生物化學：第六章+生物氧化

第六章生物氧化—電子傳遞與氧化磷酸化生物氧化概述電子傳遞鏈（呼吸鏈）氧化磷酸化其他末端氧化酶系統(tǒng)(自學)第一節(jié)生物氧化概述一、生物氧化的概念二、生物氧化的特點三、氧化還原電位與自由能四、高能化合物

一切生命活動都需要能量，維持生命活動的能量主要有兩個來源：

光能（太陽能）：光合自養(yǎng)生物通過光合作用將光能轉(zhuǎn)變成有機物中穩(wěn)定的化學能。

化學能：異養(yǎng)生物或非光合組織通過生物氧化作用將有機物質(zhì)（主要是各種光合作用產(chǎn)物）氧化分解，使存儲的穩(wěn)定的化學能轉(zhuǎn)變成ATP中活躍的化學能，ATP直接用于需要能量的各種生命活動。一、生物氧化的概念1、概念有機物質(zhì)（糖、脂肪和蛋白質(zhì)）在細胞內(nèi)進行氧化分解產(chǎn)生CO2和H2O并釋放出能量的過程稱為生物氧化(biologicaloxidation)。生物氧化通常需要消耗氧，所以又稱為呼吸作用。原核生物中,生物氧化發(fā)生在細胞質(zhì)膜上,而真核生物中生物氧化主要發(fā)生在線粒體內(nèi)膜上。

2、生物氧化主要包括三方面的內(nèi)容：（1）細胞如何在酶的催化下將有機化合物中的C變成CO2—CO2如何形成？脫羧反應(yīng)（主要指氧化脫羧）

CH3COSCoA+CO2CH3-C-COOHO丙酮酸脫氫酶復合體NAD+NADH+H+CoASH（2）H2O的生成

代謝物在脫氫酶催化下脫下的氫由相應(yīng)的氫載體（NAD+或FAD等）所接受，再通過一系列遞氫體或遞電子體傳遞給氧而生成H2O

。NAD+

NADH+H+蘋果酸脫氫酶例：1\2O2NAD+電子傳遞鏈

H2O2e-O=2H+草酰乙酸（3）當有機物被氧化成CO2和H2O時，釋放的能量怎樣轉(zhuǎn)化成ATP—能量如何產(chǎn)生？氧化磷酸化底物水平磷酸化

生物氧化的過程

多糖脂肪蛋白質(zhì)葡萄糖甘油＋脂肪酸氨基酸乙酰CoAO2H2O能量

生物氧化的三個階段大分子降解成基本結(jié)構(gòu)單位

小分子化合物分解成共同的中間產(chǎn)物（如丙酮酸、乙酰CoA等）

共同中間物進入三羧酸循環(huán),氧化脫下的氫由電子傳遞鏈傳遞生成H2O，釋放出大量能量，其中一部分通過磷酸化儲存在ATP中。HCO2TAC

釋放的能量轉(zhuǎn)化成ATP被利用轉(zhuǎn)換為光和熱，散失二、生物氧化的特點生物氧化和有機物在體外氧化（燃燒）的實質(zhì)相同，都是脫氫、失電子或與氧結(jié)合，消耗氧氣，都生成CO2和H2O，所釋放的能量也相同。但二者進行的方式和歷程卻不同：生物氧化

體外燃燒細胞內(nèi)溫和條件高溫或高壓、干燥條件（常溫、常壓、中性pH、水溶液）一系列酶促反應(yīng)無機催化劑逐步氧化放能，能量利用率高能量爆發(fā)釋放

三、生化反應(yīng)的自由能變化自由能（G）:指在一個體系的總能量中，在恒溫恒壓條件下能夠做功的那一部分能量（1978年Gibbs提出的，亦稱為Gibbs自由能）。自由能變化（ΔG）:AB

ΔG=GB-

GAΔG是衡量反應(yīng)自發(fā)性的標準。

ΔG<0，放能，自發(fā)進行

ΔG=0，平衡狀態(tài)

ΔG>0，吸能，非自發(fā)進行ΔG隨溫度和物質(zhì)濃度而變化1、生化標準自由能變化(ΔG0)

指在標準條件下，即溫度為25℃，參加反應(yīng)的物質(zhì)濃度為1mol/L,若有氣體，則為1個大氣壓，pH為7時，測定的自由能變化。單位為J/mol和KJ/mol過去曾用cal/mol;kcal/mol1kcal/mol=4.18KJ/mol

生化標準條件下某一可逆反應(yīng)的平衡常數(shù)用k

表示。

ΔG0’=-RTlnk=-2.303RTlgk

標況下，T=298K,R=1.987cal/mol.k=8.314J/mol.k

2、自由能變化與平衡常數(shù)的關(guān)系ΔG=ΔG0’+2.303RTlgk酶促反應(yīng)都是熱力學上可以自發(fā)進行的反應(yīng).在一系列反應(yīng)中,有的熱力學不利的反應(yīng)能夠被熱力學上有利的反應(yīng)驅(qū)動.!!生化標準氧化還原電位（E0′）：生化標準條件下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)的每一氧還對的電子轉(zhuǎn)移勢能。在氧化還原反應(yīng)中，電子總是從E0值較小的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到E0值較大的物質(zhì)，即從還原劑流向氧化劑。

3、自由能變化與氧化還原電位差的關(guān)系氧還對：氧化還原反應(yīng)中，參與反應(yīng)的每一種物質(zhì)都有氧化態(tài)和還原態(tài)，稱為氧還對。標準氫電極的氧化還原電位為零.

