核酶課件講義整理

第十二章核酶第一節(jié)ribozyme第二節(jié)脫氧核酶槍配澤叭盆妖貓疥水剩動普袱蘸銹倡市庶蒲丁轟改設(shè)桅痛綢躥律廳捏真瑞第十二章核酶第十二章核酶第十二章核酶第一節(jié)ribozyme槍配澤叭盆妖貓疥水剩動1第一節(jié)ribozyme一、ribozyme的發(fā)現(xiàn)二、ribozyme的概念三、ribozyme的種類四、ribozyme研究進展與展望隋燼爛貢綜嗡直允貨炮塹挨捕鶴綴騁綽瑣靈擅主鈾瑤靡波牽服禾碳粘崔豐第十二章核酶第十二章核酶第一節(jié)ribozyme一、ribozyme的發(fā)現(xiàn)隋燼爛貢綜220世紀(jì)80年代初期，美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校的T.Cech在研究四膜蟲rRNA前體的剪接時發(fā)現(xiàn)，其26SRNA具有自我催化活性，由此提出了核酶的概念。美國耶魯大學(xué)的S.Altman在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了RNaseP具有生物催化功能，從而改變了生物催比劑的傳統(tǒng)概念。為此，T.Cech和S.Altman共同獲得了1989年度諾貝爾化學(xué)獎。一、ribozyme的發(fā)現(xiàn)岡島匆叭鬃斡懶紙晚正炯憤演暫逗蹬谷諱官敞吉肯敲彭刮贛打鎳就鐐饒轟第十二章核酶第十二章核酶20世紀(jì)80年代初期，美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校的T.Cec3

四膜蟲26SrRNA前體內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子、外顯子的剪接點核酶的發(fā)現(xiàn)：內(nèi)含子的切除反應(yīng)發(fā)生在含有核苷酸和純化的26SrRNA前體而不含有任何蛋白質(zhì)催化劑的溶液中，可能的解釋只能是:內(nèi)含子切除是由26SrRNA前體自身催化的，而不是蛋白質(zhì)。核酶的證實：將編碼26SrRNA前體DNA克隆到細菌中并且在無細胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄成26SrRNA前體分子。結(jié)果表明這種人工制備的26SrRNA前體分子在沒有任何蛋白質(zhì)催化劑存在的情況下，切除了前體分子中的內(nèi)含子。這種現(xiàn)象為自我剪接(self-splicing)，這是人類第一次發(fā)現(xiàn)RNA具有催化化學(xué)反應(yīng)的活性，織罰揖搽膩川餌環(huán)參靡牛盈篡腐私局朔換毒財偷宏混口鐐?cè)蕱虐ぴ烦醭吹谑潞嗣傅谑潞嗣杆哪はx26SrRNA前體內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子、外顯4二、ribozyme概念概念：具有催化功能的RNA分子，是生物催化劑。又稱核酸類酶、酶RNA、核酶類酶RNA。特點：核酶的作用底物可以是不同的分子,或者作用底物是同一RNA分子中的某些部位。與蛋白質(zhì)酶相比：核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。

聘劫謾靶翰舍街甫捂坯衰將炊翻焉嚎筒幼鼠寶博巍局瘡瞅撩垂紫遠酶畜曙第十二章核酶第十二章核酶二、ribozyme概念概念：具有催化功能的RNA分子，是生5核酶的功能：

1.

核苷酸轉(zhuǎn)移作用。

2.

水解反應(yīng)，即磷酸二酯酶作用。

3.

磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，類似磷酸轉(zhuǎn)移酶作用。

4.

脫磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。

5.

RNA內(nèi)切反應(yīng)，即RNA限制性內(nèi)切酶作用。擦猛用佐舜錐貶燼房妻雙敞啼腹簡蓑嗅壘樟倍側(cè)謎結(jié)蚜衣參攏兒喝偽墊身第十二章核酶第十二章核酶核酶的功能：

1.

核苷酸轉(zhuǎn)移作用。

2.

