授課31菊花組織培養(yǎng)

第一頁，共四十九頁。第二頁，共四十九頁。植物的組織培養(yǎng)第三頁，共四十九頁。

菊花是菊科菊屬的多年生宿根草本植物,是我國的傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一。長期以來菊花采用分株、扦插等無性繁殖方法進(jìn)行繁殖。但是傳統(tǒng)的繁殖方法易受環(huán)境影響,繁殖周期長,隨著市場需求的急劇增加,已經(jīng)不能滿足市場日益發(fā)展的需要。

植物組織培養(yǎng)屬于無性生殖中營養(yǎng)生殖營養(yǎng)生殖包括：第四頁，共四十九頁。扦插第五頁，共四十九頁。嫁接第六頁，共四十九頁。壓條

第七頁，共四十九頁。一、基礎(chǔ)知識1、細(xì)胞分化（1）概念：在生物個體發(fā)育過程中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能上產(chǎn)生穩(wěn)定性差異的過程。（2）特點(diǎn)：持久性：發(fā)生在整個生活活動過程中，胚胎期分化程度達(dá)到最大。不可逆性：穩(wěn)定性：分化過程，遺傳物質(zhì)是不變的，穩(wěn)定的。（3）原因：（4）結(jié)果：基因選擇性表達(dá)的結(jié)果產(chǎn)生不同的組織和器官第八頁，共四十九頁。2、植物細(xì)胞的全能性（1）概念：（2）比較：（3）原因：（４）表達(dá)的條件：高度分化的植物細(xì)胞，仍具有發(fā)育成完整植株的潛能。體細(xì)胞中：分生區(qū)細(xì)胞＞成熟區(qū)細(xì)胞高度分化的動物體細(xì)胞全能性受到限制，但體細(xì)胞核仍具有全能性。受精卵＞生殖細(xì)胞＞體細(xì)胞體細(xì)胞都是通過有絲分裂由同一個受精卵增殖形成的，遺傳物質(zhì)（染色體）相同，攜帶有本物種的全部遺傳信息。離體、在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其它外界條件(適宜的溫度、PH值、光照等)才能表達(dá)。第九頁，共四十九頁。3、植物組織培養(yǎng)（1）概念：（2）過程：人工種子植株外植體愈傷組織胚狀體脫分化再分化加上人工種皮是指離體的植物器官、組織或細(xì)胞，在無菌條件下，通過脫分化和再分化形成完成植株的過程。第十頁，共四十九頁。（3）植物組織培養(yǎng)細(xì)胞離體①必要條件：一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件②原理:細(xì)胞的全能性A.外植體：從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分細(xì)胞、組織或器官.③相關(guān)概念:第十一頁，共四十九頁。B愈傷組織：離體的植物器官、組織或細(xì)胞通過脫分化形成的疏松而無規(guī)則的，高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的,未分化的薄壁細(xì)胞2-3周，愈傷組織開始形成。第十二頁，共四十九頁。菠蘿的愈傷組織第十三頁，共四十九頁。C脫分化（去分化）：已經(jīng)分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程。

(已經(jīng)分化的植物器官、組織或細(xì)胞，當(dāng)受到創(chuàng)傷或進(jìn)行離體（也受到創(chuàng)傷）培養(yǎng)時，已停止分裂的細(xì)胞，又重新恢復(fù)分裂，細(xì)胞改變原有的分化狀態(tài)，失去原有結(jié)構(gòu)和功能，成為具有未分化特性的細(xì)胞。)第十四頁，共四十九頁。D再分化：愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，重新分化成根和芽等器官的過程。

3-5周之后，誘導(dǎo)出的新葉片和芽。第十五頁，共四十九頁。E胚狀體：具有胚根和胚芽的結(jié)構(gòu)胚狀體包裹著人工胚乳和人工種皮可以制成人工種子。第十六頁，共四十九頁。第十七頁，共四十九頁。第十八頁，共四十九頁。二、影響植物組織培養(yǎng)的因素環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH外因內(nèi)因：植物種類，同一種植物材料的年齡、保存時間的長短

，營養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等第十九頁，共四十九頁。2、影響植物組織培養(yǎng)的因素（1）植物材料的選擇煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難同一植物材料的年齡、保存時間的長短會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝第二十頁，共四十九頁。（2）離體的植物組織和細(xì)胞對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對特殊，需配置不同的培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基主要成分包括：A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等C、有機(jī)物第二十一頁，共四十九頁。討論：你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？答：微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機(jī)營養(yǎng)，無機(jī)鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。

