抗生素微生物檢定標準操作規(guī)程

抗生素微生物檢定標準操作規(guī)程抗生素微生物檢定標準操作規(guī)程抗生素微生物檢定標準操作規(guī)程V:1.0精細整理，僅供參考抗生素微生物檢定標準操作規(guī)程日期：20xx年X月抗生素微生物檢定標準操作規(guī)程1簡述抗生素微生物檢定法系在適宜條件下，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，計算抗生素活性（效價）的方法。依試驗設計原理不同，可分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴散法。后二者被列為抗生素微生物檢定的國際通用方法。中國藥典也采用這兩種方法?？股匚⑸餀z定管碟測定法系瓊脂擴散法，是利用抗生素在攤布特定試驗菌的固體培養(yǎng)基內成球面形擴散，形成含一定濃度抗生素球形區(qū)，抑制了試驗菌的繁殖而呈現出透明的抑菌圈。此法系根據抗生素在一定濃度范圍內，對數劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關系而設計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，比較標準品與供試品產生抑菌圈的大小，計算出供試品的效價?？股匚⑸锉葷岱ㄊ菍⒁欢康目股丶又两臃N有試驗菌的液體培養(yǎng)基內，混均后，經培養(yǎng)，測量培養(yǎng)基濁度。此法系根據抗生素在一定的濃度范圍內，其濃度或濃度的數學轉換值與試驗菌生長產生的濁度（濁度與細菌群體質量及細菌細胞容積的增加之間存在直接關系）之間存在線性關系而設計，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，計算出供試品的效價?？股匦r以“單位（u）”或“微克（μg）”表示。抗生素管碟測定法2儀器與用具2.1操作室光線明亮，操作室應分為兩部分，彼此分開，其中一部分為一般操作室，一部分為半無菌操作室。半無菌操作室應設有紫外線滅菌燈，并附設空氣凈化（空氣凈化級別為100級～10，000級）及空調設備，控制室溫在20～25℃2.2雙碟內徑約90mm，高16～17碟底平度檢查，可將雙碟放在水平臺上，下墊一張白紙，碟內加水2～3ml，再滴加藍墨水，觀察藍色深淺是否一致。用過的雙碟經高壓滅菌倒出培養(yǎng)基后，置清洗液中浸泡過夜，沖洗，瀝干，至150℃～160℃干熱滅菌2小時或高壓121℃蒸氣滅菌30分鐘，備用。2.3陶瓦蓋內徑約103mm，外徑1082.4鋼管內徑（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；外徑（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套鋼管重量差異不超過±0.05g，內外壁及兩端面光潔平坦，管壁厚薄一致。每次使用后應置1:1000新潔爾溶液內，浸泡2小時以上，滅菌后再洗滌，先用水洗滌，超聲波超聲30分鐘或用沾有去污粉的紗布條串擦內外壁，水沖洗，瀝干，再用蒸餾水沖洗3次后，置帶蓋的容器內，在150℃～2.5鋼管放置器有6孔和4孔兩種。放置于無菌或半無菌室的操作平臺上，鋼管下落時應垂直平穩(wěn)、位置正確。雙碟升降平穩(wěn)。應保持清潔，防止抗生素污染?？啥ㄆ谟?5%乙醇棉擦拭落管筒及儲管杯。置鋼管的玻璃管應定期干烤滅菌。2.6恒溫培養(yǎng)箱以隔水式為宜，溫度平穩(wěn)，波動小。設置漂移溫度為35～37℃或24～262.7滅菌刻度吸管用于吸取菌液及培養(yǎng)基。使用后應立即置5%石炭酸或1:1000新潔爾溶液中消毒后，再按玻璃容器的常規(guī)洗滌法洗滌。洗滌瀝干后在吸口處塞入脫脂棉（松動，透氣），置適宜容器中，在120℃以上干熱滅菌2小時或1212.8玻璃容器包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均應符合“常用玻璃量器國家計量檢定規(guī)程”的規(guī)定。每次使用前用清潔液浸泡，水沖洗，并用蒸餾水或去離子說沖洗3次，瀝干。2.9稱量瓶重量在10g以下。用畢先用水沖洗、瀝干，置清潔液浸泡2小時以上，然后分別用水、蒸餾水或去離子說沖洗3次，置潔凈平皿中，在120℃干熱滅菌3小時，待冷至60～2.10滴管用玻璃管拉制，管口光滑。使用前在清潔液浸泡，分別用水、蒸餾水后去離子水沖洗3次，置適宜容器中，在120℃干燥3小時后備用2.11天平分析天平，精密度0.1mg，經計量檢定。2.12抑菌圈直徑（面積）測量儀應符合“抑菌圈測量儀檢定規(guī)程”的規(guī)定。2.13游標卡尺精度0.05mm，長度1252.14超凈工作臺有效工作面局部潔凈度100級。用于試驗菌的接種傳代或菌懸液制備。超凈工作臺須置潔凈工作室或半無菌室內。