ΔE0’=E0′氧化劑-E0′還原劑

=E0′電子受體-E0'電子供體

ΔG0′=-nFΔE0′

其中n為轉(zhuǎn)移的電子數(shù)，

F為法拉第常數(shù)，F(xiàn)=96.496kJ/v.mol=23.063kcal/v.mol

生化標準氧化還原電位差（ΔE0

）：ΔE0

’的單位為伏特（V）

糖、脂肪、蛋白質(zhì)CO2+H2O+能量

生物氧化四、高能化合物（high-energycompound）ATP1、高能化合物的概念一般將水解時能夠釋放21kJ/mol（5Kcal/mol)以上自由能的化合物稱為高能化合物。在高能化合物分子中，釋放出大量自由能時水解斷裂的活潑共價鍵稱為高能鍵*。高能磷酸化合物：水解每摩爾磷酸基能釋放5千卡/mol或以上能量的磷酸化合物

生物化學上的高能鍵不同于化學上的高能鍵，這里指水解放出較多的自由能來定義的，不穩(wěn)定。而化學上指需要提供大量能量才能夠打斷的鍵，很穩(wěn)定。

按其分子結(jié)構(gòu)特點及所含高能鍵的特征分：磷氧鍵型磷氮鍵型硫酯鍵型甲硫鍵型

2、高能化合物的類型

（1）磷氧鍵型（—O-P)(A)?；姿峄衔?,3-二磷酸甘油酸乙酰磷酸(A)?；姿峄衔锇奔柞Ａ姿狨；佘账岚滨；佘账幔˙）焦磷酸化合物ATP（三磷酸腺苷）焦磷酸ADP（二磷酸腺苷）（C）烯醇式磷酸化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）磷氧鍵型：酰基磷酸化合物、焦磷酸化合物、烯醇式磷酸化合物（2）氮磷鍵型（如胍基磷酸化合物）磷酸肌酸磷酸精氨酸磷酸肌酸是易興奮組織（如肌肉、腦、神經(jīng)）唯一的能起暫時儲能作用的物質(zhì)。磷酸精氨酸是無脊椎動物肌肉中的儲能物質(zhì)

（3）硫酯鍵型3-磷酸腺苷-5

-磷酰硫酸?；o酶ACOS

COACH2COOHCH2（4）甲硫鍵型S-腺苷甲硫氨酸3、最重要的高能化合物—ATP（1）ATP的分子結(jié)構(gòu)特點與水解自由能的關(guān)系ΔG°′=-30.5千焦/摩爾

b、ATP水解產(chǎn)物具有更大的共振穩(wěn)定性。

c、H+的低濃度導致ATP4-向分解方向進行（10-7mol/L）。

d、ADP的離子化作用，產(chǎn)物的水合程度較大,利于水解進行。

ATP水解時釋放大量的自由能，原因主要有四方面：a、ATP分子結(jié)構(gòu)存在不穩(wěn)定因素：①ATP分子內(nèi)有4個負電荷（ATP4-），產(chǎn)生靜電斥力，促使ATP水解成ADP3-，而減弱斥力。②ATP分子內(nèi)存在相反共振現(xiàn)象.由于在相鄰的兩個磷原子之間夾著一個氧原子，氧原子上存在有未共用電子對，而磷原子因P=O和P-O-間的誘電子效應(yīng)帶有部分正電荷，于是在兩個相鄰的磷原子之間存在競爭氧原子上的未共用電子的現(xiàn)象，這種作用的結(jié)果會影響ATP分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。ATP分子內(nèi)共振雜化數(shù)少,不穩(wěn)定;ADP生產(chǎn)后立即離子化,逆反應(yīng)不利.另外,產(chǎn)物的水合作用使逆反應(yīng)也不利進行.以無機磷酸為例說明幾種能量近似的共振形式：總的來說：反應(yīng)物的不穩(wěn)定性和產(chǎn)物的穩(wěn)定性或反應(yīng)物內(nèi)的靜電斥力和產(chǎn)物的共振穩(wěn)定使ATP水解釋放大量能量。A、ATP是生物體通用的能量貨幣（是產(chǎn)能反應(yīng)和需能反應(yīng)的重要能量介質(zhì)）。B、ATP是磷酸基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)的中間載體。ATP在傳遞能量方面起著轉(zhuǎn)運站的作用，它是能量的攜帶者和轉(zhuǎn)運者，但不是能量的貯存者。

（2）ATP在能量轉(zhuǎn)化中的作用ATP是通用的能量貨幣ATP將分解代謝的產(chǎn)能反應(yīng)和合成代謝的需能反應(yīng)偶聯(lián)在一起，被生物界普遍用作“能量貨幣”。有機物氧化分解產(chǎn)生的能量并不直接用于活細胞的生理活動，而是將ADP磷酸化生成ATP.當ATP＋H2O→ADP+Pi時，釋放出的自由能，為生命活動提供能量；即構(gòu)成了ATP/ADP循環(huán)。

磷酸基團往往從磷酸基團轉(zhuǎn)移勢能高的物質(zhì)向勢能低的物質(zhì)轉(zhuǎn)移。磷酸基團轉(zhuǎn)移勢能在數(shù)值上等于其水解反應(yīng)的ΔG0’。.磷酸基團轉(zhuǎn)移勢能（kcal/mol)246810121416ATPPEP1，3-二P甘油酸6-P葡萄糖3-P甘油ATP是磷酸基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)的中間載體ATP的ΔG0’處于磷酸化合物的中間

化合物磷酸基團轉(zhuǎn)移勢能G

（千卡/摩爾）磷酸烯醇式丙酮酸14.81，3-二磷酸甘油酸11.8氨甲酰磷酸12.3磷酸肌酸10.3乙酰磷酸10.1磷酸精氨酸7.7ATP（ATP→ADP+Pi）7.3ADP（ADP→AMP+Pi）7.3AMP（AMP→腺苷+Pi）3.41-磷酸葡萄糖5.06-磷酸葡萄糖3.36-磷酸果糖3.81-磷酸甘油酸2.2

某些磷酸化合物磷酸基團的轉(zhuǎn)移勢能

（3）ATP的其他功能：ATP可以轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌塑杖姿崛纾篊TP（參與磷脂合成）；UTP（多糖的合成）；GTP（蛋白質(zhì)的合成）ATP是某些酶和代謝途徑的調(diào)節(jié)因子ATP斷裂形成AMP和焦磷酸的特殊作用ATP斷裂形成AMP和焦磷酸的作用ATP+H2OAMP+PPiPPi+H2O2PiΔG0’=-7.7(Kcal/mol)=-32.19(KJ/mol)ΔG0’=-6.9(Kcal/mol)=-28.842(KJ/mol)-61.028KJ/mol意義：螢火蟲發(fā)光物質(zhì)的形成由ATP降解為AMP+PPi來提供腺苷酸；為一些接近平衡的反應(yīng)提供驅(qū)動力：

