生物分離工程萃取

關(guān)于生物分離工程萃取第1頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五雙水相萃取(Aqueoustwo-phaseextraction)是利用物質(zhì)在互不相溶的兩個水相之間分配系數(shù)的差異實現(xiàn)分離的方法。1955年由Albertson首先提出了雙水相萃取的概念,此后這項技術(shù)在動力學(xué)研究、雙水相親和分離、多級逆流層析、反應(yīng)分離耦合等方面都取得了一定的進展。到目前為止,雙水相技術(shù)幾乎在所有的生物物質(zhì)如氨基酸、多肽、核酸、細胞器、細胞膜、各類細胞、病毒等的分離純化中得到應(yīng)用,特別是成功地應(yīng)用在蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離中。第三節(jié)雙水相萃取技術(shù)第2頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五

雙水相萃取的理論基礎(chǔ)：溶液的分相不一定完全依賴于有機溶劑，在一定條件下，水相也可以形成兩相(即雙水相系統(tǒng))甚至多相。于是有可能將水溶性的酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)從一個水相轉(zhuǎn)移到另一水相中，從而完成分離任務(wù)。有機溶劑萃取的不足：許多蛋白質(zhì)都有極強的親水性，不溶于有機溶劑；蛋白質(zhì)在有機溶劑相中易變性失活。第3頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第4頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五聚合物的不相溶性：主要是由于聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無法滲透，當(dāng)聚合物的濃度達到一定值時，就不能形成單一的水相，所以具有強烈的相分離傾向。某些聚合物的溶液與某些無機鹽的溶液相混合時，只要濃度達到一定值，也會形成兩相，即聚合物—鹽雙水相體系第5頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五①

系統(tǒng)含水量多達75%～90%,兩相界面張力極低,有助于保持生物活性和強化相際間的質(zhì)量傳遞②

分相時間短(特別是聚合物/鹽系統(tǒng)),自然分相時間一般只有5～15min。③雙水相萃取技術(shù)易于連續(xù)化操作。④目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)一般大于3,大多數(shù)情況下,目標(biāo)產(chǎn)物有較高的收率。⑤大量雜質(zhì)能夠與所有固體物質(zhì)一起去掉,與其它常用固液分離方法相比,雙水相萃取技術(shù)可省去1～2個分離步驟,使整個分離過程更經(jīng)濟。⑥設(shè)備投資費用少,操作簡單,不存在有機溶劑殘留問題。雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點第6頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五一、雙水相分離理論1、雙水相的形成

熵增——混合——自發(fā)分子間作用力------隨著Mr的增加,而增大.聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象.常用聚合物：聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－無機鹽系統(tǒng)無毒原則第7頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第8頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五2、相圖

臨界點(criticalpoint)：當(dāng)系線長度趨于零時,兩相差別消失,任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1。如C點。均相區(qū)兩相區(qū)雙節(jié)線系線第9頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五聚合物的分子量越高，相分離所需的濃度越低兩種聚合物的分子量相差越大，雙節(jié)線的形狀越不對稱。第10頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五3、物質(zhì)在兩相中的分配

和溶劑萃取法一樣，物質(zhì)在兩水相中的分配用分配系數(shù)K表示。

CTK=——CBCt、CB——分別代表上相、下相中溶質(zhì)的濃度

K—與溫度、壓力以及溶質(zhì)和溶劑的性質(zhì)有關(guān)，與溶質(zhì)的濃度無關(guān)。1）表面自由能的影響(大分子物質(zhì)表面性質(zhì)對K影響很大)2）表面電荷的影響(鹽效應(yīng)：兩相系統(tǒng)中如存在鹽,對K影響較大)3）綜合考慮（影響因素很多，單因素定量很困難，最佳操作條件靠實驗）4）影響分配平衡的參數(shù)

(1)聚合物的影響；(2)體系中無機鹽離子的影響；

(3)體系PH的影響；(4)體系溫度的影響；

(5)體系中微生物的影響。第11頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五1）表面自由能的影響第12頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第13頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五2）表面電荷的影響道南電位(,Donnanpotential):實際雙水相系統(tǒng)中有電解質(zhì),當(dāng)這些離子在兩相中K1,則兩相間產(chǎn)生電位差U2，U1——相1和相2的電位

Z+,Z－——分別表示一種鹽的正負離子的離子價

F——法拉第常數(shù)

T——溫度第14頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五進一步可證明：InKi*=InKi+

ZiF(U2-U1)RTKi*——i組分帶電時在體系中的分配系數(shù)

Ki——i組分不帶電時在體系中的分配系數(shù)

