟 58《，過夜（使用熔蠟臺）注：使用二甲苯后，應(yīng)在通風(fēng)櫥中操作，要避免讓在同一實(shí)驗室工作的人聞到二甲苯的味道。第五至七天每天換兩次100%石蠟（58C）,傾倒時避免產(chǎn)生氣泡。第五至七天注意：在換石蠟前1-2小時，把石蠟裝于干凈熔蠟管內(nèi)，置于熔蠟臺上熔化備用。第八天第八天紙盒的處理：將折好的紙盒于氯仿（廢氯仿可回收重復(fù)利用）中泡一會，再取出晾干。包埋蠟塊：先準(zhǔn)備一盆水放在旁邊備用，再將大小合適的紙盒放在熔蠟臺上（在紙盒上寫明材料的名稱等有關(guān)內(nèi)容），將新熔化的石蠟傾倒于此盒內(nèi)， 把材料放到此盒內(nèi)。用加熱的鑷子迅把材料按需要的切面及材料之間的間隔排列整齊。 用嘴吹氣，使石蠟表面凝固形成一層薄膜時，再平放入冷水中，使其盡快凝固，數(shù)秒后翻轉(zhuǎn)蠟塊。約半小時后取出，置于有吸水紙的塑料框里晾干。包埋好的蠟塊放入4C冰箱中備用。二、 載玻片和蓋玻片的處理1、洗液（2%HCI+70%L醇溶液：70ml無水乙醇+2ml濃HCI+28mlH2O浸泡過夜，流水沖洗干凈，同時用戴手套的手摸洗。23個燒杯的雙蒸水、39517個燒杯，經(jīng)酒精燈燒后，放在折好的錫紙上晾干，最后用錫箔紙包裹。3、180C5個小時。同時烘蓋玻片。4、待載玻片冷卻，加4ul多聚-L-賴氨酸（1mg/ml）于一端。用蓋玻片（已經(jīng)過 180C烘5小時處理）的一邊接觸液滴，進(jìn)行涂片。涂片時應(yīng)觀察到“虹膜”的形成。注意：若涂片后多聚-L-賴氨酸不形成一層水膜，則表明載玻片沒有洗干凈，必須重洗。請注意標(biāo)載玻片的哪一面涂有多聚 -L-賴氨酸。5、涂片之后放入42C的燙板中干燥過夜（最短可以4小時），然后放入切片盒中，經(jīng)過處理的載玻片應(yīng)在一周內(nèi)使用。6、蓋玻片的處理：用丙酮處理 15分鐘，通風(fēng)櫥中晾干，用錫箔紙包裹。 180C烘5個小時。7、最后封片用的蓋玻片不需作任何處理。使用前用擦鏡紙擦凈即可（主要是防塵） 。三、切片和展片1、修塊。將包有材料的小蠟塊（包含一個材料）初步修成六面體，粘在硬木塊上。用刀片蠟塊修成梯形，在材料的周圍各留 2mm的石蠟即可（盡可能少留）。2、切片。切片的厚度為7-10um。在解剖鏡下用暗視野觀察蠟帶，以決定取舍。3、展片。將DEPC處理過的蒸餾水滴加在涂有多聚賴氨酸的載玻片上 （注意分清哪一面涂有多聚賴氨酸），將蠟帶的反面（注意正反面！）漂浮于其上放入燙板上（42C）進(jìn)行展片。蠟帶完全展開后（數(shù)分鐘至幾十分鐘不等，注意觀察以免展過頭，以組織不裂開為度），吸去多余的水，用一張鏡頭紙輕輕壓在蠟帶上，然后用吸水紙吸去多余的水。置于干燥過夜。42C燙板上4、制好的片子應(yīng)在一星期內(nèi)進(jìn)行雜交。植物組織RNA原位雜交第二部分