ATP+RCOOH+CoA-SHAMP+PPi+RCO-S-CoA

ΔG0’=0.2(Kcal/mol)=0.836(KJ/mol)（4）能荷(energycharge)ATP是生命活動中能量的主要直接供體，因此ATP不斷產(chǎn)生又不斷消耗，ATP、ADP和AMP的轉(zhuǎn)換率非常高。但他們在機體內(nèi)總能保持相應(yīng)的平衡狀態(tài)，以適應(yīng)細胞對能量的需求。

例如：一個靜臥的人24小時內(nèi)消耗約40公斤ATP。細胞所處的能量狀態(tài)用ATP、ADP和AMP之間的關(guān)系式來表示，稱為能荷，公式如下：能荷=[ATP]+1/2[ADP][ATP]+[ADP]+[AMP]腺苷酸庫能荷是細胞所處能量狀態(tài)的一個指標，當細胞內(nèi)的ATP全部轉(zhuǎn)變?yōu)锳MP時能荷值為0，當AMP全部轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP時，能荷值為1。高能荷抑制ATP的生成，促進ATP的應(yīng)用，即促進機體內(nèi)的合成代謝。大多數(shù)細胞的能荷處于0.8-0.95之間。進一步說明細胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生和利用都處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。（同位素實驗）[ATP]+1/2[ADP][ATP]+[ADP]+[AMP]能荷=第一節(jié)概述

一、生物氧化的概念和特點二、生物化學反應(yīng)中的自由能的變化三、高能化合物

按其分子結(jié)構(gòu)特點及所含高能鍵的特征分高能化合物的類型高能磷酸化合物高能非磷酸化合物磷氧型磷氮型硫酯鍵化合物甲硫鍵化合物烯醇式磷酸化合物酰基磷酸化合物焦磷酸化合物胍基磷酸化合物A、ATP是生物體通用的能量貨幣。B、ATP是磷酸基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)的中間載體。ATP在傳遞能量方面起著轉(zhuǎn)運站的作用，它是能量的攜帶者和轉(zhuǎn)運者，但不是能量的貯存者。ATP的其他功能：ATP可以轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌塑杖姿崛纾篊TP（參與磷脂合成）；UTP（多糖的合成）；GTP（蛋白質(zhì)的合成）ATP是某些酶和代謝途徑的調(diào)節(jié)因子ATP斷裂形成AMP和焦磷酸的特殊作用

ATP在能量轉(zhuǎn)化中的作用第二節(jié)電子傳遞鏈

一、概念二、電子傳遞鏈的組成三、電子傳遞鏈的電子傳遞順序四、呼吸鏈的電子傳遞抑制劑細胞怎樣利用分子氧將有機化合物中的H氧化成H2O第二節(jié)電子傳遞鏈

一、概念需氧細胞內(nèi)糖、脂肪、氨基酸等通過各自的分解途徑所形成的還原性輔酶，包括NADH和FADH2(大部分來自線粒體基質(zhì)中的TCA循環(huán)和脂肪酸氧化途徑)通過電子傳遞途徑被重新氧化。即還原型輔酶上的氫原子以質(zhì)子的形式脫下，其電子沿一系列按一定順序排列的電子傳遞體轉(zhuǎn)移，最后轉(zhuǎn)移給分子氧并生成水，這個電子傳遞體系稱為電子傳遞鏈。由于消耗氧，故也叫呼吸鏈。電子傳遞鏈在原核生物存在于質(zhì)膜上，在真核細胞存在于線粒體內(nèi)膜上。在生物氧化過程中，代謝物脫下的氫經(jīng)過一系列按一定順序排列的氫傳遞體和電子傳遞體的傳遞，最后交給分子氧并生成水，這個氫和電子的傳遞體系稱為電子傳遞鏈（eclctrontransferchain—ETC)線粒體內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴（cristae），擴大了內(nèi)膜的面積。內(nèi)膜表面含有執(zhí)行氧化反應(yīng)的電子傳遞鏈ATP合酶線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白線粒體的結(jié)構(gòu)外膜、膜間隙、內(nèi)膜和基質(zhì)內(nèi)膜的低通透性保證了ATP的合成動力工廠二、呼吸鏈的組成呼吸鏈由一系列的氫傳遞體和電子傳遞體組成。包括：

NADH-Q還原酶、琥珀酸-Q還原酶、細胞色素還原酶、細胞色素氧化酶。NADHNADH-Q還原酶Q細胞色素還原酶細胞色素C細胞色素氧化酶O2琥珀酸-Q還原酶FADH2呼吸鏈由一系列的氫傳遞體和電子傳遞體組成。包括：NADH-Q還原酶（復合體Ⅰ）琥珀酸-Q還原酶（復合體II）細胞色素還原酶（復合體III）細胞色素氧化酶（復合體IV）

1、

NADH-Q還原酶(NADH脫氫酶、復合體Ⅰ、亦是第一個質(zhì)子泵)NADH-Q還原酶是一個大的蛋白質(zhì)復合體，F(xiàn)MN和鐵-硫聚簇（Fe-S）(非血紅素鐵蛋白)是該酶的輔基，輔酶Q是該酶的輔酶，由輔基或輔酶負責傳遞電子和氫。以FMN或FAD為輔基的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱黃素蛋白。FMN通過氧化還原變化可接收NADH+H+的氫以及電子。

FMNFMNH2

鐵硫聚簇主要以（Fe-S）(2Fe-2S)或(4Fe-4S)形式存在，鐵硫聚簇與蛋白質(zhì)結(jié)合稱為鐵硫蛋白。鐵硫聚簇（Fe-S中心）2Fe-2S\4Fe-4S是NADH-Q還原酶中的兩種存在形式CysSSSCys