水解反應(yīng)6三、Ribozyme的種類根據(jù)作用方式分為：剪切型（把RNA前體的多余部分切除），剪接型（把RNA前體的內(nèi)含子部分切除并把不連續(xù)的外顯子部分連接起來）根據(jù)所作用的底物不同分為：自體催化（催化分子內(nèi)反應(yīng)）異體催化（催化分子間反應(yīng)）躍寨僳荔送屹豢斡搐秉尊吠仿噬儈貢勵償塞巒輪宿瑯關(guān)滿甸厭眩賜擲貯憫第十二章核酶第十二章核酶三、Ribozyme的種類根據(jù)作用方式分為：躍寨僳荔送屹豢7

I型內(nèi)含子:來源rRNA剪接型核酶II型內(nèi)含子:來源MTRNA錘頭核酶:來源植物病毒剪切型核酶發(fā)夾核酶自體催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶：來源人類病毒RNaseP：來源tRNA的成熟異體催化

盛撂敲遣昔詢般潤鏡床射葉粟壩襟始版遷淫瓜聯(lián)恍耗頁壤拿戳扎洞消兢殷第十二章核酶第十二章核酶I型內(nèi)含子:來源rRNA盛撂敲遣昔詢8根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)和催化反應(yīng)：RNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物：核糖核酸酶P。小分子的RNA：能夠進行分子內(nèi)自我切割反應(yīng)，且不需蛋白質(zhì)參與。這些RNA分子可以分為兩個部分，一部分是底物，另一部分是酶。將具有酶活性的序列克隆后可制成人工核酶去作用于獨立的底物。Ⅰ、Ⅱ型內(nèi)含子：將自身從前體mRNA中剪接出去的作用共同點：都涉及磷酸二酯鍵的切割或連接。它們作用的底物是RNA，可以是RNA分子本身，也可以是別的RNA分子。

居況塔茬倆暇為醫(yī)崗痰索絨孤礙理鹼處犁牢允禮榜光棟頓巴敷氖藻死佐桔第十二章核酶第十二章核酶根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)和催化反應(yīng)：居況塔茬倆暇為醫(yī)崗痰索絨孤礙理鹼處9幾種能進行自我剪切的RNA結(jié)構(gòu)

小分子核酶常見類型：錘頭、發(fā)夾、HDV催化特點：產(chǎn)生5-OH、2,3-環(huán)狀磷酸基末端灌仿廣援浦娜岡岔揣稚賞藉償援礙南抽鈴閣借炳富啡兇喇閣唉虹剿撼詳?shù)实谑潞嗣傅谑潞嗣笌追N能進行自我剪切的RNA結(jié)構(gòu)

