核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆

關(guān)于核移植技術(shù)與動(dòng)物克隆第1頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五克隆羊多利（Dolly）的誕生1997年2月，英國Roslin研究所宣布克隆羊多利（Dolly）的誕生揭示一個(gè)全新概念：由成年機(jī)體的一個(gè)體細(xì)胞核，可以復(fù)制一個(gè)基因完全相同的新生命個(gè)體。是克隆技術(shù)的里程碑?？寺∫辉~變得家喻戶曉第2頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五克隆來源于英語“clone”或“cloning”的音譯，起源于希臘文“Klone”，原意是用“插條”繁殖。曾譯為無性生殖或無性繁殖.克隆在分子、細(xì)胞、個(gè)體三個(gè)水平上第3頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五動(dòng)物克隆動(dòng)物克隆是指通過無性繁殖的手段，從一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞獲得遺傳背景相同的個(gè)體群的過程。獲得的個(gè)體群稱為克隆動(dòng)物（clonedanimal）第4頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五動(dòng)物克隆的研究歷史1、最初用胚胎分割的方法獲得克隆動(dòng)物。2、同卵雙生或孤雌生殖的方式獲得克隆動(dòng)物。3、通過核移植獲得克隆動(dòng)物，但開始僅限于胚胎細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的克隆。4、1997年，克隆羊多莉的誕生，標(biāo)志著體細(xì)胞克隆的成功。5、現(xiàn)有多種體細(xì)胞克隆動(dòng)物誕生，如牛、豬、老鼠、貓、羊、兔、貓、狗等。第5頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五1998年1月，美國威斯康星一麥迪遜大學(xué)的科學(xué)家們以牛的卵子為受體，成功克隆出豬、牛、羊、鼠和獼猴五種哺乳動(dòng)物的胚胎，這一研究結(jié)果表明，某個(gè)物種的未受精卵可以同取自多種動(dòng)物的成熟細(xì)胞核相結(jié)合。1999年，美國科學(xué)家用牛卵子克隆出珍稀動(dòng)物盤羊的胚胎；我國科學(xué)家也用兔卵子克隆了大熊貓的早期胚胎，在異種克隆研究領(lǐng)域，目前國際上僅有印度野牛和歐洲盤羊取得成功。到目前為止應(yīng)用異種核移植技術(shù)獲得的活體后代都來自于亞種間核移植。中國首例異體克隆動(dòng)物———瀕危動(dòng)物北山羊在新疆烏魯木齊縣六十戶鄉(xiāng)降生第6頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第7頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第8頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第9頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第10頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第11頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五獲得克隆動(dòng)物的方法1.胚胎分割2.孤雌生殖3.細(xì)胞核移植第12頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五1.胚胎分割胚胎分割（embryosplitting）是指采用機(jī)械方法用特制的纖維刀片或玻璃微針將早期胚胎分割成2等分、4等分或多等分，再移植給受體母畜，從而獲得同卵多仔的一項(xiàng)胚胎工程技術(shù)。第13頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第14頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五胚胎分割——

一卵雙生

第15頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五胚胎分割——

一卵雙生

第16頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五2.孤雌生殖孤雌生殖（parthenogenesis）:指卵子不經(jīng)受精，直接發(fā)育為個(gè)體的繁殖方式。如：蚜蟲、魚類、兩棲類、爬行類、鳥類第17頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五（一）偶發(fā)性孤雌生殖(sporadicparthenogenesis)：偶發(fā)性孤雌生殖是指某些昆蟲在正常情況下行兩性生殖，但雌成蟲偶爾產(chǎn)出的未受精卵也能發(fā)育成新個(gè)體的現(xiàn)象。常見的如家蠶、一些毒蛾和枯葉蛾等。

（二）經(jīng)常性孤雌生殖(constantparthenogenesis)：經(jīng)常性孤雌生殖也稱永久性孤雌生殖。這種生殖方式在某些昆蟲中經(jīng)常出現(xiàn)，而被視為正常的生殖現(xiàn)象?？煞譃閮煞N情況：