Fe3+

Fe3+

CysSSSCys

CysSSSCys

Fe3+

Fe2+

CysSSSCys

+e--e-鐵硫聚簇通過Fe3+

Fe2+

變化，起傳遞電子的作用，每次傳遞一個電子.NADH-Q還原酶先與NADH結(jié)合并將NADH上的兩個氫轉(zhuǎn)移到FMN輔基上，

NADH+H++FMNFMNH2+NAD+鐵硫絡(luò)合物CoQe-e-MMH2NAD+NADHFMNFMNH22Fe3+2Fe2+2(Fe-S)CoQH2CoQ2Fe3+2Fe2+2(Fe-S)CoQH2CoQ2H+基質(zhì)2H+NADH-Q還原酶各輔基（輔酶）的氧化還原循環(huán)NADH-Q還原酶泵到線粒體內(nèi)膜外側(cè)基質(zhì)H+Fe-S中心是單電子載體,而NADH\黃素蛋白\Q10都是兩個電子載體是脂溶性醌類化合物，而且分子較小，可在線粒體內(nèi)膜的磷脂雙分子層的疏水區(qū)自由擴散。功能基團是苯醌,通過醌/酚的互變傳遞氫，Q(醌型結(jié)構(gòu))很容易接受2個電子和2個質(zhì)子，還原成QH2（還原型）；QH2也容易給出2個電子和2個質(zhì)子，重新氧化成Q。因此，它在線粒體呼吸鏈中作為電子和質(zhì)子的傳遞體。是電子傳遞鏈中唯一的非蛋白組分。(哺乳動物含十個異戊二烯,Q10)

2、輔酶Q（泛醌、亦簡稱Q。是許多酶的輔酶)、如：NADH-Q還原酶、琥珀酸-Q還原酶、脂酰-CoA脫氫酶等非哺乳動物只有6-8個異戊二烯單位.Q10有時書寫時省去10.3、琥珀酸-Q還原酶（復合體Ⅱ

）琥珀酸脫氫酶也是此復合體的一部分，琥珀酸-Q還原酶輔基包括FAD和Fe-S聚簇（細胞色素b??）。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸氧化為延胡索酸，同時其輔基FAD還原為FADH2，然后FADH2又將電子傳遞給Fe-S聚簇。最后電子由Fe-S聚簇(2Fe-2S\3Fe-3S\4Fe-4S)傳遞給琥珀酸-Q還原酶的輔酶CoQ。復合體Ⅱ不能使質(zhì)子跨膜.新書中提到有細胞色素b存在？？？？4、細胞色素還原酶（細胞色素bc1復合體、復合體Ⅲ）

有質(zhì)子泵功能含有兩種細胞色素（細胞色素b、細胞色素C1）和一鐵硫蛋白（2Fe-2S）。細胞色素bc1復合體的作用是將電子從QH2轉(zhuǎn)移到細胞色素c：QH2cyt.bFe-Scyt.c1cyt.c復合體Ⅲ

是以鐵卟啉（血紅素）為輔基的蛋白質(zhì)（有顏色），高等動物線粒體呼吸鏈中主要含有5種細胞色素a、a3、b、c、c1等，細胞色素b,c1,c的輔基都是鐵-原卟啉Ⅳ，細胞色素a、a3的輔基為血紅素A。細胞色素主要是通過輔基中Fe3+

Fe2+

的互變起傳遞電子的作用。一個細胞色素每次傳遞一個電子。細胞色素（cytochrome,cyt）與蛋白質(zhì)以硫醚鍵相連5、細胞色素c在復合體III和Ⅳ之間傳遞電子。（細胞色素c交互地與細胞色素還原酶的C1和細胞色素氧化酶接觸）是唯一能溶于水的細胞色素，存在線粒體內(nèi)膜外表面。類似于Q作為電子載體在不同復合物之間游動。細胞色素c是目前了解最清楚的蛋白質(zhì)，其ＡＡ序列差異常作為生物系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的一個判斷指標

由cyt.a和a3組成。復合物中除了含有鐵卟啉外，還含有2個銅原子（CuA，CuB）。Cyta與CuA相配合，cyta3與CuB相配合，當電子傳遞時，細胞色素的Fe3+Fe2+間循環(huán)，同時Cu2+Cu+間循環(huán)，將電子從cytc直接傳遞給O2。也叫末端氧化酶。6、細胞色素氧化酶（復合體Ⅳ、細胞色素c氧化酶）

有質(zhì)子泵功能細胞色素氧化酶（10個亞基的多聚蛋白）O2+4H++4e-2H2O目前還不清楚4個電子如何聚集在一起去還原分子態(tài)氧第二節(jié)電子傳遞鏈

一、概念二、電子傳遞鏈的組成三、電子傳遞鏈的電子傳遞順序四、呼吸鏈的電子傳遞抑制劑細胞怎樣利用分子氧將有機化合物中的H氧化成H2OMMH2NAD+NADH2FMNFMNH22Fe3+2Fe2+2(Fe-S)CoQH2CoQ2Fe3+2Fe2+2cytb2Fe3+2Fe2+2cytb2Fe3+2Fe2+2(Fe-S)CoQH2CoQ2Fe3+2Fe2+2cytb2Fe3+2Fe2+2Fe3+2Fe2+2Cytc12Fe2+2Fe3+2Fe3+2Fe2+2cytaa32(Fe-S)2cytcH2O1/2O22H+2H+2H+2H+NADH呼吸鏈每個傳遞體的氧化還原循環(huán)每個分子氧被還原共需4個電子細胞色素bc1復合體（Ⅲ

）復合體ⅣNADH-Q還原酶三、呼吸鏈的電子傳遞順序

呼吸鏈的各組分在線粒體內(nèi)膜上是按一定順序排列的，在線粒體內(nèi)膜上主要有兩條呼吸鏈：NADH+H+FMNFe-SCoQcytbFe-Scytc1cytccytaa3O2

Fe-S

FAD

琥珀酸-Q還原酶細胞色素還原酶細胞色素氧化酶

FMNFeSCytbFe-Scytc1cytaa3Fe-SFADH2ⅠⅡⅢⅣNADH-Q還原酶關(guān)于電子傳遞順序的實驗驗證呼吸鏈電子傳遞順序的確定經(jīng)歷了半個多世紀的探索，最關(guān)鍵的實驗概括如下：