小分子核酶常見類型：錘頭、發(fā)10I型內(nèi)含子剪接，圖中的pG可以是GTP、GDP或是GMP特點：I型需要游離的鳥苷或其磷酸化的衍生物的參與，剪接過程中，內(nèi)含子先以線性形式被釋放，然后再轉(zhuǎn)變成一個片段和一個環(huán)狀分子。晰封爽漁撕酗澡酪佛朱酗煞劈厭胸綠吶郴耐盲毯霄側(cè)寞集董衷軒賤躲懷摘第十二章核酶第十二章核酶I型內(nèi)含子剪接，圖中的pG可以是GTP、GDP或是GMP11Ⅱ型內(nèi)含子剪接特點：Ⅱ型內(nèi)含子的切除要形成套索結(jié)構(gòu)，以套索的形式釋放內(nèi)含子辛接虱便絕騁辨厄鑼據(jù)晾名飄滓緘脫結(jié)村君貌鄧韋錄又霞觀屑釋衙忠鍛孔第十二章核酶第十二章核酶Ⅱ特點：Ⅱ型內(nèi)含子的切除要形成套索結(jié)構(gòu)，以套索的形式釋放內(nèi)含12四、Ribozyme研究進展與展望對各種已知ribozyme結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究。可找出其結(jié)構(gòu)功能域和必需基團，據(jù)此可進行分子改造，以獲得分子更小的、高效的ribozyme。研究熱點：從催化分子內(nèi)反應(yīng)的自我剪切ribozyme設(shè)計出催化分子間反應(yīng)的ribozyme。薄絞戳確統(tǒng)哭害胚沽萬攢茫泥胯券指議貢襯婁琵俄壽沒再質(zhì)焙徘木允逐勺第十二章核酶第十二章核酶四、Ribozyme研究進展與展望對各種已知r131、抗病毒方面的研究HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，是核酶應(yīng)用研究的理想靶標(biāo)。HIV主要攻擊T淋巴細胞，破壞機體的免疫系統(tǒng)，使抗病能力降低，導(dǎo)致死亡。Wong等(1998)利用發(fā)卡型核酶抑制HIV-1基因表達，在一期臨床試驗中，用帶有發(fā)夾狀核酶的載體體外轉(zhuǎn)染患者的T細胞,然后再將這些T細胞重新輸入到患者體內(nèi)，結(jié)果顯示患者體內(nèi)HIV-1的滴度降低。在的二期臨床試驗中，Mitsuyasu等(2009)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將抗HIV核酶導(dǎo)入到造血干細胞中，然后將造血干細胞注入到感染HIV的患者體內(nèi)，結(jié)果38名患者攜帶了該種療法所使用的完整拷貝。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCR5是HIV-1R5毒株的重要細胞復(fù)合受體之一，該受體在HIV-1感染初期起重要的作用，但是它的缺失對宿主是無關(guān)的，因此CCR5可作為核酶切割的理想靶點。將援點奄蜀忍猩躍觸立蓑辜甕梯靡廈沈付析眨氰鈕渡瓤機踞葦忍榆巨撞串第十二章核酶第十二章核酶1、抗病毒方面的研究HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，是核酶應(yīng)用研究的14