第二十二頁，共四十九頁。2、高等植物是光能自養(yǎng)型生物，為什么在植物組織培養(yǎng)過程中還需要提供有機(jī)物培養(yǎng)基？？此時的組織或細(xì)胞為離體的，細(xì)胞所生活的環(huán)境為液體有機(jī)物營養(yǎng)環(huán)境，而不能體現(xiàn)其整個植物體的光能自養(yǎng)。思考第二十三頁，共四十九頁。①常用的植物激素：生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素生長素類：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）細(xì)胞分裂素類：激動素（KT）、6－芐基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素類：赤霉酸（GA3）（3）植物激素的影響第二十四頁，共四十九頁。②生長素和細(xì)胞分裂素作用植物中生長素和細(xì)胞分裂素是啟動細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)的趨勢使用順序?qū)嶒?yàn)結(jié)果先使用生長素，后使用細(xì)胞分裂素有利于細(xì)胞分裂，但不利分化先使用細(xì)胞分裂素后使用生長素細(xì)胞既分裂也分化同時使用分化頻率高第二十五頁，共四十九頁。生長素細(xì)胞分裂素：>有利于根的分化生長素細(xì)胞分裂素：<有利于芽的分化，抑制根的分化生長素細(xì)胞分裂素：＝促進(jìn)愈傷組織生長③生長素和細(xì)胞分裂素同時使用，用量的比例對植物細(xì)胞發(fā)育方向的影響（4）pH、溫度、光照pH控制在5.8左右，溫度控制在18－22。C,每日用日光燈照射12h.第二十六頁，共四十九頁。生長素/細(xì)胞分裂素第二十七頁，共四十九頁。3、植物組織培養(yǎng)過程:離體組織或細(xì)胞植物體脫分化細(xì)胞分裂素≈生長素愈傷組織芽根細(xì)胞分裂素>生長素細(xì)胞分裂素<生長素再分化植物細(xì)胞培養(yǎng)不需要光?需要光第二十八頁，共四十九頁。同常規(guī)的無性繁殖方法相比，組織培養(yǎng)快速繁殖法主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）快速。采用常規(guī)的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生產(chǎn)幾株或幾十株，但用組織培養(yǎng)的方法則每年可以繁殖出幾萬甚至數(shù)百萬的小植株。（2）周年生產(chǎn)?；ɑ芙M織培養(yǎng)快速繁殖是在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，因條件可控，所以不受季節(jié)限制，可以全年進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。而常規(guī)的無性繁殖則受季節(jié)限制，只能在花卉生長季節(jié)進(jìn)行繁殖。（3）經(jīng)濟(jì)效益高。花卉組織培養(yǎng)快速繁殖所需要的空間小，在一個200平方米的培養(yǎng)室內(nèi)一年可生產(chǎn)試管苗上百萬株。如按每株1元計算，每年產(chǎn)值上百萬元。（4）以組織培養(yǎng)繁殖的種苗與母株有著相同的遺傳基因。所以使用這項(xiàng)技術(shù)可讓優(yōu)良的品種不斷地延續(xù)。組織培養(yǎng)與常規(guī)繁殖相比優(yōu)點(diǎn)眾多第二十九頁，共四十九頁。二、實(shí)驗(yàn)操作（一）制備MS固體培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實(shí)驗(yàn)室一般使用4。C保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備.1、配置各種母液第三十頁，共四十九頁。①無機(jī)物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存.②激素類、維生素類以及用量較小的有機(jī)物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨(dú)配制成母液.③用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量.第三十一頁，共四十九頁。2、配置培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml.①配制培養(yǎng)液②調(diào)PH③培養(yǎng)基的分裝由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素.第三十二頁，共四十九頁。3、滅菌分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌.1、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝.（二）外植體消毒2、消毒①流水沖洗菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右.第三十三頁，共四十九頁。②酒精處理用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精中搖動2－3次，持續(xù)6－7s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗.③消毒液處理取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液.第三十四頁，共四十九頁。（三）接種污染的主要來源是空氣中的細(xì)菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70％的酒精噴霧使空氣消毒，酒精或新潔爾滅搽洗工作臺并用紫外線照射20分鐘1、接種室消毒2、無菌操作要求操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。3、材料的切取和接種第三十五頁，共四十九頁。第三十六頁，共四十九頁。4、接種注意事項(xiàng)①每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種.②外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜3－4塊，菊的莖或葉6－8塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件.③插入時應(yīng)注意方向，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分.第三十七頁，共四十九頁。1、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）2、外植體的消毒（酒精、氯化汞）3、接種的無菌操作（酒精、酒精燈——灼燒）4、無菌箱中的培養(yǎng)；5、移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時間。在整個操作過程中，是如何來實(shí)現(xiàn)無菌環(huán)境的？第三十八頁，共四十九頁。思考：你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)嗎？答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。第三十九頁，共四十九頁。（四）培養(yǎng)1、愈傷組織的培養(yǎng)從接種外植體到出現(xiàn)愈傷組織需經(jīng)過2周時間。2周之內(nèi)可以看到外植體上逐漸長出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。首次培養(yǎng)愈傷組織時，恒溫箱的門應(yīng)該關(guān)閉不必見光，因?yàn)樵跓o光條件下愈傷組織長的更快。2周后，培養(yǎng)基成分接近耗盡，必須更換培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng).第四十頁，共四十九頁。繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)愈傷組織的相同，在嚴(yán)格的無菌條件下，將愈傷組織連同原來的外植體一起移到新培養(yǎng)基上。愈傷組織的繼代培養(yǎng)一代為20d。如果延長時間，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)減少，外植體會分泌有毒物質(zhì)，造成自身中毒。如果愈傷組織長到直徑為1－1.5cm時，就可以進(jìn)行試管苗培養(yǎng)，否則還需進(jìn)行第二代繼代培養(yǎng).2、愈傷組織的繼代培養(yǎng)在愈傷組織繼代培養(yǎng)期間，將恒溫箱的門打開，讓愈傷組織見光，愈傷組織見光后顏色可以轉(zhuǎn)為綠色.第四十一頁，共四十九頁。3、試管苗的培養(yǎng)當(dāng)愈傷組織長到一定大小后，可以更換培養(yǎng)基，進(jìn)行試管苗的見光培養(yǎng).（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日.1、打開封口膜2、清洗轉(zhuǎn)移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間.第四十二頁，共四十九頁。（六）栽培3、移栽珍珠巖：固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強(qiáng)、透性好，適合栽培.幼苗長壯后，移栽到土壤中.幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