測得每個電子傳遞體的氧化還原電位E0。

呼吸鏈中傳遞體的氧化還原電位排列或?qū)﹄娮拥挠H和力

用已經(jīng)分離出來的電子傳遞體進行體外重組氧化還原反應(yīng)只能在相鄰的的傳遞體間發(fā)生用分光光度法測得各個傳遞體發(fā)生吸收光譜的變化

完整的線粒體當電子傳遞體處于氧化狀態(tài)時，懸浮液渾濁，光吸收不能直接測出；但當之處于還原態(tài)時，即可以氧化態(tài)為對照測出。游離的線粒體在有氧下進行電子傳遞時，NADH一端還原性最強，而靠近氧一端電子傳遞體幾乎處于氧化態(tài)，由此判斷電子的流向。當向完全處于還原狀態(tài)的電子傳遞體中加入氧時，最先被氧化的是細胞色素aa3,其次是cytC-cytC1-cytb-…..NADH。DADH（340nm）；NAD+（260nm）

從線粒體中分離出傳遞體的復合物。四、呼吸鏈的電子傳遞抑制劑

1、概念：能夠阻斷呼吸鏈中某部位電子傳遞的物質(zhì)稱為電子傳遞抑制劑。

電子傳遞抑制劑的使用是研究呼吸鏈中電子傳遞體順序的有效方法。（阻斷部位物質(zhì)的氧化-還原狀態(tài)可以測出）2、常用的幾種電子傳遞抑制劑及其作用部位（1）魚藤酮、安密妥、殺粉蝶菌素。其作用是阻斷電子在NADH-Q還原酶內(nèi)的傳遞，所以阻斷了電子由NADH向CoQ的傳遞。（2）抗霉素A：干擾電子在細胞色素還原酶中細胞色素b上的傳遞，所以阻斷電子由QH2向cytC1的傳遞。（3）氰化物（CN-）、硫化氫（H2S）、疊氮化物（N3-）、一氧化碳（CO）等：其作用是阻斷電子在細胞色素氧化酶中傳遞，即阻斷了電子由cytaa3向分子氧的傳遞。

抗霉素A是從灰色鏈球菌中分離出來的抗生素.

呼吸鏈的電子傳遞抑制劑圖示

NADH

NADH-Q還原酶

魚藤酮、安密妥、殺粉蝶菌素

CoQ

cytb

抗霉素A

cytc1cytc

cytaa3

氰化物、一氧化碳、硫化氫、疊氮化合物

O2FADH2琥珀酸-Q還原酶第三節(jié)氧化磷酸化一、概念二、氧化磷酸化偶聯(lián)部位及P/O比三、氧化磷酸化機理四、氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑五、線粒體穿梭系統(tǒng)六、氧化磷酸化的調(diào)控

有機物被氧化成CO2和H2O時，釋放的能量怎樣轉(zhuǎn)化成ATP?一、概念生物體內(nèi)高能磷酸化合物ATP的生成主要由三種方式：

氧化磷酸化底物水平磷酸化光合磷酸化

底物水平磷酸化指ATP的形成直接與一個代謝中間物（PEP）上的磷酸基團轉(zhuǎn)移相偶聯(lián)的作用。

1、底物水平磷酸化特點：ATP的形成直接與中間代謝物進行的反應(yīng)相偶聯(lián)；在有

O2或無O2條件下均可發(fā)生底物水平的磷酸化。是與電子傳遞過程偶聯(lián)的磷酸化過程。即伴隨電子從底物到O2的傳遞，ADP被磷酸化生成ATP的酶促過程，這種氧化與磷酸化相偶聯(lián)的作用稱為氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)。這是需氧生物合成ATP的主要途徑。真核生物的電子傳遞和氧化磷酸化均在線粒體內(nèi)膜上進行。原核生物則在質(zhì)膜上進行。2、氧化磷酸化1、P/O比：

1940年，SOchoa測定了在呼吸鏈中O2的消耗與ATP生成的關(guān)系，為此提出P/O比的概念。（同位素實驗）當一對電子經(jīng)呼吸鏈傳給O2的過程中所產(chǎn)生的ATP分子數(shù)。實質(zhì)是伴隨ADP磷酸化所消耗的無機磷酸的分子數(shù)與消耗分子氧的氧原子數(shù)之比,稱為P/O比。線粒體NADH+H+經(jīng)呼吸鏈氧化P/O比為2.5（3），F(xiàn)ADH2經(jīng)呼吸鏈氧化P/O比為1.5（2）。二、氧化磷酸化偶聯(lián)部位及P/O比

2、形成ATP的部位（氧化與磷酸化偶聯(lián)部位）電子傳遞鏈將NADH和FADH2上的電子傳遞給氧的過程中釋放自由能，供給ATP的合成。其中釋放大量自由能的部位有3處，即復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ，這3個部位就是ATP合成的部位，稱為偶聯(lián)部位。

關(guān)于論證ATP形成部位的實驗證據(jù)：（1）ΔG0’=-nFΔE0’（2）

琥珀酸氧化P/O=1.5，蘋果酸氧化P/O=2.5

表明在NADH——CoQ有一次磷酸化作用

（3）A.Lehninger用抗壞血酸使電子從細胞色素C進入呼吸鏈，測得P/O=1，說明由cytaa3——O2有一次磷酸化（4）使用專一性電子傳遞鏈抑制劑亦可測出ATP的形成部位即復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ

，這3個部位就是

ATP合成的部位（這三個部位均具有質(zhì)子泵功能）能量計算：NADH+H+被分子氧氧化生成水，總反應(yīng)為：NADH+H++1/2O2NAD++H2O求此反應(yīng)的ΔG0’

：因為：1/2O2+2H++2e-H2OE0’=0.82vNAD++2H++2e-NADH+H+

E0’=-0.32v所以：ΔE0’=0.82-(-0.32)=1.14V

ΔG0’=-2X23.063X1.14=-52.6(Kcal/mol)=-220(KJ/mol)3ADP+Pi3ATP+3H2OΔG0’=3X7.3=21.9(Kcal/mol)=91.6(KJ/mol)3個ATP的形成共截獲的能量為41%1、有關(guān)氧化磷酸化機理的幾種假說化學偶聯(lián)假說構(gòu)象偶聯(lián)假說