1、在膜翅目的蜜蜂和小蜂總科的-些種類中，雌成蟲產(chǎn)下的卵有受精卵和未受精卵兩種，前者發(fā)育成雌蟲，后者發(fā)育成雄蟲。

2、有的昆蟲在自然情況下，雄蟲極少，甚至尚未發(fā)現(xiàn)雄蟲，幾乎或完全行孤雌生殖，如一些竹節(jié)蟲、粉虱、蚧、薊馬等。

第18頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五（三）周期性孤雌生殖(cyclicalparthenogenesis)：周期性孤雌生殖也稱循環(huán)性孤雌生殖。昆蟲通常在進(jìn)行1次或多次孤雌生殖后，再進(jìn)行1次兩性生殖。這種以兩性生殖與孤雌生殖交替的方式繁殖后代的現(xiàn)象，又稱為異態(tài)交替(heterogeny)或世代交替(alternationofgenerations)。如棉蚜從春季到秋末，行孤雌生殖10一20余代，到秋末冬初則出現(xiàn)雌、雄兩性個(gè)體，并交配產(chǎn)卵越冬。第19頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五蜥蜴第20頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五蚜蟲第21頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五

問題在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞發(fā)生了分化，但是在適宜環(huán)境下，已分化的細(xì)胞能否重新恢復(fù)到發(fā)育的起始狀態(tài)，再重新發(fā)育成其它類型細(xì)胞組織的多能性，甚至發(fā)育成完整個(gè)體的全能性呢？細(xì)胞的分化是不是發(fā)生了不可逆的變化？第22頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五HANSSPEMANN

1935NobelLaureateinMedicine

forhisdiscoveryoftheorganizereffectinembryonicdevelopment.

1869-1941

Residence:Germany

Affiliation:UniversityofFreiburgimBreisgau

德國胚胎學(xué)家Spemann提出通過核移植可以驗(yàn)證不同發(fā)育階段和不同分化程度的細(xì)胞核是否具有全能性。第23頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五3.細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植（nucleartransfer）是指將早期胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞或成體動(dòng)物的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，重新組成重構(gòu)胚（reconstructedembryo）或克隆胚（clonedembryo）并使之發(fā)育成成體動(dòng)物的過程。

第24頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五提供細(xì)胞核的細(xì)胞稱為核供體（donor）接受細(xì)胞核的細(xì)胞稱為核受體（recipient）核供體：胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、體細(xì)胞（somaticcell）核受體：早期胚胎細(xì)胞、受精卵、MII期卵母細(xì)胞第25頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五減數(shù)分裂分裂期：減數(shù)分裂期Ⅰ：前期Ⅰ、前中期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ和胞質(zhì)分裂期Ⅰ等6個(gè)階段。減數(shù)分裂期Ⅱ：前期Ⅱ、前中期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ、末期Ⅱ和胞質(zhì)分裂期Ⅱ等6個(gè)階段。前期Ⅰ：細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期5個(gè)階段。第26頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第27頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五供體細(xì)胞的細(xì)胞核移入卵母細(xì)胞后，在卵母細(xì)胞相關(guān)因子的作用下，發(fā)生了重編程回復(fù)到發(fā)育的起點(diǎn)狀態(tài)。核重編程的過程就是使在體細(xì)胞中被關(guān)閉,而在正常胚胎發(fā)育中表達(dá)的基因重新被激活的過程.核移植的機(jī)理第28頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五重編程有三種可能的結(jié)果（1）供核基因組完全沒有進(jìn)行重編程重構(gòu)胚很快死亡；（2）部分重編程,重構(gòu)胚在不同的發(fā)育階段死亡；

（3）完全重編程,產(chǎn)生正常的克隆動(dòng)物。第29頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五細(xì)胞核移植分類根據(jù)核供體細(xì)胞來源的不同

1.胚胎細(xì)胞核移植

2.胎兒細(xì)胞核移植

3.體細(xì)胞核移植（SCNT）根據(jù)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞是否來源于同一種動(dòng)物又可將其分為

1.同種核移植2.異種核移植第30頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五顯微操作儀（micromanipulator）第31頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五胚胎細(xì)胞核移植

