電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用

關(guān)于電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用第1頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五目錄

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前言免疫分析電化學(xué)免疫分析2

電化學(xué)免疫傳感器

免疫傳感器電化學(xué)免疫傳感器3

發(fā)展及展望第2頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五前言1.免疫分析（Immunoassay）概念：基于用抗體或抗原作為選擇性化學(xué)試劑以分析測(cè)定抗原或抗體及半抗原的分析方法。分子識(shí)別材料：抗原或抗體分子識(shí)別基本原理：Ag十AbAg·Ab分類(lèi)放射性免疫分析（RIA）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）發(fā)光免疫分析（LIA）電化學(xué)免疫分析（ECIA）第3頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五電化學(xué)免疫分析法是將免疫技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合的一種分析方法1951年，由Breyer和Radclif首次應(yīng)用，極譜法測(cè)定由偶氮標(biāo)記的抗原六七十年代后電分析技術(shù)方法的發(fā)展：液相色譜電化學(xué)分析電化學(xué)流動(dòng)注射分析微分脈沖伏安法陽(yáng)極溶出伏安法第4頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五電化學(xué)免疫傳感器1免疫傳感器與測(cè)定抗原抗體反應(yīng)有關(guān)的傳感器1990年Henry等提出結(jié)構(gòu)：感受器、轉(zhuǎn)換器、電子放大器。分類(lèi)：電化學(xué)免疫傳感器、光學(xué)免疫傳感器、壓電免疫傳感器和SPR型免疫傳感器等。

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2.電化學(xué)免疫傳感器是一種將電化學(xué)分析方法與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展出來(lái)的具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)的生物傳感器。根據(jù)2001年ＩＵＰＡＣ的對(duì)生物傳感器分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),電化學(xué)免疫傳感器是基于抗原抗體反應(yīng)的,可進(jìn)行特異性的定量或半定量分析的自給式的集成器件,其中抗原/抗體是分子識(shí)別元件,且與電化學(xué)傳感元件直接接觸,并通過(guò)傳感元件把某種或者某類(lèi)化學(xué)物質(zhì)濃度信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號(hào)。根據(jù)檢測(cè)信號(hào)的不同,電化學(xué)免疫傳感器可分為電位型、電流型、電導(dǎo)型和電容型。第6頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五

2.1電位型免疫傳感器2.1.1

直接型電位免疫傳感器原理利用抗原或抗體在水溶液中兩性解離本身帶電的特性,將其中一種固定在電極表面或膜上,當(dāng)另一種與之結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物時(shí),原有的膜電荷密度將發(fā)生改變,從而引起膜的Donnan電位和離子遷移的變化,最終導(dǎo)致膜電位改變。第7頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五參比電極抗原結(jié)合抗體的膜原理：先通過(guò)聚氯乙烯膜把抗體固定在金屬電極上，然后用相應(yīng)的抗原與之特異性結(jié)合．抗體膜中的離子遷移移率隨之發(fā)生變化，從而使電極上的膜電位也相應(yīng)發(fā)生改變。膜電位的變化與待測(cè)物濃度之間存在對(duì)數(shù)關(guān)系第8頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五應(yīng)用早期的研究者利用此原理測(cè)定了人血清中的梅毒抗體、人血清白蛋白,并完成了血清鑒定Yamamoto等分別將HCG抗原或其抗體固定在鈦金屬電極表面,檢測(cè)了HCG及其抗體國(guó)內(nèi)學(xué)者彭圖治等分別報(bào)道了對(duì)人CA15－3、AFP、IgG、HBsAg的直接檢測(cè).（彭圖治，祝方猛等.測(cè)定甲胎蛋白的非標(biāo)記電位型免疫傳感器.應(yīng)用化學(xué)，1998，01：47－49）第9頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五2.1.2

酶標(biāo)記電位型免疫傳感器

將免疫化學(xué)的專(zhuān)一性和酶化學(xué)的靈敏性融為一體,對(duì)低含量物質(zhì)的檢測(cè)。標(biāo)記酶:辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶和脲酶。

酶標(biāo)記傳感器(電位型或電流型),最后均可歸結(jié)為是對(duì)NADH、苯酚、O2、H2O2、NH3及新近開(kāi)發(fā)的電活性物質(zhì)的檢出。

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應(yīng)用Ghindilis報(bào)道了一種無(wú)介質(zhì)反應(yīng)體系。它用一種具有電催化活性的生物催化劑(如乳糖酶)來(lái)標(biāo)記抗胰島素抗體。與固定在電極上的胰島素特異性結(jié)合，乳糖酶催化電極上氧的電還原反應(yīng)，從而使電極上電位增加，其增加值與溶液中游離抗原(胰島素)濃度有比例關(guān)系。檢測(cè)胰島素,獲得了很寬的線性范圍(300mV)（Directelectrontransfercatalyzedbyenzymes:applicationforbiosensordevelopment[J].BiosensBioelectron,2000,28(2):84－89）第11頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五