化學滲透假說（公認）三、氧化磷酸化作用的機理

電子傳遞過程中將產(chǎn)生一種活潑的高能共價中間物，通過此中間物進一步氧化產(chǎn)生能量來驅(qū)動ATP的合成。(1)、化學偶聯(lián)假說（1953）

－chemicalcouplinghypothesis

EdwardSlater

（2）構(gòu)象偶聯(lián)假說（1964）

conformationalcouplinghypothesis

認為電子沿電子傳遞鏈傳遞使線粒體內(nèi)膜的蛋白質(zhì)組分發(fā)生了構(gòu)象變化，形成一種高能構(gòu)象，這種高能形式通過ATP的合成而恢復其原來的構(gòu)象。迄今未能分離出這種高能蛋白質(zhì)。但在電子傳遞過程中蛋白質(zhì)組分的構(gòu)象變化還是存在的。

PaulBoyer

（3）化學滲透假說（1961）

chemiosmotichypothesis

1961年由英國生物化學家PeterMitchell最先提出。認為電子傳遞釋放的自由能和ATP的合成是與一種跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度相偶聯(lián)的。即電子傳遞釋放的自由能驅(qū)動H+從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進入膜間隙，從而形成跨線粒體內(nèi)膜的H+離子梯度，及一個電位梯度。這個跨膜的電化學電勢驅(qū)動ATP的合成。PeterMitchellNADH呼吸鏈中的三個復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ起著質(zhì)子泵的作用，將H+

從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進入膜間隙。H+不斷從內(nèi)膜內(nèi)側(cè)泵至內(nèi)膜外側(cè)，而又不能自由返回內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，從而在內(nèi)膜兩側(cè)建立起質(zhì)子濃度梯度和電位梯度即電化學梯度，也稱為質(zhì)子動力。當存在足夠的跨膜電化學梯度時，強大的質(zhì)子流通過嵌在線粒體內(nèi)膜的F0F1-ATP合酶返回基質(zhì)，質(zhì)子電化學梯度蘊藏的自由能釋放，推動ATP的合成?；瘜W滲透假說示意圖獲得1978年的諾貝爾化學獎p187支持化學滲透假說的實驗證據(jù)：氧化磷酸化作用的進行需要封閉的線粒體內(nèi)膜存在。線粒體內(nèi)膜對H+OH-K+Cl-都是不通透的。破壞H+

濃度梯度的形成（用解偶聯(lián)劑或離子載體抑制劑）必然破壞氧化磷酸化作用的進行。線粒體的電子傳遞所形成的電子流能夠?qū)+

從線粒體內(nèi)膜逐出到線粒體膜間隙。大量直接或間接的實驗證明膜表面能夠滯留大量質(zhì)子，并且在一定條件下質(zhì)子能夠沿膜表面迅速轉(zhuǎn)移。迄今未能在電子傳遞過程中分離出一個與ATP形成有關(guān)的高能中間化合物，亦未能分離出電子傳遞體的高能蛋白存在形式。

H+如何通過電子傳遞鏈“泵”出的？2、關(guān)于H+通過電子傳遞鏈“泵”出的兩種假設(shè)

（一般了解：質(zhì)子梯度的形成）氧化-還原回路機制

(Mitchell提出）：線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的各個氧-還中心即FMNCoQCytC以及Fe-S中心的排列可能即執(zhí)行電子轉(zhuǎn)移又能轉(zhuǎn)移基質(zhì)的質(zhì)子。但是在電子傳遞鏈中，（H+e-）載體只有兩個即FMNCoQ，則三個ATP合成部位中還缺少一個（H+e-）載體，假設(shè)CoQ發(fā)揮兩次作用。（Q循環(huán)）

質(zhì)子泵機制：電子傳遞導致復合體的構(gòu)象變化，而造成AA側(cè)鏈pK的變化，發(fā)揮質(zhì)子泵作用的側(cè)鏈暴露在內(nèi)膜內(nèi)側(cè)或外側(cè)（交替變化），從而使質(zhì)子發(fā)生移位。兩種假設(shè)目前都沒有獲得完整的實驗證據(jù)線粒體內(nèi)膜的表面有一層規(guī)則地間隔排列著的球狀顆粒，稱為FOF1-ATP合酶，也叫ATP合酶復合體或ATP合酶，是ATP合成的場所。FO是膜外質(zhì)子返回膜內(nèi)的通道，F(xiàn)1是催化ATP合成的部位，當膜外的質(zhì)子經(jīng)FO質(zhì)子通道到達F1時便推動ATP的合成。3、ATP的合成機制—FOF1-ATP合酶ATP合酶結(jié)構(gòu)示意圖F0F133當膜外的質(zhì)子經(jīng)F0質(zhì)子通道到達F1時便推動ATP的合成。膜間隙膜內(nèi)基質(zhì)是一個多亞基復合體，它由F0,F1兩個主要部分組成，其中F0（含質(zhì)子通道）含有4種多肽鏈，鑲嵌到內(nèi)膜中。F1呈球狀，它由、、、、五種亞基共9條多肽鏈構(gòu)成，即33，與F0結(jié)合伸向膜內(nèi)基質(zhì)，是催化ATP合成的部位。催化部位在亞基上1.頭部:該部是由內(nèi)膜伸出的基本顆粒，呈親水性，很容易分離下來，叫F1偶聯(lián)因子，簡稱F1因子。F1因子是依賴于Ca2+和Mg2+的ATP酶，由10條多肽鏈組成。這些肽鏈分為5種，即3、3、、和，其分子量依次為:56、52、32、21和11.5kDa。根據(jù)酶的活性分析，這5種多肽有一定的排列次序。如果把這些多肽亞基彼此分開，單獨存在則均無酶活性，而和亞基結(jié)合后，則表現(xiàn)出ATP酶活性。2.膜部:構(gòu)成膜部的成分稱為F0因子(70kDa)，含有的多條多肽鏈，多屬疏水性，嵌插在膜脂中。其中有一種小的脂蛋白(proteolipid)，是F0因子的寡霉素敏感成分，寡霉素和DCCD(N’-N環(huán)已基二亞胺)等ATP合成抑制劑，只有同此脂蛋白結(jié)合才起抑制作用。F0因子的功能和傳遞質(zhì)子有關(guān)，它是H+載體，可專一性地傳遞質(zhì)子。當去掉F1因子時，膜便對質(zhì)子具有高度通透性，質(zhì)子泄漏到基質(zhì)中。F1結(jié)合到膜上后，則可堵住質(zhì)子的泄漏，這說明，F(xiàn)0因子中含有質(zhì)子穿膜到達F1因子的通道。ATP合成酶是一種具有雙向作用的偶聯(lián)裝置。通常它利用順電化學梯度的H+流勢能合成ATP。反之，它也可利用水解ATP釋放出的能量起質(zhì)子泵作用，將H+抽到內(nèi)膜外(膜間隙)。究竟向著哪個方向運轉(zhuǎn)要決定于凈自由能(G)：當具有足夠的電化學梯度時，G支持H+運進基質(zhì)合成ATP；當電化學梯度降低到一定程度、G不足以支持H+運進基質(zhì)合成ATP時，ATP反而被ATP酶水解，向膜間隙運輸H+，以恢復梯度。FO有三種abc蛋白組成ATP合酶結(jié)合變化和旋轉(zhuǎn)催化假說