RNA探針的地高辛標(biāo)記一、轉(zhuǎn)錄模板的線性化DNA（150-1200bppolyA尾）SP6T7T3RNA多聚酶的啟動子，女口pSKpKSpGEM-pSPT18或19。DNARNA應(yīng)選5'端凸出（或平端？）的內(nèi)切酶，酶切必須完全。酶切時要同時制備正義和反義DNA模板。10.1ug/ul，加入合適的內(nèi)切酶及緩沖液（200ul酶切體系），37C,2小時），的水（200ul）,這樣可以減少后面抽提時的損失2（Tris飽和的酚pH7.8）（200ul）:氯仿（200ul）轉(zhuǎn)/分離心，5min，取上清夜（棄下層有機(jī)相）EPul）抽提，12000轉(zhuǎn)/分離心，5min，取上清夜（）EP管中。再重復(fù)一次氯仿抽提，取上清。注意：從氯仿抽提開始使用的容器、試劑均為 RNasefree。33M的醋酸鈉（中和磷酸基團(tuán)，有助于沉淀DNA，使終濃度0.3M121小時（推薦是-20過夜）。4、樣品取出，12000g離心，10min。棄上清，加400ul70%乙醇，顛倒混勻后再12000rpm離心10min。把殘液吸盡后，真空干燥（約1.5min），重懸于水或1/10TE（pH8.0）0.5-1ug/ul（TE的體積），-20C保存。二、RNA探針的標(biāo)記Buffer，DDTATPGTPCTPDig-UTP化凍。1、標(biāo)記反應(yīng)體系：（室溫下，以T3RNA聚合酶為例。）Roche反應(yīng)體系10ul水2.5ul10xT3轉(zhuǎn)錄緩沖液2.5ul5mMATP2.5ul5mMGTP2.5ul5mMCTP2.5ul1mMDIG-UTP1ulDNA線性模板（0.5-1ug，視模板濃度而定加樣體積）0.5ulRNA酶抑制劑（50u/ul）1ulT3RNA聚合酶（20u/ul）Total:25ulPromega4-5ul水5ul5XT7轉(zhuǎn)錄緩沖液2.5ulDDT（100mM）2.5ul5mMATP2.5ul5mMGTP2.5ul5mMCTP2.5ul1mMDIG-UTP1-2ulDNA線性模板（0.5-1ug,視模板濃度而定加樣體積）0.5ulRNA酶抑制劑（40u/ul）1 ulT7RNA聚合酶（20u/Total:25ul2、37C溫育2小時（此時可跑膠檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度，但多省略）。3、終止轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：75ul1xMS2 ultRNA（100mg/ml）（Sigma,R4251,500units,TypeXXI,Ribonucleicacid,transfer,放在-20EP管；它在萬一有RNAasel可以保護(hù)轉(zhuǎn)錄的RNA犧牲自己去被降解；而且在沉淀的時候可以與合成的RNA共沉淀，尤其在合成的RNA量很少的情況下可以減少損失）1ulDNA酶（無RNA酶污染的DNasel（10u/ul））4、37C溫育10分鐘。5、沉淀：100ul3.8MNH

Ac（可增加離子濃度）4600 ul乙醇（冰上預(yù)冷）6、-20C過夜。（或在干冰上10分鐘，時間稍微長點(diǎn)沒關(guān)系）。7、樣品取出，4C13000-15000轉(zhuǎn)/分（F2402轉(zhuǎn)頭），離心10分鐘，棄上清。8、用200ul冰預(yù)冷的70聽醇/0.15MNaCI沖洗沉淀（H2