發(fā)展

敏感膜如PVC膜、醋酸纖維素膜、聚合物薄膜、蠶絲膜,以及固定化技術(shù)、膜電極制備技術(shù)的提高離子選擇電極(ISE）、pH電極和氣敏電極的發(fā)展不足之處

較低的信號(hào)/噪聲比;線性范圍窄;與ISE（離子選擇電極）相聯(lián)系的免疫傳感器不可避免地要受到其他離子的影響。第12頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五電流型免疫傳感器概念

在恒定電壓的情況下監(jiān)測(cè)由于抗原抗體結(jié)合或繼后反應(yīng)中電流的變化分類(lèi)非酶標(biāo)記電流型免疫傳感器酶標(biāo)記電流型免疫傳感器第13頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五

2.2.1

非酶標(biāo)記電流型免疫傳感器標(biāo)記的電活性物質(zhì)：

Fe(CN)63-/Fe(CN)34-

、二茂鉻鐵、Pb2+、Zn2+

等．主要是根據(jù)抗原和標(biāo)記抗原對(duì)定量抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，而標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合后氧化或還原電流減少。應(yīng)用

二茂鐵標(biāo)記嗎啡，以伏安免疫測(cè)定法，測(cè)定二茂鐵—嗎啡結(jié)合物在抗嗎啡抗體的存在與不存在時(shí)的氧化作用，在抗體存在時(shí)，由二茂鐵—嗎啡結(jié)合物產(chǎn)生的氧化電流減少，這個(gè)結(jié)果構(gòu)成對(duì)嗎啡均相測(cè)定的依據(jù)。使用的工作電位為500mv，因此很容易使其他藥物氧化，選擇性欠佳。（孫寶元楊寶清主編.傳感器及其應(yīng)用手冊(cè).北京：機(jī)械工業(yè)出版社，2004：348）第14頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五劉志國(guó)用納米金的優(yōu)良吸附性能和褐藻酸鈉的強(qiáng)負(fù)電性，將褐藻酸鈉通過(guò)胱胺共價(jià)修飾到納米金表面形成褐藻酸鈉-納米金復(fù)合物（ASN）標(biāo)記T3抗體（三碘甲狀腺氨酸抗體）；用為Fe(CN)63-/4-電化學(xué)探針，用循環(huán)伏安法獲取金電極表面微環(huán)境改變的電流信息來(lái)檢測(cè)T3抗體，檢測(cè)的線性范圍為100-1600ng/ml，檢出限為45ng/ml

（基于褐藻酸鈉-納米金復(fù)合物作非酶標(biāo)記的新型電化學(xué)免疫傳感器的研制.理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2004，40(8）:445-449）第15頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五2.2.2酶標(biāo)記電流型免疫傳感器第16頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五2.2.2酶標(biāo)記電流型免疫傳感器酶標(biāo)記電流型免疫分析原理：主要是競(jìng)爭(zhēng)法和夾心法前者是用酶標(biāo)抗原與樣品中的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合電極上的抗體，催化氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電活性物質(zhì)而引起電流變化，從而可測(cè)得樣品中抗原濃度。后者則是在樣品中的抗原與電極上的抗體結(jié)合后，再加酶標(biāo)抗體與樣品中的抗原結(jié)合，形成夾心結(jié)構(gòu)，從而催化氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電流值變化。第17頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五電流型酶標(biāo)記免疫傳感器的工作原理第一代酶標(biāo)記電流型免疫傳感器以非電活性物質(zhì)如O2作為氧化還原的電子受體為代表。先用競(jìng)爭(zhēng)法或夾心法葡萄糖氧化酶或過(guò)氧化物酶標(biāo)記物結(jié)合到膜或電極上,再通過(guò)氧電極測(cè)量葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸中消耗的氧,或過(guò)氧化氫分解中產(chǎn)生的氧。第18頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五以過(guò)氧化氫酶作為標(biāo)記酶來(lái)說(shuō)明其工作原理(圖10—56)：

(1)在測(cè)定溶液中加人標(biāo)記過(guò)氧化氫酶抗原，然后將抗體膜免疫傳感器插入上述溶液中，未標(biāo)記抗原(被測(cè)物)和標(biāo)記抗原與膜上的抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合；