-----在構(gòu)象偶聯(lián)假說的基礎(chǔ)上產(chǎn)生利于ADP與Pi結(jié)合的構(gòu)象利于ATP生成的構(gòu)象無核苷酸結(jié)合的開放狀態(tài)ATP合酶的催化作用猶如一部分子水輪機認為F1的３個亞基分別處于３個不同的構(gòu)象狀態(tài)，一種處于開放的（O

）狀態(tài)，對底物親和力極低，一種構(gòu)象(L）與底物結(jié)合松弛，對底物沒催化能力，一種構(gòu)象(T)與底物緊密結(jié)合，并有催化能力，可使結(jié)合的ADP和Pi合成ATP。F1中部的亞基在質(zhì)子推動力的驅(qū)動下相對33作旋轉(zhuǎn)，由于３個亞基與亞基的不稱接觸，使其依次進行上述三種構(gòu)象的交替變化，Ｌ（結(jié)合ADP和Pi）→Ｔ（催化ADP和Pi合成ATP）→Ｏ（ATP釋放）。質(zhì)子流如何驅(qū)動AＴP合成？Boyer提出旋轉(zhuǎn)催化假說解釋ATP合酶作用機理。Walker獲得F1的晶體結(jié)構(gòu)支持了Boyer的假說。3人獲得1997年諾貝爾化學獎英國科學家Walker通過x光衍射獲得高分辯率的牛心線粒體ATP酶晶體的三維結(jié)構(gòu)，證明在ATP酶合成ATP的催化循環(huán)中三個β亞基的確有不同構(gòu)象，從而有力地支持了Boyer的假說。Boyer和Walker共同獲得1997年諾貝爾化學獎。亞線粒體結(jié)構(gòu)證明FOF1-ATP合酶中FOF1的功能1960年，E.Racker的氧化磷酸化的重組實驗：超聲波胰蛋白酶或尿素重組

亞線粒體囊泡Submitochondrialvesicles有電子傳遞能力但不能使ADP磷酸化具備氧化磷酸化能力根據(jù)當前最新測定,H+經(jīng)NADH-Q還原酶（復合體I）、細胞色素bc1復合體（Ⅲ）、細胞色素氧化酶（復合體Ⅳ）從基質(zhì)泵到膜外時，一對電子泵出的質(zhì)子數(shù)依次為4、2、4，而合成一個ATP分子是由3個H+通過ATP合酶所驅(qū)動。多出的H+可能用于ATP運出線粒體。所以每形成1molATP就需要4個Ｈ＋的流動。所以電子從NADH傳至O2，共產(chǎn)生的ATP分子數(shù)是2.5個（P/O=2.5）若從琥珀酸傳遞至O2，只有兩個偶聯(lián)部位，產(chǎn)生1.5個ATP(P/O=1.5)。每一對電子通過呼吸鏈傳遞給氧產(chǎn)生的ATP數(shù)？1、解偶聯(lián)劑（uncouplers）某些化合物能消除跨膜的質(zhì)子電化學梯度，使ATP不能合成，這種作用稱為解偶聯(lián)作用，這類化合物稱為解偶聯(lián)劑。

解偶聯(lián)劑不抑制電子傳遞。不抑制底物水平的磷酸化。解偶聯(lián)劑主要有：

化學解偶聯(lián)劑：2、4-二硝基苯酚解偶聯(lián)蛋白：不同的化學因素對氧化磷酸化作用的影響方式不同，據(jù)此將它們分成三大類：四、氧化磷酸化的解偶聯(lián)和抑制化學解偶聯(lián)劑：2、4-二硝基苯酚

（2、4-dinitrophenol,DNP）

DNP在pH=7的環(huán)境中以解離形式存在，是脂不溶的，不能過膜。在酸性環(huán)境中接受H+,成為不解離形式，是脂溶性的，很容易過膜，同時將H+帶入膜內(nèi)，起消除質(zhì)子濃度梯度的作用。亦稱質(zhì)子載體。中性環(huán)境酸性環(huán)境

－2，4-二硝基苯酚（DNP)NO2NO2O-NO2NO2OHNO2NO2O-NO2NO2OHH+H+線粒體內(nèi)膜內(nèi)外DNP在中性環(huán)境中以解離形式存在，是脂不溶的，不能過膜。在酸性環(huán)境中接受H+,成為不解離形式，是脂溶性的，很容易過膜，同時將H+帶入膜內(nèi)，起消除質(zhì)子濃度梯度的作用。解偶聯(lián)蛋白（產(chǎn)熱素）是存在于某些生物細胞線粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)，為天然解偶聯(lián)劑。它們能形成質(zhì)子通道，讓膜外的H+通過通道返回膜內(nèi)，消除跨膜質(zhì)子濃度梯度。如：動物的褐色脂肪組織，其產(chǎn)熱機制是線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)的結(jié)果。

人、新生無毛的哺乳動物以及冬眠的哺乳動物。直接作用于ATP合酶復合體而抑制ATP合成的一類化合物。由于影響（降低）O2的利用率，從而間接抑制電子傳遞。（區(qū)別于電子傳遞鏈抑制劑）寡霉素、雙環(huán)己基碳二亞胺（抑制FOF1某些蛋白的活性）2、氧化磷酸化抑制劑寡霉素等對利用氧的抑制作用可被DNP解除。離子載體（離子載體抑制劑）是一類脂溶性物質(zhì)，能與H+以外的其他一價陽離子結(jié)合，并作為他們的載體使他們能過穿過膜，消除跨膜的電位梯度。纈氨霉素（K+）短桿菌肽（K+Na+）

真核細胞細胞液中產(chǎn)生的NADH必須進入線粒體才能經(jīng)呼吸鏈氧化并生成ATP.