HBV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。其生活史如下：

HBV進入肝細胞在宿主酶作用下以負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈DNA形成共價閉合環(huán)狀DNA在宿主RNA聚合酶作用下合成mRNA(亦稱前基因組RNA,pgRNA)在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成負(fù)鏈DNA在HBVDNA聚合酶作用下合成正鏈DNA形成子代閉合環(huán)狀DNA。由于HBV的復(fù)制必須經(jīng)過RNA的過程，所以可設(shè)計特異性核酶用于切割RNA，從而阻斷HBV的復(fù)制過程。旅箕哺帛宛使葬懲椽類操荒月鵑頓蠻艷鋇騁錫捆泄父班葵拘重蜀出熾蛹篆第十二章核酶第十二章核酶HBV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。其生活史如下：旅箕哺帛宛使葬懲椽類15Fritz等(1992)合成了針對HBVpgRNA的3個不同的核酶，直接作用于體外轉(zhuǎn)錄獲得的HBV的pgRNA，結(jié)果顯示這3個核酶都能準(zhǔn)確地切割底物RNA，表明HBVRNA易被核酶切割。欒中華等(2005)將HDV核酶基因序列構(gòu)建到原核載體中,并轉(zhuǎn)染細胞,通過ELISA檢測和定量PCR測定載體的抑制效果，篩選出了兩種抑制效率高的HBV核酶,抑制率達68%。王傳璽等(2007)將HBV核酶基因轉(zhuǎn)入重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV/U6中，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞株等方法，構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在包裝細胞系中能生產(chǎn)高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒，有效抑制HepG2215細胞內(nèi)HBV的復(fù)制。補樣膏拼慈勵講道遺疽東竅烘江偶逼善遵冗躥刊橇銻碘膜腺炎做世宋繳薯第十二章核酶第十二章核酶Fritz等(1992)合成了針對HBVpgRNA的162、核酶的抗腫瘤作用針對多藥耐藥性基因設(shè)計核酶多藥耐藥性(multidrugresistnce,MDR)是指腫瘤細胞對一種化療藥物表現(xiàn)出耐藥性，同時對其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用靶點亦不相同的化療藥物也表現(xiàn)出交叉耐藥的現(xiàn)象，是通過化療藥物治療腫瘤急需突破的一大難題?？鍥鍪蚩仫湽嵔Y(jié)砍果址裝當(dāng)隸抄尺油宴耙頃對潔波蛻鏡躁憂尾何偷導(dǎo)第十二章核酶第十二章核酶2、核酶的抗腫瘤作用針對多藥耐藥性基因設(shè)計核酶垮涼黍控餃哈孝17Hiroyuki(1993)設(shè)計一個特異性切割MDR1mRNA序列的錘頭狀核酶，在體外對MDR1mRNA進行切割，顯示錘頭狀核酶能切割MDR1mRNA且使MDR恢復(fù)顯性。Wang等(2003)設(shè)計并合成一個抗MDR1的錘頭狀核酶，由一個含有RNA聚合酶П啟動子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其輸送到人肝癌細胞系HepG2中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了錘頭狀核酶的細胞對阿霉素敏感，并有MDR1表達量的降低。這說明無論用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還是用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染抗MDR1的核酶都有可能有選擇的適用于MDR的治療。Gao等(2007)在體外使重組核酶僅在乳腺癌細胞中表達，而在非乳腺癌細胞中不表達；化學(xué)敏感性評估結(jié)果顯示在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞中，對阿霉素的抗藥性降低了15倍,對長春花堿的抗藥性降低32倍。竣圾付統(tǒng)葷怠鷗嗚容上檬僻愧構(gòu)棕畸描帚看沒假績嚨寥譬俞斜靳戀某資高第十二章核酶第十二章核酶Hiroyuki(1993)設(shè)計一個特異性切割MDR1mR18核酶展望核酶能切割致病基因的mRNA，通過使其mRNA斷裂來抑制致病基因的翻譯及表達，從而達到預(yù)防及治療疾病的目的；核酶具有高度的特異性,它只對能與其互補的mRNA發(fā)揮切割作用，而對宿主細胞沒有任何副作用，因此它是極安全的基因治療工具。虜年戶概盜膚聰人瓊唆拓毒立喊碳火枯裙羅迪酉盤茲軒鉛缺慰蒸背焦校筍第十二章核酶第十二章核酶核酶展望核酶能切割致病基因的mRNA，通過使其mRNA斷裂191、核酶的本質(zhì)是RNA分子，極易被RNA酶降解。如何能提高核酶的穩(wěn)定性？2、要使核酶發(fā)揮最佳的催化活性，必須解決時間和空間問題，既要使核酶在合適的時間表達，還要使核酶及其切割底物在細胞的某一特定空間相互作用。3、核酶的催化作用還依賴于病毒的滴度在病毒滴度低的時候其切割活性明顯，病毒滴度較高時，其切割活性顯著降低。？沫諒會別毫洽妊停殷巋洗貍盤懇球晨貶背合脖嫉斧廉肩舒脊結(jié)敖剔秧佳浩第十二章核酶第十二章核酶1、核酶的本質(zhì)是RNA分子，極易被RNA酶降解。如何能提高20第二節(jié)脫氧核酶一、概念利用體外分子進化技術(shù)合成的一種具有有高效的催化活性和結(jié)構(gòu)識別能力的單鏈DNA片段。同單鏈RNA分子一樣，能進行折疊、催化和展現(xiàn)酶活性。未發(fā)現(xiàn)自然界中存在天然的脫氧核酶。根據(jù)催化功能的不同，可以將脫氧核酶分為5大類：切割RNA的脫氧核酶、切割DNA的脫氧核酶、具有激酶活力的脫氧核酶、具有連接酶功能的脫氧核酶、催化卟啉環(huán)金屬螯合反應(yīng)的脫氧核酶。惡彰哨峰率鴻甩煥絳盜嘶帚惰丙輻胃醬閩斡胃腦還郴漓搖滬開膨緣蛤譴龐第十二章核酶第十二章核酶第二節(jié)脫氧核酶一、概念惡彰哨峰率鴻甩煥絳盜嘶帚惰丙輻胃醬21脫氧核酶分子的構(gòu)建是通過擴增事先固定在固相載體上的具有自我裂解功能的活性分子實現(xiàn)。1、建立具有多樣性的DNA分子庫，其中的每一條分子兩端的序列固定；2、利用針對這些序列的PCR引物進行擴增。設(shè)計引物時，使PCR產(chǎn)物的一條鏈上5’-C端帶上生物素,并插入一個三磷酸核苷，將這些嵌合分子通過5’-C端的生物素固定在固相載體上，給予一定的條件使其進行自我裂解；3、具有裂解功能的分子鏈內(nèi)裂解后,從固相載體上脫離下來。再利用上述PCR引物進行下一輪的選擇。直至所選出的分子的裂解活性達到一定水平；4、將PCR產(chǎn)物克隆,測序。便得到具有自我裂解活性的DNA分子的序列。分仿墑耐凡凝鋪幕呵韋奴衰敗譽胞鞭渤氧從綻伍淋吾閱亦虹寺報噎健埔煉第十二章核酶第十二章核酶脫氧核酶分子的構(gòu)建是通過擴增事先固定在固相載體上的具有自我裂22二、脫氧核酶的結(jié)構(gòu)Carmi等通過體外選擇技術(shù)合成了一種依賴Ca2+的具有自我切割功能的手槍型二級結(jié)構(gòu)脫氧核酶分子。擒砌綢創(chuàng)士磚醉奢宇咽味隨孵秦淌諧酸慰埃通預(yù)膏然臺芹大作陳診壇謊么第十二章核酶第十二章核酶二、脫氧核酶的結(jié)構(gòu)Carmi等通過體外選擇技術(shù)合成了一種依賴23三、脫氧核酶的催化特性1、穩(wěn)定性高2、催化作用高效3、活性依賴金屬離子4、特異性強5、容易獲得府閑衙球俞鑒綿決藩堯酚缸詭書立斥咀茄旋亂癌坡仲診鍘柜鬃酷盞骸添莉第十二章核酶第十二章核酶三、脫氧核酶的催化特性1、穩(wěn)定性高府閑衙球俞鑒綿決藩堯酚缸詭24第十二章核酶第一節(jié)ribozyme第二節(jié)脫氧核酶槍配澤叭盆妖貓疥水剩動普袱蘸銹倡市庶蒲丁轟改設(shè)桅痛綢躥律廳捏真瑞第十二章核酶第十二章核酶第十二章核酶第一節(jié)ribozyme槍配澤叭盆妖貓疥水剩動25第一節(jié)ribozyme一、ribozyme的發(fā)現(xiàn)二、ribozyme的概念三、ribozyme的種類四、ribozyme研究進展與展望隋燼爛貢綜嗡直允貨炮塹挨捕鶴綴騁綽瑣靈擅主鈾瑤靡波牽服禾碳粘崔豐第十二章核酶第十二章核酶第一節(jié)ribozyme一、ribozyme的發(fā)現(xiàn)隋燼爛貢綜2620世紀(jì)80年代初期，美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校的T.Cech在研究四膜蟲rRNA前體的剪接時發(fā)現(xiàn)，其26SRNA具有自我催化活性，由此提出了核酶的概念。美國耶魯大學(xué)的S.Altman在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了RNaseP具有生物催化功能，從而改變了生物催比劑的傳統(tǒng)概念。為此，T.Cech和S.Altman共同獲得了1989年度諾貝爾化學(xué)獎。一、ribozyme的發(fā)現(xiàn)岡島匆叭鬃斡懶紙晚正炯憤演暫逗蹬谷諱官敞吉肯敲彭刮贛打鎳就鐐饒轟第十二章核酶第十二章核酶20世紀(jì)80年代初期，美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校的T.Cec27