胚胎細(xì)胞核移植(embryocelluncleartransplantation)是指，將一個(gè)早期胚胎的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，構(gòu)建新合子的生物技術(shù)。第32頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五胚胎細(xì)胞核移植流程圖第33頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五歷史回顧1938年Spemann提出設(shè)想：分化了的細(xì)胞核移植能否指導(dǎo)胚胎發(fā)育？1952年Briggs和King在兩棲動(dòng)物證實(shí)了Spemann提出的設(shè)想：利用已分化的蛙囊胚細(xì)胞核移植到去核的蛙卵母細(xì)胞中，得到了重新發(fā)育的結(jié)果，從而證明了不同時(shí)期的胚胎細(xì)胞核在相同的卵質(zhì)中具有重新發(fā)育的能力，在特定條件下，可以恢復(fù)其發(fā)育的全能性。第34頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的伊爾門澤、美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室，首次對小鼠胚胎細(xì)胞進(jìn)行核移植獲得成功。此后，胚胎細(xì)胞的核移植在多種動(dòng)物上獲得了克隆后代，如綿羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),豬(Prather等,1989),山羊(張勇等,1991)等。直到1997年才由Mengetal成功地克隆出兩只猴,這是靈長類動(dòng)物的首次被克隆。第35頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五

直至此時(shí),核移植所用的供體細(xì)胞均為囊胚階段以前的胚胎細(xì)胞。當(dāng)時(shí)人們普遍認(rèn)為，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后則隨著分化而逐漸喪失其全能性。第36頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五內(nèi)細(xì)胞群2.雌原核與雄原核融合3.卵裂開始4.2細(xì)胞期極體透明帶極體卵裂球受精卵原核卵周腔5.4細(xì)胞期6.8細(xì)胞期滋養(yǎng)層7.桑椹胚胚泡腔8.囊胚1.雌原核與雄原核形成

第37頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五體細(xì)胞核移植技術(shù)動(dòng)物克隆技術(shù)的里程碑第38頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五

體細(xì)胞核移植技術(shù)(somaticcelluncleartransplantation)是指，將分化程度較高的體細(xì)胞移植入去核的卵母細(xì)胞中構(gòu)建新合子的生物技術(shù)。體細(xì)胞核移植第39頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五歷史回顧1996年，世界第一例從成年動(dòng)物細(xì)胞克隆出的哺乳動(dòng)物綿羊多莉誕生。這個(gè)秘密直到1997年2月才向世人公布。1997年7月，蘇格蘭科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將一個(gè)人類基因?qū)刖d羊體細(xì)胞，克隆了帶有人類基因的綿羊“波莉”。第40頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五1998年7月，美國夏威夷大學(xué)Wakayama等報(bào)道，由小鼠卵丘細(xì)胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，這是繼“多莉”以后的第二批哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植后代。此后，體細(xì)胞核移植技術(shù)在牛、山羊、豬等多種動(dòng)物獲得成功。至1999年底，全世界已有6種類型細(xì)胞——胎兒成纖維細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、輸卵管／子宮上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和耳部皮膚細(xì)胞的體細(xì)胞克隆后代成功誕生。第41頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五多莉的誕生過程第42頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第43頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五體細(xì)胞核移植程序核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備重構(gòu)胚的激活重構(gòu)胚的培養(yǎng)移植給代孕動(dòng)物去核卵母細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控后的體細(xì)胞融合后形成重構(gòu)胚裝核第44頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第45頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五1.核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備常用的體細(xì)胞有：卵丘細(xì)胞顆粒細(xì)胞皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞在體外一般在體外傳代8-16次第46頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五A

組織塊培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞

B消化培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞

第47頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五2.細(xì)胞周期的調(diào)控1.血清饑餓法2.Aphidicolin（阿菲迪霉素）法3.激活卵母細(xì)胞法第48頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五第49頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五3.受體細(xì)胞準(zhǔn)備目前為止，有三類用于核移植產(chǎn)生了后代第一類是去除原核的受精卵第二類是早期胚胎；第三類即是MⅡ期的卵母細(xì)胞。常用的是MⅡ期的卵母細(xì)胞，一般通過超數(shù)排卵和體外成熟培養(yǎng)獲得第50頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五4.去核的方法1.盲吸法2.半卵法3.熒光引導(dǎo)核法4.微分干涉顯微鏡去核法5.功能性去核法6.離心去核法7.末期去核法第51頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五盲吸去核法一般將脫去顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞用含7.5ug/mlCB的培養(yǎng)液中清洗3-4遍后移入100ul左右的上述溶液的液滴中，同時(shí)將供體細(xì)胞加入液滴中。石蠟油覆蓋后于顯微操作儀上用固定針吸住卵母細(xì)胞，用去核針撥動(dòng)之，使第一極體位于1點(diǎn)位置；去核針從3點(diǎn)處進(jìn)針，針尖斜面部分刺入卵泡內(nèi)，吸出第一極體及其下方的1/4-1/3胞質(zhì)（包括細(xì)胞核）；然后從操作液中吸取形態(tài)圓，邊緣略粗糙的核供體細(xì)胞，從原針吸口處注入透明帶下并輕壓透明帶。去核舉例第52頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五MII期卵母細(xì)胞第53頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五去核過程第54頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五5.裝核將準(zhǔn)備好的體細(xì)胞放入去核卵母細(xì)胞的過程。將體細(xì)胞放入帶下第55頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五ABCDEFA顯微注射針刺入卵母細(xì)胞前B開始吸取第一極體C極體已被吸入注射針D去除極體后的卵母細(xì)胞E注射供體細(xì)胞F供體細(xì)胞已被注入透明帶下第56頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五直接注射法第57頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五6.細(xì)胞融合