磷酸甘油穿梭蘋果酸-天冬氨酸穿梭外NADH脫氫酶五、線粒體穿梭系統(tǒng)1、磷酸甘油穿梭（P/O=1.5）NAD+NADH+H+P-甘油P-二羥丙酮P-甘油P-二羥丙酮3-P甘油脫氫酶（胞液）FAD

FADH23-P甘油脫氫酶（內(nèi)膜）CoQFe-SFP1cytb胞液外膜膜間空間內(nèi)膜動物的骨骼肌、腦及昆蟲飛行肌細胞溶膠NADH利用此穿梭2、蘋果酸-天冬氨酸穿梭（P/O=2.5）蘋果酸草酰乙酸NAD+NADH+H+蘋果酸草酰乙酸NAD+NADH+H+天冬氨酸谷氨酸α-酮戊二酸天冬氨酸谷氨酸α-酮戊二酸ⅠⅡ1243胞液膜間空間外膜內(nèi)膜基質(zhì)1、胞液的蘋果酸脫氫酶2、線粒體基質(zhì)的蘋果酸脫氫酶3、胞液的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶4、線粒體基質(zhì)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶Ⅰ、蘋果酸-α酮戊二酸反向交換載體

Ⅱ天冬氨酸-谷氨酸反向交換載體1動物心臟及肝臟胞質(zhì)溶膠內(nèi)NADH利用此穿梭3、外NADH脫氫酶（真菌和高等植物）

NADH脫氫酶（復合物Ⅰ）內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，朝向基質(zhì)

催化線粒體內(nèi)部的NADH脫氫交給其輔基FMN

將氫傳遞給CoQ

外NADH脫氫酶內(nèi)膜外側(cè)，朝向膜間空間是一種以FAD為輔基的黃素蛋白，催化細胞液的NADH脫氫交給其輔基FAD將氫傳遞給CoQ，不經(jīng)過復合物Ⅰ，P/O比1.5外膜內(nèi)膜膜間空間胞液基質(zhì)NADH+H+NADH+H+NAD+NAD+FPextFPintFe-SCoQcytbNADH+H+NAD+真菌和高等植物的胞液NADH進入呼吸鏈氧化的途徑（P/O=1.5）FADFMN葡萄糖徹底氧化的能量計算：原核生物真核生物：不同組織EMP的能量計算也需考慮部位。六、氧化磷酸化的調(diào)控(了解)ADP是關(guān)鍵物質(zhì)。ADP作為關(guān)鍵物質(zhì)對于氧化磷酸化作用的調(diào)節(jié)稱為呼吸控制（respiratorycontrol）

當細胞利用ATP做功時，ADP含量上升，又促進氧化磷酸化作用合成ATP。完整MT（mitochondrion）的呼吸控制值可達10，而受損傷或衰老的MT其呼吸控制值可降為1。懸浮的線粒體在無底物和ADP時,氧的利用率很低,為狀態(tài)I;氧耗盡后線粒體的呼吸停止,為狀態(tài)V.電子顯微鏡觀察表明：狀態(tài)III時，MT的超微結(jié)構(gòu)為“緊縮態(tài)”，ATP生成系統(tǒng)處于“活動”狀態(tài)。狀態(tài)IV時，MT的超微結(jié)構(gòu)為“常態(tài)”，ATP生成系統(tǒng)處于“靜止”狀態(tài)。常態(tài)緊縮態(tài)狀態(tài)IV時既無ADP;狀態(tài)III時既有底物和ADP.電子傳遞鏈的組分1.黃素脫氫酶2.鐵-硫蛋白3.輔酶Ｑ4.細胞色素復合體Ⅰ：NADH-CoQ還原酶復合體Ⅱ：琥珀酸-CoQ還原酶復合體Ⅲ：細胞色素還原酶復合體Ⅳ：細胞色素氧化酶復習化學滲透假說示意圖NADH+H+H+H+ADP+PiATP高質(zhì)子濃度H2O+++++++++__________2e-4H+4H+2H+4H+2H+質(zhì)子流線粒體內(nèi)膜磷酸化

氧化

復習1分子葡萄糖完全氧化產(chǎn)生的ATP酵解階段：2ATP

2

1NADH2ATP22.5ATP三羧酸循環(huán)：2

1GTP

2

3NADH

21FADH221ATP27.5ATP21.5ATP兌換率1：2.5兌換率1：1.5丙酮酸氧化：2

1NADH兌換率1：2.522.5ATP32ATP

2

1NADH22.5（1.5）ATP?3-磷酸甘油穿梭系統(tǒng)蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)32ATP30ATP30或32ATP第四節(jié)活性氧(自學)

概念產(chǎn)生機制活性氧種類和作用清除活性氧的機制三、氧化還原電位與自由能1、氧化還原電位：指氧化還原反應(yīng)中，反應(yīng)物得失電子的能力。用E表示。

氧化還原反應(yīng)—指反應(yīng)過程中凡是有電子從一物質(zhì)（還原劑）轉(zhuǎn)移到另一物質(zhì)（氧化劑）的化學反應(yīng)都屬于氧化還原反應(yīng)。通常所說某一物質(zhì)的氧化還原電位都是和標準氫電極比較得到的。

標準氫電極——是指在25C、一個大氣壓下，將鉑電極放入氫離子活度為1質(zhì)量摩爾濃度的