四膜蟲26SrRNA前體內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子、外顯子的剪接點核酶的發(fā)現(xiàn)：內(nèi)含子的切除反應(yīng)發(fā)生在含有核苷酸和純化的26SrRNA前體而不含有任何蛋白質(zhì)催化劑的溶液中，可能的解釋只能是:內(nèi)含子切除是由26SrRNA前體自身催化的，而不是蛋白質(zhì)。核酶的證實：將編碼26SrRNA前體DNA克隆到細菌中并且在無細胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄成26SrRNA前體分子。結(jié)果表明這種人工制備的26SrRNA前體分子在沒有任何蛋白質(zhì)催化劑存在的情況下，切除了前體分子中的內(nèi)含子。這種現(xiàn)象為自我剪接(self-splicing)，這是人類第一次發(fā)現(xiàn)RNA具有催化化學(xué)反應(yīng)的活性，織罰揖搽膩川餌環(huán)參靡牛盈篡腐私局朔換毒財偷宏混口鐐?cè)蕱虐ぴ烦醭吹谑潞嗣傅谑潞嗣杆哪はx26SrRNA前體內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子、外顯28二、ribozyme概念概念：具有催化功能的RNA分子，是生物催化劑。又稱核酸類酶、酶RNA、核酶類酶RNA。特點：核酶的作用底物可以是不同的分子,或者作用底物是同一RNA分子中的某些部位。與蛋白質(zhì)酶相比：核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。