(2)洗去未反應(yīng)的抗原；

(3)將傳感器插人測(cè)定酶活性的溶液中，這時(shí)傳感器顯示的電流值是由測(cè)定液中溶存氧量決定的；

(4)向溶液中加人定量的H2O2，結(jié)合在膜上的過(guò)氧化氫酶使H2O2分解產(chǎn)生O2,傳感器的電流值增大。

(5)據(jù)此可以測(cè)定IgG、HCG、甲胎蛋白、茶堿和胰島素等。第19頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五易受樣品溶解氧及pH的影響,工作電位較高,背景較差。雖然通入氣體氬能有效消除溶解氧,但無(wú)形中又增添了許多麻煩。第20頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五第二代酶標(biāo)記電流型免疫傳感器使用電活性物質(zhì)替代分子O2,這些電活性物質(zhì)包括二茂鐵衍生物、苯醌、氯醌、亞甲基藍(lán)、血紅素等。應(yīng)用：Ciana選擇對(duì)羥基磷酸苯為堿性磷酸酶的底物,結(jié)合FIA(流動(dòng)注射分析)使AFP(α-甲胎蛋白)檢測(cè)下限達(dá)到0.07ng/ml。(CianaLD,BernaccaG,NittiCD,etal.Highlysensitiveamperometricenzymeimmunoassayforα-fetoproteininhumanserum[J].JImmunolMethods,1996,193(1):51-62.)第21頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五優(yōu)點(diǎn)酶促反應(yīng)放大，靈敏度高不足多次洗滌分離操作、酶標(biāo)容易失活、費(fèi)時(shí)和重現(xiàn)性較差等第22頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五2.3

電導(dǎo)型免疫傳感器原理化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生或消耗的離子,能使溶液的導(dǎo)電能力發(fā)生改變。應(yīng)用1996年Yagiuda用電導(dǎo)法測(cè)定了尿中的嗎啡.(YagiudaK,HemmiA,ItoS,etal.Developmentofconductivity-basedimmunosensorforsensitivedetectionofmethamphetamine(stimulantdrug)inhumanurine[J].BiosensBioelectrion,1996,11(8):703-707.)2001年Diiksma用交流阻抗法測(cè)定了γ－干擾素,下限達(dá)到0.02fg/ml。(DiiksmaM,KampB,HoogvlietJC,etal.Developmentofanelectrochemicalimmunosensorfordirectdetectionofinterferon-γattheattomolarlevel[J].AnalChem,2001,73(3):901-907)電導(dǎo)法易受被測(cè)樣品離子強(qiáng)度和緩沖液容積的影響,并且難以克服非特異吸附第23頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五determinationofMAintheconcentrationrange1-10μg/mlwaspossiblewithinabout15minforeachsample.determinethecriticalconcentration(1μg/ml)ofMAinhumanurine.第24頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五電容型免疫傳感器

其信號(hào)轉(zhuǎn)換器由一對(duì)處于流體環(huán)境的導(dǎo)電體組成。識(shí)別分子固定在電極上,相關(guān)檢測(cè)物及液體的移動(dòng)引起介電常數(shù)的改變,導(dǎo)致電容的變化。可以用于實(shí)時(shí)檢測(cè)免疫反應(yīng)此類(lèi)傳感器的報(bào)道甚少。第25頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五發(fā)展及展望發(fā)展尋找更合適的固定方法和固定材料,探求更靈敏穩(wěn)定的標(biāo)記系統(tǒng)和電活性物質(zhì),追求更完美的信號(hào)檢出系統(tǒng)。電極表面的設(shè)計(jì)是提高電極壽命并增強(qiáng)反應(yīng)信號(hào)的重要因素原因：在免疫反應(yīng)發(fā)生時(shí)，抗原和抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致工作電極表面微環(huán)境的改變，宏觀上則表現(xiàn)為電流、電壓、電導(dǎo)率等電化學(xué)信息的變化第26頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五用戊二醛交聯(lián)法在鉑或銀電極上固定IgG抗體,電位差△E與抗原濃度C之間存在著良好的線性關(guān)系,回收率高,使用儀器裝置簡(jiǎn)單,可重復(fù)使用（孫寶元楊寶清主編.傳感器及其應(yīng)用手冊(cè).北京：機(jī)械工業(yè)出版社，2004：348）第27頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)37分，星期五Louis等在用巰基烷烴保護(hù)金電極減少雜蛋白的非特異吸附又不降低其導(dǎo)電能力的同時(shí),用含巰基的硅烷作偶聯(lián)劑將鏈霉親合素定向固定在金電極表面的SiO2層,使之能夠與生物素化抗原精確結(jié)合,效果很好。（TiefenauerLX,KossekS,PadesteC,etal.Towardsamperometricimmunosensordevices[J].BiosensBioelectron,1997,12(3):213－223.）Diiksma指出,如果使用短鏈的烷基硫醇效果更佳。(DiiksmaM,KampB,HoogvlietJC,etal.Developmentofanelectrochemicalimmunosensorfordirectdetectionofinterferon-γattheattomolarlevel[J].AnalChem,2001,73(3):901-907)Liu用高氟磺化陽(yáng)離子樹(shù)脂處理玻碳圓盤(pán)電極,結(jié)合多聚苯胺,偶聯(lián)葡萄球菌蛋白A,定向固定兔IgG,脲酶標(biāo)記山羊抗兔IgG,對(duì)兔IgG的測(cè)定線性范圍很寬(50～2000ng/ml）（LiuCH,LiaoKT,HuangHJ,Amperometricimmu