Zi——i組分的離子價第15頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五意義：A

荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比.B由于同一雙水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的不同,故k與Zi的關(guān)系因鹽而異。第16頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五3）綜合考慮第17頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五4）影響分配平衡的參數(shù)(1)聚合物的影響A聚和物的分子量的影響

當(dāng)聚合物的分子量降低時，蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的相。例如在PEG—DeX系統(tǒng)中，PEG的分子量減小，會使分配系數(shù)增大，而葡聚糖的分子量減小，會使分配系數(shù)降低。這是一條普遍的規(guī)律，不論何種成相聚合物系統(tǒng)都適用。第18頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五B成相聚和物濃度的影響

當(dāng)接近臨界點時，蛋白質(zhì)均勻地分配于兩相，分配系數(shù)接近于1。如成相聚合物的總濃度或聚合物／鹽混合物的總濃度增加時，系統(tǒng)遠離臨界點，系線的長度也增加，此時兩相性質(zhì)的差別也增大，蛋白質(zhì)趨向于向一側(cè)分配，即分配系數(shù)或增大超過1，或減小低于1。第19頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五(2)體系中無機鹽離子的影響鹽離子在兩相中有不同的分配，因而在兩相間形成電位差，由于各相要保持電中性，因此對于帶電荷的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的萃取來說,鹽的存在就會使系統(tǒng)的電荷狀態(tài)改變,從而對分配產(chǎn)生顯著影響。鹽的種類對雙水相萃取也有一定的影響,因此變換鹽的種類和添加其他種類的鹽有助于提高選擇性。在不同的雙水相體系中鹽的作用也不相同。在PEG/磷酸鹽/水中加入氯化鈉可以使萬古霉素的分配系數(shù)由4提高到120,而在PEG/DeX/水體系中只從1.55提高到5。第20頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五(3)體系PH的影響pH會影響蛋白質(zhì)中可以離解基團的離解度，因而改變蛋白質(zhì)所帶電荷和分配系數(shù)。pH也影響磷酸鹽的離解程度，若改變H2PO4-和HPO42-之間的比例，也會使相間電位發(fā)生變化而影響分配系數(shù)。pH的微小變化有時會使蛋白質(zhì)的分配系數(shù)改變2—3個數(shù)量級。第21頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五交錯分配法(crosspartitioning):

當(dāng)加入不同種類的鹽時，由于相間電位不同，lnk–pH關(guān)系曲線也不一樣。但在pI處，k應(yīng)相同，即兩條關(guān)系曲線交于一點。所以,通過測定不同鹽類存在下lnk–pH曲線的交點,可測定蛋白質(zhì)/細胞器以及微粒的pI。血清蛋白第22頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五(4)體系溫度的影響

溫度影響小,一般溫度改變不影響產(chǎn)物的萃取。大規(guī)模操作一般在室溫下進行,不需冷卻。這是基于：

(1)成相聚合物PEG對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用,常溫下蛋白質(zhì)不會發(fā)生變性; (2)常溫下溶液粘度較低,容易相分離; (3)常溫操作節(jié)省冷卻費用.

第23頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五二、雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用

1.雙水相萃取法常用于胞內(nèi)酶提取和精制。目前已知的胞內(nèi)酶約2500種，但投入生產(chǎn)的很少。原因之一是提取困難。胞內(nèi)酶提取的第一步系將細胞破碎得到勻漿液，但勻漿液黏度很大，有微小的細胞碎片存在，欲將細胞碎片除去，過去是依靠離心分離的方法，但非常困難。雙水相系統(tǒng)可用于細胞碎片以及酶的進一步精制。第24頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第25頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第26頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第27頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五要成功地運用兩水相萃取的方法，應(yīng)滿足下列條件：欲提取的酶和細胞應(yīng)分配在不同的相中；酶的分配系數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時，經(jīng)過一次萃取，就能得到高的收率；兩相用離心機很容易分離。第28頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五工程方面的問題