細(xì)胞融合的方法有：病毒介導(dǎo)融合化學(xué)融合電融合第58頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五利用電穿孔的原理來使細(xì)胞融合。為使供/受體細(xì)胞的接觸面與電場方向垂直,更有利于融合,可在待融的供/受體復(fù)合物移入兩微電極絲所組成的融合小槽內(nèi)后用一次交流脈沖或手工排步的方式來達(dá)到這一目的。電融合舉例第59頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五卵母細(xì)胞與體細(xì)胞電融合過程第60頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五7.重構(gòu)卵激活正常情況下,受精過程中，精子進(jìn)入卵子后,卵母細(xì)胞質(zhì)中會(huì)出現(xiàn)一系列的反應(yīng),如游離Ca2+濃度增高、母源性的mRNA啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄、MPF等因子活性下降等。這些反應(yīng)是卵母細(xì)胞被激活的標(biāo)志，不經(jīng)過這些變化,胚胎就不能正常發(fā)育。核移植過程中的激活就是模仿受精過程中精子的刺激作用。目前，激活的方式有電激活、化學(xué)激活和注射精子因子激活三種?；瘜W(xué)激活常用藥品有：鈣離子載體（A23187）、7%乙醇、離子霉素、6-DMAPSrCl2第61頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五8.重構(gòu)胚的培養(yǎng)重構(gòu)胚移入受體之前的培養(yǎng)方法有體外培養(yǎng)和體內(nèi)培養(yǎng)兩種方法。體外培養(yǎng)法相對要簡單、方便的多。目前為大部分核移植所采用。第62頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五重構(gòu)胚體外發(fā)育圖第63頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五人類體細(xì)胞核移植技術(shù)第64頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五歷史回顧2001年，美、意科學(xué)家聯(lián)手展開克隆人的工作。2001年11月美科學(xué)家宣布首次克隆成功了處于早期階段的人類胚胎，稱其目的是為病人“定制”出不會(huì)誘發(fā)排異反應(yīng)的人體組織器官，用于移植。2004年2月11日，美國《科學(xué)》雜志宣布，漢城國立大學(xué)研究小組成功克隆出人類早期胚胎，并從中提取出胚胎干細(xì)胞。由于法律的限制，人的克隆僅限于治療性克隆。第65頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五治療性克隆技術(shù)途徑包括以下幾個(gè)步驟：首先取病人體細(xì)胞核，移植到去核的成熟受體卵母細(xì)胞；在早期胚胎形成后，從中分離獲得人ES細(xì)胞；對ES細(xì)胞進(jìn)行基因修飾和定向分化研究；將定向分化后的細(xì)胞移植給病人。第66頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五治療性克隆流程圖第67頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五生殖性克隆流程圖第68頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五人類體細(xì)胞核移植存在的問題在人類，由于倫理等原因，卵母細(xì)胞的獲得比較困難，這就給體細(xì)胞核移植技術(shù)在人類醫(yī)療方面的應(yīng)用帶來很大的限制，限制了核移植技術(shù)為人類服務(wù)的初衷。第69頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五解決辦法異種核移植第70頁，共80頁，2022年，5月20日，1點(diǎn)42分，星期五異種核移植將人的體細(xì)胞作為核供體，另一種動(dòng)物的卵母細(xì)胞為受體細(xì)胞而進(jìn)行的核移植技術(shù)。

人體細(xì)胞動(dòng)物卵母細(xì)胞去核異種克隆胚第71頁，共80頁，2022年，5月20