3試液3.1滅菌緩沖液制備緩沖液的試劑應為分析純，配制后的緩沖液應澄明，分裝于玻璃容器內，經121℃3.1.1磷酸鹽緩沖液（pH6.0）取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成10003.1.2磷酸鹽緩沖液（pH7.0）取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）9.39g與磷酸二氫鉀3.5g，加水使成10003.1.3磷酸鹽緩沖液（pH7.8）取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成10003.1.4磷酸鹽緩沖液（pH10.5）取磷酸氫二鉀35g，加氫氧化鉀液，加水使成1000ml4培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的各成分原料質量對抑菌圈邊緣清晰度及試驗結果影響較大，因此應對原材料進行預試驗，挑選適當的品牌使用。制成的培養(yǎng)基不應有沉淀，如產生沉淀，可在配制培養(yǎng)基后，于115℃加熱20分鐘溶化，趁熱用紙漿減壓或適宜方法過濾，調整pH值，分裝滅菌備用。中國藥典2005年版二部附錄的抗生素生物檢定法中收載了13種不同處方的培養(yǎng)基及制備方法。目前，已有市售干燥培養(yǎng)基，使用方便。臨用時按照使用說明進行配制，但應注意核對培養(yǎng)基的pH，必要時需調節(jié)pH，使其符合規(guī)定。另外，市售干燥培養(yǎng)基的質量也存在差異，注意選擇合適的產品。5試驗菌5.1菌種的復蘇檢定用標準菌種為冷凍干燥品，由中國藥品生物制品檢定所提供。5.1.1取凍干菌種管、滅菌1ml毛細滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面，移入接種室操作臺或超凈工作臺。5.1.25.1.3取滅菌鑷子，在酒精燈火焰上方，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內，另取1支滅菌毛細滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動是其溶解，隨即吸出管內菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內，并將毛細滴管及菌種管投入消毒液內，將已接種的營養(yǎng)瓊脂斜面置35～37℃培養(yǎng)5.1.4取出培養(yǎng)物，仔細觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌，涂片并進行革蘭氏染色鏡檢，如呈典型菌落，則轉種3代即可使用。菌落不典型時，可進行平板分離單菌落。5.2菌種的接種與保存5.2.1準備需用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。在標簽上注明菌名及接種日期。從冷藏箱中取出菌種斜面后，應在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。5.2.2點燃酒精燈或煤氣燈等，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒種，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰上方。塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內至瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折蛇形移動，使細菌接種在斜面的表面上。5.2.3取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過細菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。5.2.4將已接種的細菌管置35～37℃培養(yǎng)22～24小時，霉菌管一般置24～25℃霉菌培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后放入5.3菌懸液的制備5.3.1枯草芽孢桿菌[BacillussubtilisCMCC（B）63501]懸液取枯草芽孢桿菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，加滅菌水1～2ml將菌苔洗下，制成懸液，用吸管將此懸液接種至盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶內，均勻攤布，在35～37℃培養(yǎng)7天。取菌苔少許涂片，革蘭氏染色鏡檢，應有芽孢85%以上，用滅菌水10ml將芽孢洗下，制成芽孢懸液，合并至滅菌大試管內，在65℃水浴中加熱30分鐘將菌體殺死，待冷后置日常試驗用菌液取上述濃溶液，用滅菌水1:3稀釋至滅菌試管中，冷藏箱保存?zhèn)溆谩?.3.2短小芽孢桿菌[BacillussubtilisCMCC（B）63202]懸液取短小芽孢桿菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照上述方法制備芽孢懸液。5.3.3金黃色葡萄球菌[StaphylococusaureusCMCC（B）26003]懸液取金黃色葡萄球菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌苔少許接種至營養(yǎng)瓊脂斜面上，在35～37℃培養(yǎng)22～24小時，臨用時，用滅菌水將菌苔洗下，制成懸液。