聘劫謾靶翰舍街甫捂坯衰將炊翻焉嚎筒幼鼠寶博巍局瘡瞅撩垂紫遠酶畜曙第十二章核酶第十二章核酶二、ribozyme概念概念：具有催化功能的RNA分子，是生29核酶的功能：

1.

核苷酸轉(zhuǎn)移作用。

2.

水解反應(yīng)，即磷酸二酯酶作用。

3.

磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，類似磷酸轉(zhuǎn)移酶作用。

4.

脫磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。

5.

RNA內(nèi)切反應(yīng)，即RNA限制性內(nèi)切酶作用。擦猛用佐舜錐貶燼房妻雙敞啼腹簡蓑嗅壘樟倍側(cè)謎結(jié)蚜衣參攏兒喝偽墊身第十二章核酶第十二章核酶核酶的功能：

1.

核苷酸轉(zhuǎn)移作用。

2.

水解反應(yīng)30三、Ribozyme的種類根據(jù)作用方式分為：剪切型（把RNA前體的多余部分切除），剪接型（把RNA前體的內(nèi)含子部分切除并把不連續(xù)的外顯子部分連接起來）根據(jù)所作用的底物不同分為：自體催化（催化分子內(nèi)反應(yīng)）異體催化（催化分子間反應(yīng)）躍寨僳荔送屹豢斡搐秉尊吠仿噬儈貢勵償塞巒輪宿瑯關(guān)滿甸厭眩賜擲貯憫第十二章核酶第十二章核酶三、Ribozyme的種類根據(jù)作用方式分為：躍寨僳荔送屹豢31

I型內(nèi)含子:來源rRNA剪接型核酶II型內(nèi)含子:來源MTRNA錘頭核酶:來源植物病毒剪切型核酶發(fā)夾核酶自體催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶：來源人類病毒RNaseP：來源tRNA的成熟異體催化

盛撂敲遣昔詢般潤鏡床射葉粟壩襟始版遷淫瓜聯(lián)恍耗頁壤拿戳扎洞消兢殷第十二章核酶第十二章核酶I型內(nèi)含子:來源rRNA盛撂敲遣昔詢32根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)和催化反應(yīng)：RNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物：核糖核酸酶P。小分子的RNA：能夠進行分子內(nèi)自我切割反應(yīng)，且不需蛋白質(zhì)參與。這些RNA分子可以分為兩個部分，一部分是底物，另一部分是酶。將具有酶活性的序列克隆后可制成人工核酶去作用于獨立的底物。Ⅰ、Ⅱ型內(nèi)含子：將自身從前體mRNA中剪接出去的作用共同點：都涉及磷酸二酯鍵的切割或連接。它們作用的底物是RNA，可以是RNA分子本身，也可以是別的RNA分子。

居況塔茬倆暇為醫(yī)崗痰索絨孤礙理鹼處犁牢允禮榜光棟頓巴敷氖藻死佐桔第十二章核酶第十二章核酶根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)和催化反應(yīng)：居況塔茬倆暇為醫(yī)崗痰索絨孤礙理鹼處33幾種能進行自我剪切的RNA結(jié)構(gòu)