在進行工業(yè)應(yīng)用時，需考慮達到萃取平衡所需的時間和兩相分離的設(shè)備。

在兩水相系統(tǒng)中，雖黏度高，但表面張力很低。因而進行攪拌時很易分散成微滴，故幾秒鐘即能達到平衡，且能耗也很少。兩相分離則比較困難，這是由于兩相密度差低和當(dāng)處理勻漿液時，粘度較大。由于粘度較高會引起阻塞，可采用自動排渣的噴嘴分離機。PEG/鹽更適合用重力沉降；PEG/DeX多用離心機。第29頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第30頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五在兩水相系統(tǒng)中進行生物轉(zhuǎn)化，如酶促反應(yīng)，可以把產(chǎn)物移入另一相中，消除產(chǎn)物抑制，因而提高了產(chǎn)率。這實際上是一種反應(yīng)和分離相耦合的過程，有時也稱為萃取生物轉(zhuǎn)化；如果發(fā)生的是一種發(fā)酵過程，則也稱為萃取發(fā)酵，因而此時也可以把兩水相系統(tǒng)稱為兩水相反應(yīng)器。2.兩水相反應(yīng)器第31頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五enzymeenzymeenzymeenzymeenzymeEnzymeticreactionsubstrateproduct第32頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五enzymeenzymeenzymeEnzymeticreactionwithATPS第33頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五要進行兩水相生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)應(yīng)滿足下列條件：催化劑應(yīng)單側(cè)分配；底物應(yīng)分配于催化劑所處的相中；產(chǎn)物應(yīng)分配在另一相中；要有合適的相比。如產(chǎn)物分配在上相中，則相比要大，反之則相比要小。這些條件不可能同時滿足，分配理論也不完善，因此常需要根據(jù)試驗選擇最優(yōu)系統(tǒng)和操作條件。第34頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五采用兩水相系統(tǒng)進行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)有下列優(yōu)點：與固定床反應(yīng)器相比，不需載體，不存在多孔載體中的擴散阻力，故反應(yīng)速度較快，生產(chǎn)能力較高；生物催化劑在兩水相系統(tǒng)中較穩(wěn)定；兩相間表面張力低，輕微攪拌即能形成高度分散系統(tǒng)，分散相液滴在10μm以下，有很大的表面積，有利于底物和產(chǎn)物的傳遞。第35頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五

初期的雙水相萃取過程仍以間歇操作為主。近年來,在天冬酶、乳酸脫氫酶、富馬酸酶與青霉素酰化酶等多種產(chǎn)品的雙水相萃取過程中均采用了連續(xù)操作,有的還實現(xiàn)了計算機過程控制。這不僅對提高生產(chǎn)能力,實現(xiàn)全過程連續(xù)操作和自動控制,保證得到高活性和質(zhì)量均一的產(chǎn)品具有重要意義,而且也標(biāo)志著雙水相萃取技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用正日趨成熟和完善。三、雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展第36頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五

雙水相分配技術(shù)作為一個很有發(fā)展前途的分離單元,除了具有上述獨特的優(yōu)點外,也有一些不足之處,如易乳化、相分離時間長、成相聚合物的成本較高、分離效率不高等,一定程度上限制了雙水相分配技術(shù)的工業(yè)化推廣和應(yīng)用。如何克服這些困難,已成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點,其中“集成化”概念的引人給雙水相分配技術(shù)注入了新的生命力,雙水相分配技術(shù)與其他相關(guān)的生化分離技術(shù)進行有效組合,實現(xiàn)了不同技術(shù)間的相互滲透,相互融合,充分體現(xiàn)了集成化的優(yōu)勢。例如：第37頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五(1)與溫度誘導(dǎo)相分離、磁場作用、超聲波作用、氣溶膠技術(shù)等實現(xiàn)集成化,改善了雙水相分配技術(shù)中諸如成相聚合物回收困難、相分離時間較長、易乳化等問題,為雙水相分配技術(shù)的進一步成熟、完善并走向工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

(2)與親和沉淀、高效層析等新型生化分離技術(shù)實現(xiàn)過程集成,充分融合了雙方的優(yōu)勢,既提高了分離效率,又簡化了分離流程。

(3)在生物轉(zhuǎn)化、化學(xué)滲透釋放和電泳等中引入雙水相分配,給已有的技術(shù)賦予了新的內(nèi)涵,為新分離過程的誕生提供了新的思路。第38頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五1.PEG衍生物：在PEG上引入親和基團或離子基團；

2.采用多級萃取。第39頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第40頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第四節(jié)反膠團萃取一、概述

反膠團(ReversedMicelles)是兩性表面活性劑在非極性有機溶劑中親水性基團自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的，內(nèi)含微小水滴的，空間尺度僅為納米級的集合型膠體。是一種自我組織和排列而成的，并具熱力學(xué)穩(wěn)定的有序構(gòu)造。第41頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五微膠團：水溶液中表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”水非極性的“核”極性“頭”非極性“尾”第42頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五反膠團：非極性有機溶劑中，表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”非極性有機溶劑極性“頭”極性的“核”非極性“尾”反微團內(nèi)溶解的水稱為微水相或水池第43頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第44頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五反膠團的微小界面和微小水相具有兩個特異性功能：