置45.3.4藤黃微球菌[MicrococcusluteusCMCC（B）28001]懸液取藤黃微球菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用1ml培養(yǎng)基Ⅲ將菌苔洗下，用吸管移至盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶中，均勻攤布，將培養(yǎng)瓶倒置于培養(yǎng)箱中26～27℃培養(yǎng)24小時取出，用吸管吸取培養(yǎng)基Ⅲ或0.9%滅菌氯化鈉溶液5ml至培養(yǎng)瓶中，將菌苔洗下，合并菌液至滅菌大試管中備用。置45.3.5大腸桿菌[EschehchiacoliCMCC（B）44103]懸液取大腸桿菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液項下的方法制備菌懸液，供當日使用。5.3.6肺炎克雷伯氏菌[KlebosiellapneumoniaeCMCC（B）46117]懸液取肺炎克雷伯氏菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液項下的方法制備菌懸液，供當日使用。5.3.7啤酒酵母菌[Saccharomycescerevisiae9736]懸液取啤酒酵母菌的V號培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌苔少許接種于Ⅳ號培養(yǎng)基斜面上，在32～35℃試驗菌的菌齡對抑菌圈邊緣清晰度有一定影響，應保持菌種新鮮。對易變異的菌株如藤黃微球菌等，宜在制備菌液前進行單菌落的分離，選擇典型菌落以保持菌懸液中菌群的一致性，以使所得的抑菌圈邊緣清晰、整齊。6操作法6.1稱量6.1.1稱量前先將標準品從冰箱中取出，使其溫度與室溫平衡。6.1.2供試品與標準品的稱量應使用用一架天平；對于吸濕性較強的抗生素，應在稱量前1～2小時更換天平內干燥劑。6.1.3標準品與供試品的稱量盡量一次取樣稱取，不得將已取出的稱取物倒回原容器內。標準品的稱取量不得少于20mg，取樣后立即將盛有樣品的稱量瓶或適宜的容器用蓋蓋好，以免吸水。稱樣量的計算：W=V·CP式中W為需稱取標準品或供試品的重量（mg）；V為溶解標準品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積（ml）；C為標準品或供試品濃溶液的濃度（u/ml或μg/ml）；P為標準品的純度或供試品的估計效價（u/mg或μg/mg）。6.2稀釋稀釋操作應遵照容量分析的操作規(guī)程進行。6.2.1用于溶解及稀釋標準品或供試品的容量瓶和移液管等玻璃量器，應按“常用玻璃量器國家計量檢定規(guī)程”進行標定，符合A級的要求。每步稀釋，量取量不得少于2ml，稀釋步驟一般不超過3步。舉例：量取貯備液（1000u/ml），進行以下稀釋。50ml量瓶，稀釋至刻度第一步精密量取5ml（1000u/ml）100u/ml50ml量瓶，稀釋至刻度第一步精密量取5ml（1000u/ml）10u/ml（H）100ml量瓶，稀釋至刻度第一步精密量取5ml（1000u/ml）5u/ml（L）6.2.2量取供試品溶液盡量使用刻度移液管，正式量取前要用供試液流洗2～3次，吸取供試溶液后，用濾紙將外壁多余液體拭去，從起始刻度開始放溶液。6.2.3標準品溶液和供試品溶液應使用同一緩沖液（溶劑）稀釋，以避免因pH或濃度不同而影響測定結果。6.2.4稀釋時，每次加液至接近量瓶刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準確補加至刻度。6.2.5二劑量（2.2）法的標準品溶液及供試品溶液高、低濃度之比為1:0.8。但所選用的濃度必須在劑量反應直線范圍內。6.3雙碟制備6.3.1雙碟的制備應在半無菌室或潔凈室內進行，并注意避免微生物及抗生素的污染。培養(yǎng)基應在水浴中或微波爐內融化，避免直火加熱。6.3.2底層用滅菌大口20ml吸管或其他滅菌分裝器，吸取已融化的培養(yǎng)基20ml注入雙碟內，待凝固后更換干燥的陶瓦蓋，放置于35～37℃6.3.3菌層取出試驗用菌懸液，按預試好的加菌量[（2.2）法標準品溶液的高濃度所致的抑菌直徑在18～22mm，（3.3）法標準品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18mm]，用滅菌吸管吸取懸液適量，加入已融化并保溫在水浴中（水浴溫度，細菌為48～50℃。芽孢可至60℃）的培養(yǎng)基內，搖勻，作為菌層培養(yǎng)基用。取出加有底層培養(yǎng)基的雙碟，用滅菌大口5ml、106.3.4放置鋼管用鋼管放置器，將滅菌的鋼管放入貯管筒（杯）內，按說明書的要求操作，使鋼管平穩(wěn)地落在培養(yǎng)基上，注意使各鋼管下落的高度基本一致。如無鋼管放置器，可用小眼科鑷子夾持鋼管，輕輕地放置在培養(yǎng)基上，相應劑量的鋼管對角均勻放置。鋼管放妥后，應使雙碟靜置5～10分鐘，鋼管在瓊脂上沉穩(wěn)后，再開始滴加抗生素溶液。6.4滴加抗生素溶液6.4.1每批供試品取不少于6個雙碟，滴加溶液用滅菌毛細滴管或微量加樣器（調節(jié)加樣量約為200～300μl），在滴加之前須用溶液洗2～3次。