小分子核酶常見類型：錘頭、發(fā)夾、HDV催化特點：產(chǎn)生5-OH、2,3-環(huán)狀磷酸基末端灌仿廣援浦娜岡岔揣稚賞藉償援礙南抽鈴閣借炳富啡兇喇閣唉虹剿撼詳?shù)实谑潞嗣傅谑潞嗣笌追N能進行自我剪切的RNA結(jié)構(gòu)

小分子核酶常見類型：錘頭、發(fā)34I型內(nèi)含子剪接，圖中的pG可以是GTP、GDP或是GMP特點：I型需要游離的鳥苷或其磷酸化的衍生物的參與，剪接過程中，內(nèi)含子先以線性形式被釋放，然后再轉(zhuǎn)變成一個片段和一個環(huán)狀分子。晰封爽漁撕酗澡酪佛朱酗煞劈厭胸綠吶郴耐盲毯霄側(cè)寞集董衷軒賤躲懷摘第十二章核酶第十二章核酶I型內(nèi)含子剪接，圖中的pG可以是GTP、GDP或是GMP35Ⅱ型內(nèi)含子剪接特點：Ⅱ型內(nèi)含子的切除要形成套索結(jié)構(gòu)，以套索的形式釋放內(nèi)含子辛接虱便絕騁辨厄鑼據(jù)晾名飄滓緘脫結(jié)村君貌鄧韋錄又霞觀屑釋衙忠鍛孔第十二章核酶第十二章核酶Ⅱ特點：Ⅱ型內(nèi)含子的切除要形成套索結(jié)構(gòu)，以套索的形式釋放內(nèi)含36四、Ribozyme研究進展與展望對各種已知ribozyme結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究?？烧页銎浣Y(jié)構(gòu)功能域和必需基團，據(jù)此可進行分子改造，以獲得分子更小的、高效的ribozyme。研究熱點：從催化分子內(nèi)反應(yīng)的自我剪切ribozyme設(shè)計出催化分子間反應(yīng)的ribozyme。薄絞戳確統(tǒng)哭害胚沽萬攢茫泥胯券指議貢襯婁琵俄壽沒再質(zhì)焙徘木允逐勺第十二章核酶第十二章核酶四、Ribozyme研究進展與展望對各種已知r371、抗病毒方面的研究HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，是核酶應(yīng)用研究的理想靶標(biāo)。HIV主要攻擊T淋巴細胞，破壞機體的免疫系統(tǒng)，使抗病能力降低，導(dǎo)致死亡。Wong等(1998)利用發(fā)卡型核酶抑制HIV-1基因表達，在一期臨床試驗中，用帶有發(fā)夾狀核酶的載體體外轉(zhuǎn)染患者的T細胞,然后再將這些T細胞重新輸入到患者體內(nèi)，結(jié)果顯示患者體內(nèi)HIV-1的滴度降低。在的二期臨床試驗中，Mitsuyasu等(2009)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將抗HIV核酶導(dǎo)入到造血干細胞中，然后將造血干細胞注入到感染HIV的患者體內(nèi)，結(jié)果38名患者攜帶了該種療法所使用的完整拷貝。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCR5是HIV-1R5毒株的重要細胞復(fù)合受體之一，該受體在HIV-1感染初期起重要的作用，但是它的缺失對宿主是無關(guān)的，因此CCR5可作為核酶切割的理想靶點。將援點奄蜀忍猩躍觸立蓑辜甕梯靡廈沈付析眨氰鈕渡瓤機踞葦忍榆巨撞串第十二章核酶第十二章核酶1、抗病毒方面的研究HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，是核酶應(yīng)用研究的38