O270ul+30ul5MNaCl+700ul乙醇）。94C13000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。棄上清，真空干燥。C10、加入50ulDEPC水（4 溶解10min后再到下一步）。11、加入50ul2X碳酸緩沖液（pH10.2）1260C水解：模板（插入片段）長度 水解時間600-1200bp 80-90 分鐘400-500bp 60 分鐘（如Histone）200-400bp 20-30 分鐘（cyclin）小于200bp 1-5 分鐘13、沉淀10ul10%醋酸12 ul3MNaAc（pH4.8）312 ul乙醇（冰預(yù)冷）14、-20C2157-9步。16、沉淀重懸于50u|TE（pH7.6）中，置-20C保存（加入 0.5ulRNasin（20u/ul）的RNA酶抑制劑，趙忠不加，因為他配的TE可靠，無RNaseo三、RNA探針的檢測1、點(diǎn)膜（Southern用剩下的膜）：0.5-1ul待測探針；1ng/ ul、5ng/ul、10ng/ul地高辛標(biāo)記的對照RNA（Roche公司）2、自然吹干。3、置于小培養(yǎng)皿中，用5ml地高辛緩沖液1浸濕。（步驟3-8用三維搖床）4230分鐘。5、用5ml地高辛緩沖液1沖洗。&5ml1+1ul30分鐘。75ml12158、用5ml地高辛緩沖液5稍加沖洗。96中（5ml57ulNBT5ulBCIP）10分鐘以上。前一天晚上第三部分 原位雜交前一天晚上244-5升無菌水（DEP（處理）。蓋玻片（24-30片/30片載玻片）,25ml1個、50ml5個、100ml1個、250ml量筒3個、500ml量筒7個，1000ml燒杯4個，250ml三角瓶4個，500ml三角瓶4個，1000ml三角瓶8個，鐵藥勺3把，切片籃2個，平頭鑷2把。以上均需180C 烘5小時。檢查儲備液準(zhǔn)備新滅菌的槍頭、1.5mL離心管。第一天第一天早上過來后先把下午實(shí)驗所需的玻璃缸洗凈：先自來水沖洗，雙蒸水過一次,再用無水乙醇過一次，略晾干，最后用氯仿過一次。然后置于通風(fēng)櫥中吹干備用。12Rnase滅菌的蒸餾水配制,Rnase處理之后即可直接使用蒸餾水。將以下溶液倒入通風(fēng)櫥中的玻璃缸中：二甲苯1和2 （2X300ml二甲苯溶液）100%12（2X300ml無水乙醇溶液）100%乙醇 8.5%NaCl水95%乙醇285ml —15ml85%乙醇,0.85%NaCl255ml 30ml15ml50%乙醇,0.85%NaCl150ml 30ml120ml30%乙醇,0.85%NaCl90ml 30ml:180ml0.85%NaCl— 30ml270mlPBS1和2(2X300ml)10XPBS2X30ml水2X270ml鏈蛋白酶（protease） 0.125mg/ml（300ml）20X鏈蛋白酶緩沖液 15ml水 285ml鏈蛋白酶粉劑 40mg注意：先加20X鏈蛋白酶緩沖液和水，37C 水浴；臨用前加鏈蛋白酶粉劑甘氨酸0.2%（300ml）10XPBS30ml水264ml甘氨酸粉劑0.6克4%多聚甲醛（300ml）10XPBS30ml水270ml多聚甲醛12克注意：（1）多聚甲醛有毒應(yīng)在通風(fēng)櫥中稱取配制，多聚甲醛極易飛散稱取時通風(fēng)櫥不要抽風(fēng)，避免將多聚甲醛灑落在天平或臺面上造成污染。（2）PBS和水加入三角瓶后，加入2-3NaOH60C12parafilm封口搖勻直到完全溶解。置于冰上降溫，用硫酸調(diào)pH7.0pH值時不要心急，20ul一次慢慢地加。乙酸酐溶液（溶于0.1M三羥基乙基胺pH8）（現(xiàn)用現(xiàn)配）2M三羥基乙基胺 35ml （國產(chǎn)三乙醇胺，避光水 665ml乙酸酐 3.6ml注意：此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，置于600ml大缸中。大缸中先放入一個空的載片籃及轉(zhuǎn)子，當(dāng)盛滿載玻片的載片籃放入玻璃缸、攪拌子開始攪拌時，再加入乙酸酐。組織預(yù)處理37C5個一排，S鏡檢后，裝入不銹鋼載片籃中(24片/籃)，在通風(fēng)櫥中進(jìn)行以下操作:110分鐘|⑴210分鐘(6) 85匯醇，0.85%NaCI30秒(7) 50匯醇，0.85%NaCI30秒(8) 30%^0.85%NaCI30秒(9) 0.85%NaCI2分鐘 (此時將鏈蛋白酶加入37C水浴中的鏈蛋白酶溶液，槍頭助溶)(10)(11)探(12)(13)(14)交

PBS1 2 分鐘|(3)鏈蛋白酶 10(37C水浴，水解RNA上的蛋白，同時使針容易進(jìn)入)甘氨酸2 分鐘|(終止鏈蛋白酶的反應(yīng))PBS1 2 分鐘多聚甲醛10分鐘|(后固定的作用，將RNA與細(xì)胞中的蛋白聯(lián)再一起，同時可固定蛋白酶，同時應(yīng)開始配乙酸酐溶液)(新鮮)(新鮮)PBS1PBSPBS1PBS2乙酸酐PBS222102分鐘分鐘分鐘分鐘(19)0.85%NaCl2分鐘330%L100%L醇‘100%^1'換成新鮮的)。注意：對于第二籃：12'11。⑵系列乙醇可以再用。(3)PBS1PBS2PBS2PBS1⑷玻璃缸用完后，用滅菌蒸餾水沖洗，加少量乙醇浸泡，用時吹干即可。上行結(jié)束后，把載片籃取出，把無水乙醇吸干后用錫紙包好，留一個小口，與超凈臺上吹干。先打開80C 的水浴鍋。1、準(zhǔn)備雜交緩沖液（32ul/張，可以多準(zhǔn)備一些10Xsalt（甲酰胺a1tRNA(100mg/ml)50XDenhardt's（50%dextransulphate

24張載玻片125ul12.5ul87.5ul甲酰胺b12345678 75ml150ml 9、將4張吸水紙雙折，鋪于盒底，加入50ml2XSSC,50甲酰胺，再于紙上蓋一層保鮮膜，載玻片置于其上。蓋上盒蓋，用膠帶密封。1050E水浴中雜交過夜?！礱"1指去離子甲酰胺（MolecularBiologygrade），保存與冰箱中；甲酰胺〉b2國產(chǎn)，保存于通風(fēng)櫥下儲藏柜。（）準(zhǔn)備沖洗緩沖液和NTE溶液，明天備用；同時清洗裝乙酸酐的盒子備用。第二天如果在早上準(zhǔn)備第四步地高辛緩沖液2,第三、四步可以在同一天內(nèi)完成，共第二天20X水