(1)具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜的功能；

(2)在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質(zhì)等保持活性。第45頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五反膠團萃取的優(yōu)點(1)有很高的萃取率和反萃取率，并具有選擇性；(2)分離、濃縮可同時進行，過程簡便；(3)能解決蛋白質(zhì)(如胞內(nèi)酶)在非細胞環(huán)境中迅速失活的問題；(4)由于構(gòu)成反膠團的表面活性劑往往具有細胞破壁功效，因而可直接從完整細胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶；(5)反膠團萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。第46頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五二、反膠團的形成1、反膠團的構(gòu)造：在膠體化學(xué)中，向水溶液中加入表面活性劑，并使其濃度超過一定數(shù)值時，表面活性劑就會在水相中形成膠團或微膠團，它是表面活性劑的聚集體。其親水性的極性端向外指向水溶液，疏水性的非極性“尾”向內(nèi)相互聚集在一起。當(dāng)向非極性有機溶劑中加入表面活性劑，并使其濃度超過一定數(shù)值時，也會在非極性溶劑內(nèi)形成表面活性劑的聚集體。與在水相中不同的是，其疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內(nèi)，與在水相中形成的微膠團方向相反，因而稱之為反膠團或反向膠團。第47頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第48頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五構(gòu)成反膠團的表面活性劑種類：陰離子表面活性劑AOT陽離子表面活性劑季銨鹽非極性有機溶劑：環(huán)己烷，庚烷，辛烷等分離蛋白質(zhì)時，使用最多的是陰離子型表面活性劑AOT。第49頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五2、反膠團的物理化學(xué)特性及制備（1）反膠團的物理化學(xué)特性①

反膠團的臨界膠團濃度表面活性劑在非極性有機溶劑中能形成反膠團的最小濃度②

反膠團含水率WW=C水/C表

W越大，反膠團的半徑越大第50頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第51頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五（2）反膠團的制備①注入法②相轉(zhuǎn)移法③溶解法第52頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五（1）注入法將含有蛋白質(zhì)的水溶液直接注入到含有表面性劑的非極性有機溶劑中去，然后進行攪拌直到形成透明的溶液為止。這種方法的過程較快并可較好地控制反膠團的平均直徑含水量。（2）相轉(zhuǎn)移法將酶或蛋白質(zhì)從主體水相轉(zhuǎn)移到含表面活劑的非極性有機溶劑中形成反膠團-蛋白質(zhì)溶液。即將含蛋白質(zhì)的水相與含表面活性劑的有機相接觸，在緩慢的攪拌下，一部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入（萃入）有機相。此過程較慢，但最終的體系處于穩(wěn)定的熱力學(xué)平衡狀態(tài)，這種方法可在有機溶劑相中獲得較高的蛋白質(zhì)濃度。（3）溶解法對非水溶性蛋白質(zhì)可用該法。將含有反膠團（W＝3-30）的有機溶液與蛋白質(zhì)固體粉末一起攪拌，使蛋白質(zhì)進入反膠團中，該法所需時間較長。含蛋白質(zhì)的反膠團也是穩(wěn)定的，這也說明反膠團“水池”中的水與普通水的性質(zhì)是有區(qū)別的。第53頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五1、反膠團萃取原理蛋白質(zhì)進入反膠團溶液是一協(xié)同過程。在有機溶劑相和水相兩宏觀相界面間的表面活性劑層,同鄰近的蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸引而變形,接著兩界面形成含有蛋白質(zhì)的反膠團

,然后擴散到有機相中,從而實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取。(可能機理）改變水相條件(如pH值、離子種類或離子強度),又可使蛋白質(zhì)從有機相中返回到水相中,實現(xiàn)反萃取過程。

三、反膠團萃取的理論基礎(chǔ)第54頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第55頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五2、蛋白質(zhì)的溶解模型a、水殼模型：蛋白質(zhì)位于水池的中心，周圍存在的水層將其與反膠團壁隔開；b、半島模型：pro表面存在強烈疏水區(qū)，該區(qū)直接與有機相接觸；c、pro吸附于反膠團內(nèi)壁；d、pro疏水區(qū)與幾個反膠團的疏水尾發(fā)生相互作用，被幾個小反膠團所“溶解”。第56頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五3、影響反膠團萃取的作用力1）決定分配系數(shù)的分離場-分離物質(zhì)間的相互作用

第57頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五溶解推動力

①靜電作用：理論上,當(dāng)溶質(zhì)所帶電荷與表面活性劑相反時,由于靜電引力的作用,溶質(zhì)易溶于反膠團,溶解率或分配系數(shù)較大,反之,則不能溶解到反膠團相中左圖為pH值對不同蛋白質(zhì)的溶解率急劇變化,當(dāng)pH＜pI,即在帶正電荷的pH范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的溶解率接近100%,說明靜電相互作用對蛋白質(zhì)的反膠團萃取起決定性作用。第58頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五

②空間相互作用

A.