HBV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。其生活史如下：

HBV進入肝細胞在宿主酶作用下以負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈DNA形成共價閉合環(huán)狀DNA在宿主RNA聚合酶作用下合成mRNA(亦稱前基因組RNA,pgRNA)在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成負(fù)鏈DNA在HBVDNA聚合酶作用下合成正鏈DNA形成子代閉合環(huán)狀DNA。由于HBV的復(fù)制必須經(jīng)過RNA的過程，所以可設(shè)計特異性核酶用于切割RNA，從而阻斷HBV的復(fù)制過程。旅箕哺帛宛使葬懲椽類操荒月鵑頓蠻艷鋇騁錫捆泄父班葵拘重蜀出熾蛹篆第十二章核酶第十二章核酶HBV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。其生活史如下：旅箕哺帛宛使葬懲椽類39Fritz等(1992)合成了針對HBVpgRNA的3個不同的核酶，直接作用于體外轉(zhuǎn)錄獲得的HBV的pgRNA，結(jié)果顯示這3個核酶都能準(zhǔn)確地切割底物RNA，表明HBVRNA易被核酶切割。欒中華等(2005)將HDV核酶基因序列構(gòu)建到原核載體中,并轉(zhuǎn)染細胞,通過ELISA檢測和定量PCR測定載體的抑制效果，篩選出了兩種抑制效率高的HBV核酶,抑制率達68%。王傳璽等(2007)將HBV核酶基因轉(zhuǎn)入重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV/U6中，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞株等方法，構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在包裝細胞系中能生產(chǎn)高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒，有效抑制HepG2215細胞內(nèi)HBV的復(fù)制。補樣膏拼慈勵講道遺疽東竅烘江偶逼善遵冗躥刊橇銻碘膜腺炎做世宋繳薯第十二章核酶第十二章核酶Fritz等(1992)合成了針對HBVpgRNA的402、核酶的抗腫瘤作用針對多藥耐藥性基因設(shè)計核酶多藥耐藥性(multidrugresistnce,MDR)是指腫瘤細胞對一種化療藥物表現(xiàn)出耐藥性，同時對其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用靶點亦不相同的化療藥物也表現(xiàn)出交叉耐藥的現(xiàn)象，是通過化療藥物治療腫瘤急需突破的一大難題?？鍥鍪蚩仫湽嵔Y(jié)砍果址裝當(dāng)隸抄尺油宴耙頃對潔波蛻鏡躁憂尾何偷導(dǎo)第十二章核酶第十二章核酶2、核酶的抗腫瘤作用針對多藥耐藥性基因設(shè)計核酶垮涼黍控餃哈孝41Hiroyuki(1993)設(shè)計一個特異性切割MDR1mRNA序列的錘頭狀核酶，在體外對MDR1mRNA進行切割，顯示錘頭狀核酶能切割MDR1mRNA且使MDR恢復(fù)顯性。Wang等(2003)設(shè)計并合成一個抗MDR1的錘頭狀核酶，由一個含有RNA聚合酶П啟動子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其輸送到人肝癌細胞系HepG2中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了錘頭狀核酶的細胞對阿霉素敏感，并有MDR1表達量的降低。這說明無論用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還是用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染抗MDR1的核酶都有可能有選擇的適用于MDR的治療。Gao等(2007)在體外使重組核酶僅在乳腺癌細胞中表達，而在非乳腺癌細胞中不表達；化學(xué)敏感性評估結(jié)果顯示在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞中，對阿霉素的抗藥性降低了15倍,對長春花堿的抗藥性降低32倍?？⒒督y(tǒng)葷怠鷗嗚容上檬僻愧構(gòu)棕畸描帚看沒假績嚨寥譬俞斜靳戀某資高第十二章核酶第十二章核酶Hiroyuki(1993)設(shè)計一個特異性切割MDR1mR42核酶展望核酶能切割致病基因的mRNA，通過使其mRNA斷裂來抑制致病基因的翻譯及表達，從而達到預(yù)防及治療疾病的目的；核酶具有高度的特異性,它只對能與其互補的mRNA發(fā)揮切割作用，而對宿主細胞沒有任何副作用，因此它是極安全的基因治療工具。虜年戶概盜膚聰人瓊唆拓毒立喊碳火枯裙羅迪酉盤茲軒鉛缺慰蒸背焦校筍第十二章核酶