15ml30ml60ml120ml總體積注意：50%dextransulphate非常粘稠，加熱后，再用剪去尖端的槍頭加。震蕩混合雜交緩沖液，離心，置于室溫下。在冰上混合：（每一張載玻片探針2ul水2ul甲酰胺a⑴ 4ul將探針/水/80C2分鐘，離心，冰上冷卻。震蕩，再離心。將探針混合液（8ul/張）與雜交緩沖液（32ul/張）下。將載片籃拿出，吹干載玻片上乙醇。桌上鋪一層吸水紙，上面覆一層保鮮膜，還有平頭鑷子。38-40ul的雜交緩沖液/探針溶液，用處理過的蓋玻片蓋于其上,避免產(chǎn)生氣泡。（此時最好關(guān)空調(diào)，避免產(chǎn)生氣泡）2XSSC,50甲酰胺（8張載玻片/盒，共三盒，50ml/盒）12個小時。三、沖洗1、將一個水浴設(shè)定在37C，如果要進(jìn)行抗體染色（第四步）還需要一個浴用于配置地高辛緩沖液2。2、準(zhǔn)備沖洗緩沖液：（每籃需要：1X700ml+3X300ml=1600m）l沖洗緩沖液：2XSSC,50%甲酰胺b

50C的水20X20XSSCb:水總體積50ml250ml200ml500ml30ml150ml120ml:300ml3、將載玻片放回入載片籃中。4、在800ml大塑料盒底部放入一個空載片籃，將裝有載玻片的籃置于其上，加入700ml沖洗緩沖液。在50T水浴中溫育30分鐘。注意：此時蓋玻片會落下。5300ml50E130&在沖洗的過程中，準(zhǔn)備NTE溶液（每籃需要：5X300ml）NTE溶液1籃2籃5XNTE200ml300ml600ml水800ml1200ml2400ml總體積1000ml1500ml3000mM7、用NTE溶液，在37E水浴中沖洗兩次，每次5分鐘。8RNAA溶液（20ug/ml）中,37C30RNAA溶液RNARNASANTE1籃0.6ml300ml2籃1.2ml600ml注意：（1）RN酶A溶液應(yīng)提前放入37C 水浴中預(yù)熱5分鐘。RNAA以后各步：直接使用蒸餾水儀的蒸餾水即可。RNAA之前和之后使用的玻璃缸一定要分開放置，切勿混用！RNAA100聽醇浸泡,下次使用前在通風(fēng)櫥中吹干即可。9、準(zhǔn)備如下溶液:20XSSC水20XSSC水1籃15ml285ml2籃P30ml570ml10XPBS水1籃60ml10XPBS水1籃60ml540ml2籃P1201080ml10NTE5分鐘11、沖洗緩沖液，50C水浴，溫育1小時。121XSSC，室溫，2分鐘。13PBS室溫，5分鐘。四、抗體染色150r2（因為有BSA的緣故，為半透明的溶液）2、準(zhǔn)備如下溶液：地高辛緩沖液1(100mMTris-Hcl,150mMNaCl)(每24片需800ml，配1升)24片載玻片 48片載玻片10X地高辛緩沖液1 P80

160ml水 720ml 1440ml地高辛緩沖液2(0.5%[W/V]blockingreagent )(每24片需90ml)BlockingreagentBlockingreagent13盒—0.45g90ml6盒0.9g18060-70r1小時，溶液仍顯渾濁Blockingreagent本身有很多類似核酸的片段，可用于封閉核酸。這一步的目的是防止非特異性的吸附。地高辛緩沖液3（1%牛血清白蛋白[W/v],0.3%Triton[v/v] ）（每24片需500ml）牛血清白蛋白1牛血清白蛋白1TritonX-1003盒5g5001.5ml6盒10g1000ml3.0ml地高辛緩沖液4(Anti-digoxigenin-AP1:3000 )(每24片需45ml)Anti-digoxigeAnti-digoxigenin-AP地高辛緩沖液33盒15ul456盒「30ul90ml5(100mMTris-HCI,100mM

,pH9.5)(24180ml)3盒3盒6盒10X地高辛緩沖液5A18ml36ml10X地高辛緩沖液5B18ml36ml水144ml288mlBuffer5A5B6（2475ml）地高辛緩沖液53盒/r