鹽濃度增大對反膠團相產(chǎn)生脫水效應(yīng),含水率W0隨鹽濃度的增大而降低,反膠團直徑減小,空間排阻作用增大,

pro溶解下降。第59頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五B.在各pro的pI處(排除了靜電相互作用的影響)，反膠團萃取實驗研究表明:隨著M增大,pro的分配系數(shù)(m,溶解率)下降。表明隨M增大,空間排阻作用增大,pro的溶解率降低.

③疏水性相互作用

aa的疏水性各不相同,研究表明,aa或肽的m隨aa疏水性的增大而增大。蛋白質(zhì)的疏水性影響其在反膠團中的溶解形式,因而影響其分配系數(shù).疏水性較大的pro可能以“半島式”形式溶解。所以可以根據(jù)pro間M的差別選擇性對pro進行萃取分離。第60頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五2）反膠束萃取的影響因素水相的pH值

鹽離子的種類和濃度溫度

蛋白質(zhì)的分子量和濃度表面活性劑

第61頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五①水相的pH值

pH對萃取的影響主要體現(xiàn)在改變蛋白質(zhì)的表面電荷上。在pH小于蛋白質(zhì)的等電點(PI)時,蛋白質(zhì)表面帶正電荷;大于等電點時,蛋白質(zhì)帶負電荷。AOT是一種陰離子型表面活性劑,它所形成的反膠團的內(nèi)表面帶負電荷。當(dāng)水溶液的pH小于蛋白質(zhì)的等電點時,兩表面異電荷的吸引力使蛋白質(zhì)的萃取率接近100%。當(dāng)pH大于PI時,溶菌酶萃取率急劇下降,直到接近于零。第62頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第63頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五②鹽離子的種類第64頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五③鹽濃度鹽濃度W0S&ProZ萃取率第65頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五④溫度

溫度是影響蛋白質(zhì)萃取率的一個重要因素。一般來說,溫度的增加將使反膠團的含水量下降,因而不利于蛋白質(zhì)的萃取。通過提高溫度可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的反萃取。

第66頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五⑤蛋白質(zhì)分子量和濃度

蛋白質(zhì)的分子量對其萃取率有較大影響。例如溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的分子量分別為14300、23300、35000,AOT/異辛烷反膠團萃取它們的最大萃取率分別約為100%、90%、30%,表明分子量越大的蛋白質(zhì)越難萃取。用AOT反膠團體系萃取血紅蛋白時發(fā)現(xiàn),

蛋白質(zhì)濃度高時,萃取率降低;而蛋白質(zhì)濃度低時,萃取率較高。第67頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五⑥表面活性劑表面活性劑的類型目前最常用的反膠團或微乳液是AOT/異辛烷體系。一是AOT形成的反膠團較大,有利于蛋白質(zhì)的萃取;二是AOT形成反膠團時不需加入表面活性劑。表面活性劑的濃度當(dāng)其它條件一定時,表面活性劑濃度也存在某臨界值。小于此臨界值時,增大表面活性劑的濃度可提高蛋白質(zhì)的萃取率

,大于臨界值時,則無明顯影響第68頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第69頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五四、反膠團萃取的應(yīng)用

分離蛋白質(zhì)混合物；

濃縮α-淀粉酶；從發(fā)酵液中提取胞外酶；直接提取胞內(nèi)酶；用于蛋白質(zhì)復(fù)性。第70頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五案例一：通過三步分離操作分離了核糖核酸酶a、細胞色素c和溶菌酶。

第71頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第72頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五通過調(diào)節(jié)水相pH值和KCl濃度來實現(xiàn)三種蛋白質(zhì)的分離。在pH=9時，核糖核酸酶的溶解度很小，保留在水相而與其他兩種蛋白質(zhì)分離；相分離后得到的反膠團相（含細胞色素C和溶菌酶）與0.5mol/L的KCl水溶液接觸后，細胞色素C被反萃取到水相，而溶菌酶留在反膠團相；含溶菌酶的反膠團與2.0mol/LKCl，pH值為11.5的水相接觸后，將溶菌酶反萃至水相中。第73頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五案例二：使用二級混合-分離型萃取流程，用TOMAC/0.1%辛醇-異辛烷的溶液體系連續(xù)分離-淀粉酶，濃縮了17倍。(圖)第74頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第75頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五案例三：胞內(nèi)酶的提取第76頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五

大量的研究工作已經(jīng)證明了反膠團萃取法提取蛋白質(zhì)的可行性與優(yōu)越性。不管是自然細胞還是基因工程細胞中的產(chǎn)物都能被分離出來;不僅發(fā)酵濾液和濃縮物可通過反膠團萃取進行處理,就是發(fā)酵清液也可同樣進行加工。不僅是蛋白質(zhì)和酶都能被提取,還有核酸、氨基酸和多肽也可順利地溶于反膠團。然而反膠團萃取在真正實用之前還有許多有待于研究和解決的問題,例如表面活性劑對產(chǎn)品的沾染、工業(yè)規(guī)模所需的基礎(chǔ)數(shù)據(jù);反膠團萃取過程的模擬和放大技術(shù)等。盡管如此,用反膠團萃取法大規(guī)模提取蛋白質(zhì)由于具有成本低、溶劑可循環(huán)使用、萃取和反萃取率都很高等優(yōu)點,正越來越多地為各國科技界和工業(yè)界所研究和開發(fā)。第77頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第五節(jié)超臨界流體萃取

（supercriticalfluid,SCF）

一、序言超臨界流體萃?。菏菍⒊R界流體作為萃取溶劑的一種萃取技術(shù)，它兼有傳統(tǒng)的蒸餾和液液萃取的特征，是適用面很廣的一門新型分離技術(shù)。第78頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五超臨界流體：是一種物質(zhì)狀態(tài)，當(dāng)物質(zhì)在超過臨界溫度及臨界壓力以上，氣體與液體的性質(zhì)會趨近于類似，最后會達成一個均勻相的流體現(xiàn)象。超臨界流體類似氣體，具有可壓縮性，可以像氣體一樣發(fā)生瀉流，而且又兼具有類似液體的流動性，密度一般都介于0.1到1.0g/ml之間。通常有二氧化碳（CO2

）、水、氮氣（N2

）、氧化二氮（N2O）、乙烯（C2H4）、三氟甲烷（CHF3

）等。

第79頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第80頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五超臨界流體（SCF）的特性物質(zhì)狀態(tài)

密度（g/cm3）粘度(g/cm/s)擴散系數(shù)(cm2/s)氣態(tài)(0.6-2)×10-3(1-3)×10-4

0.1-0.4液態(tài)0.6-1.6(0.2-3)×10-2

(0.2-2)×10-5

SCF0.2-0.9(1-9)×10-4

(2-7)×10-4

由以上特性可以看出，超臨界流體兼有液體和氣體的雙重特性，擴散系數(shù)大，粘度小，滲透性好，與液體溶劑相比，可以更快地完成傳質(zhì)，達到平衡，促進高效分離過程的實現(xiàn)。第81頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五超臨界流體的密度接近液體，因此具有與液體相近的溶解能力。超臨界流體的粘度和擴散系數(shù)又與氣體相近似，而溶劑的低黏度和高擴散系數(shù)的性質(zhì)是有利于傳質(zhì)的。由于以上特點，超臨界流體可以迅速滲透到物體的內(nèi)部，溶解目標(biāo)物質(zhì)，快速達到萃取平衡。第82頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五二、超臨界流體的萃取原理

相似相溶原理：物質(zhì)之間的溶解能力主要取決于物質(zhì)分子之間的相似性，一是分子結(jié)構(gòu)相似，二是分子間的作用力相似。而分子結(jié)構(gòu)之間的相似相溶在很大程度上也可以歸結(jié)到作用能的相似上。在超臨界氣體萃取溶劑（接近于液體密度）中，溶質(zhì)的溶解度和在真空中的溶解度相比，可大幅度增加（一億多倍）。第83頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五

在超臨界流體萃取中，主要是溶劑流體密度的大幅度增加導(dǎo)致溶劑對溶質(zhì)的作用力大幅度增加，從而形成了溶解物質(zhì)的能力，這個特性給溶劑流體回收、溶劑與溶質(zhì)分離帶來方便。在超臨界萃取后的分離操作中，可在與萃取溫度相同的條件下，降低壓力使溶劑的密度下降，引起其溶解物質(zhì)的能力下降，就可以方便地進行萃取物與溶劑的分離。第84頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第85頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五提高萃取劑選擇性的基本原則是：①按相似相溶原則，選用的超臨界流體與被萃取物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)越相似，溶解能力就越大。②從操作角度看，使用超臨界流體為萃取劑時的操作溫度越接近臨界溫度，溶解能力也越大。第86頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五常用萃取劑極性萃取劑：乙醇、甲醇、水（難）非極性萃取劑：二氧化碳（易）超臨界二氧化碳臨界點：Tc=31.26℃、Pc=7.2MPa

優(yōu)點：缺點：臨界條件溫和設(shè)備投資大產(chǎn)品分離簡單無毒、無害不燃無腐蝕性價格便宜第87頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五三、超臨界CO2的溶劑特征１、超臨界CO2

的相圖：在臨界點附近，密度線聚集于臨界點周圍，壓力或溫度小范圍的變化，就會引起CO2

密度的大幅度變化。由于CO2溶解、萃取物質(zhì)的能力與CO2

本身的密度成正比，這就意味著只要通過改變壓力或溫度來改變?nèi)軇〤O2

的密度，就可以改變其對物質(zhì)的溶解能力。特性：

通過壓力或溫度的改變可有效地萃取和分離溶質(zhì)。第88頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五特點:在臨界點附近,密度有很寬的變化范圍;通過溫度、壓力微調(diào)，可使密度顯著變化第89頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五２、萃取溶劑CO2的性質(zhì)

無毒，無腐蝕性，不可燃燒，純度高且價格低。有優(yōu)良的傳質(zhì)性能，擴散系數(shù)大；粘度低，與其他超臨界流體溶劑相比，CO2

具有相對較低的臨界壓力和臨界溫度，適于處理熱敏性生物制品和天然產(chǎn)物。

第90頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五物質(zhì)沸點/℃臨界點數(shù)據(jù)臨界溫Tc/℃臨界壓Pc/Mpa臨界密度ρ/(g/cm3)二氧化碳－78.531.067.390.448水100374.222.000.344乙烷－88.032.44.890.203乙烯－103.79.55.070.20丙烷－44.5974.260.220丙烯－47.7924.670.23n–丁烷－0.5152.03.800.228n–戊烷36.5196.63.370.232n–己烷69.0234.22.970.234甲醇64.7240.57.990.272乙醇78.2243.46.380.276異丙醇82.5235.34.760.27苯80.1288.94.890.302甲苯110.63184.110.29氨－33.4132.311.280.24甲烷－164.0－83.04.60.16常用超臨界流體的臨界性質(zhì)表第91頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五

四、SC—C02萃取以及拖帶劑的作用１、SC—C02萃?。?/p>

天然產(chǎn)品中通常含有許多不同的化學(xué)成分；對同一天然產(chǎn)品用不同方法或不同萃取劑提取得到的制品，其組分是不同的。逐步增加溶劑C02

的溶解能力，可以獲得各種質(zhì)量不同的萃取產(chǎn)物。２、拖帶劑的作用：

添加拖帶劑即輔助溶劑，可增加物質(zhì)的溶解度和萃取選擇性。如在C02

中添加約14％的丙酮后，甘油酯的溶解度增加22倍。純C02幾乎不能從咖啡豆中萃取咖啡因，但在加濕(水)的SC—C02

中，因為生成了具有極性的H2CO3，在一定的條件下，能選擇性地溶解萃取極性的咖啡因。第92頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第93頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第94頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第95頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五五、SC—C02萃取流程

SC—C02萃取流程：萃取流程基本上是由萃取工段和分離工段(溶質(zhì)和C02的分離)組合而成。第96頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五代表性的三種流程模式圖第97頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五壓縮機

萃取釜

制冷MVC-760L

二氧化碳循環(huán)泵

第98頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五六、工業(yè)化超臨界CO2萃取設(shè)備1.國產(chǎn)設(shè)備的生產(chǎn)情況南通市華安超臨界萃取有限公司

第99頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五海安縣石油科技儀器有限公司（南通市華安超臨界萃取有限公司），系中國石油天然氣集團（股分）公司、中國石油化工集團（股份）公司、中國海洋石油總公司定點生產(chǎn)企業(yè)，公司具有近四十年研發(fā)和生產(chǎn)石油儀器設(shè)備的豐富經(jīng)驗。本公司自1989年起，在清華大學(xué)、中科院、大專院校等專家學(xué)者的關(guān)心指導(dǎo)下，主攻超臨界CO2萃取設(shè)備國產(chǎn)化研制生產(chǎn)，十多年來，已形成中、小試驗（生產(chǎn)）裝置系列化生產(chǎn)能力，產(chǎn)品遍布全國各地，并出口美國、韓國等國家。部分藥廠通過該裝置生產(chǎn)的新藥已報批國家級新藥并出口。該裝置通過省級鑒定，處于國內(nèi)領(lǐng)先，主要技術(shù)指標(biāo)和關(guān)鍵設(shè)備達到世界同類裝置先進水平。該項目已列入國家火炬計劃和國家級新產(chǎn)品，企業(yè)被評定為江蘇省高新技術(shù)企業(yè)，南通市首批誠信納稅企業(yè)。公司技術(shù)力量雄厚，設(shè)備精良，工藝先進，檢測手段齊全。公司實驗室備有樣機，供用戶和科研單位來公司共同開發(fā)研究。

該裝置采用CO2作添加劑，主要應(yīng)用：醫(yī)藥、食品、香精、香料等有效成份的提取，精細分離。裝置由萃取釜、分離釜、精餾柱、CO2泵等組成。

第100頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五

美晨集團股份有限公司第101頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五美晨集團前身始建于1896年，是中國最早的牙膏專業(yè)生產(chǎn)廠家之一，自1993年由廣州牙膏廠轉(zhuǎn)為股份制企業(yè)——廣州美晨股份有限公司以來，幾經(jīng)改革創(chuàng)新，股本構(gòu)成發(fā)生了深刻的變化，現(xiàn)已成為“職工控股96%、國家持股4%”的股份制企業(yè)。美晨集團也由單一產(chǎn)業(yè)的日化企業(yè)發(fā)展成為生產(chǎn)經(jīng)營口腔護理品、食品添加劑、化妝護膚品、現(xiàn)代中藥、保健品、高新分離技術(shù)設(shè)備，同時經(jīng)營房產(chǎn)物業(yè)以及進出口業(yè)務(wù)的多元化、綜合性高新科技企業(yè)，是經(jīng)國家工商總局正式審批成立的跨區(qū)域、跨行業(yè)，集科、工、貿(mào)、投資于一體的大型企業(yè)集團。

第102頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五北京超流萃取技術(shù)研究所：超臨界流體萃取工業(yè)化設(shè)備完整解決方案

第103頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五設(shè)計、提供工業(yè)化超臨界連續(xù)萃取生產(chǎn)線裝置。對外進行專利技術(shù)轉(zhuǎn)讓。第104頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五云南亞太致興生物工程研究所第105頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五用超臨界多元流體萃取取代超臨界二氧化碳萃取的技術(shù)，一直堅持研究開發(fā)至今，公開發(fā)表過有關(guān)超臨界多元流體的文章十余篇，申報發(fā)明專利四項，法人代表王振錕擔(dān)任過火炬計劃產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的項目負責(zé)人。超臨界流體技術(shù)領(lǐng)域?qū)⒂瓉碡ヒ皇兰o(jì)的綠色產(chǎn)業(yè)革命，其涉及的產(chǎn)業(yè)較廣，諸如醫(yī)藥、食品、能源、航天、海洋工程、生物技術(shù)、化工、輕紡、環(huán)保工程等。

第106頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五2.國外設(shè)備的生產(chǎn)情況德國伍德公司第107頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五德國伍德有限公司是行業(yè)頂級企業(yè)。公司創(chuàng)建于1921年，是目前世界十大化工工程公司之一。該公司原是工程師Uhde開辦的設(shè)計所，后來為大化工公司赫斯特（HOECHST）收買。赫斯特集團內(nèi)各子公司實行專業(yè)分工，有各類化工產(chǎn)品生產(chǎn)廠，化工設(shè)備制造廠，以及多達4000名科研人員的研究中心和職工教育訓(xùn)練中心等，而伍德公司則是赫斯特的專業(yè)設(shè)計公司。伍德公司的工程設(shè)計部門有職工2100人，承包煉油、合成氨、化肥、有機化工原料、合成樹脂、合成纖維、氯堿、釀造食品、環(huán)境保護和核技術(shù)等方面的工程建設(shè)，是一個比較全面的化工工程公司。它的氯堿、硝酸、黃磷、乙醛等技術(shù)，在世界上享有很高的聲譽。它曾為50余個國家和地區(qū)承包過各處化工裝置的建設(shè)。每年在三十幾個工程地點開展工作，年營業(yè)額3-5億美元。第108頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五美國SupercriticalProcessingInc.第109頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五七、超臨界流體萃取技術(shù)的應(yīng)用1）生物活性物質(zhì)和生物制品的提取

2）超臨界狀態(tài)下的酶促反應(yīng)

3）SC—C02的細胞破壁技術(shù)

4）超臨界流體干燥技術(shù)

第110頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第111頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五第112頁，共123頁，2022年，5月20日，8點51分，星期五2）SC—C02作為酶促反應(yīng)介質(zhì)的優(yōu)點①與水相比較，脂溶性底物和產(chǎn)物可溶于SC—C02

中，酶蛋白不溶解，有利于三者的分離。②產(chǎn)品回收時，不需要處理大量的稀水溶液，因而不產(chǎn)生廢水污染問題。③與其他非水相有機溶劑中的酶催化反應(yīng)相比，SC—C02更適合與生物、食品相關(guān)的產(chǎn)品體系，產(chǎn)物分離簡單。④與萃取一樣，SC—C02中的質(zhì)量傳遞速度快，