6.4.2滴加標準品及供試品溶液順序，因實驗設計方法不用而異。（2.2）法，在雙碟的4個鋼管中分別成“Z”字形滴加標準品（S）及供試品（T）高（H）、低（L）兩種濃度的溶液，即滴加溶液的順序為SH－TH－TL－SL；（3.3）法的6個鋼管中間隔3個鋼管中分別滴加標準品及供試品高（H）、中（M）、低（L）3種濃度溶液，并使相同濃度成對角，滴加順序為SH－TH－SM－TM－SL－TL。滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液的間隔不可過長，否則因鋼管內溶液的擴散時間不同會影響測定結果。6.4.3每份滴加的溶液為同一單位，但雙碟數每次不超過5個，如果1份溶液滴加雙碟數目多，可分次滴加。每種溶液各用1支毛細滴管。6.4.4滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤內，雙碟疊放不可超過3層，以免受熱不均，影響抑菌圈大小。將雙碟托盤水平平穩(wěn)地移入培養(yǎng)箱中間位置，在35～37℃6.5抑菌圈測量6.5.1將培養(yǎng)好的雙碟取出，拿掉陶瓦蓋，將鋼管倒入盛有1:1000新潔爾滅（苯扎溴銨）溶液或其他消毒液內滅菌，換以玻璃蓋；測量抑菌圈前，應檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或圈不圓整，應舍棄該碟，切忌主觀挑選雙碟或抑菌圈，以免造成測定結果的偏倚。6.5.2測量抑菌圈可以使用抑菌圈測量儀，也可用游標卡尺；使用的抑菌圈測量儀應經過檢定，并符合檢定規(guī)程的要求，操作時應按儀器的操作規(guī)程進行：使用游標卡尺測量時，眼睛視線應與讀數刻度垂直，用卡尺的尖端與抑菌圈直徑的切點成垂直方向測量。7記錄與計算7.1記錄試驗記錄應包括抗生素藥品名稱、規(guī)格、批號、生產廠、檢查編號、檢查依據、檢驗日期、溫度、相對濕度、標準品名稱、標準品批號、標準品來源及標準品標示含量、試驗菌名稱及菌懸液濃度、培養(yǎng)基名稱、來源及批號、緩沖液名稱及pH、供試品估計效價、抑菌圈測量儀型號及編號、標準品與供試品的稱量、稀釋步驟、試驗人與校核人、抑菌圈測量及數據處理結果。當用游標卡尺測量抑菌圈直徑時，應將測得數據按相應劑量濃度以列表形式記錄。用測量儀測量抑菌圈面積或直徑時，應將儀器的測量、數據處理、統(tǒng)計分析及計算結果打印后貼附于記錄頁上。7.2計算7.2.1二劑量法（2.2法）效價計算公式P=log-1[T2+T1－S2－S1=I]×100%T2+S2－T1－S1式中P為供試品效價（相當于標示量或估計效價的百分數）；S2為標準品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；S1為標準品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T2為標準品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T1為標準品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；I為高、低劑量之比的對數值，2:1時，I=0.301。4:1時，I=0.602。舉例乳糖酸紅霉素效價測定結果計算（見表1）表1抑菌圈面積測量結果抑菌圈面積碟數S1S2T2T1115711276158112682148111991523117331523130214971263415181214153312265157312371543126861546121915801224714951260152612408153012371548126391605125615931293101649127216081320∑15491124721553212528估計效價（AT）=603u/mg劑距（I）=0.301P=log-1[15532+12528-15491-12472×0.301]×100%=101.1%15491+15532-12472-12528效價（PT）=P×AT=603u/mg×101.1%=609.8u/mg7.2.2P=log-1[0.1292（T3+T2+T1－S3－S2－S1）]×100%S3+T3－S1－T1式中S3為標準品高濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；S2為標準品中間濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；S1為標準品低濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T3為供試品高濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T2為標準品中間濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T1為標準品低濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；I為高、低濃度劑量之比的對數值，1:08時，I=0.0969。舉例新霉素效價測定結果計算（見表2）。表2抑菌圈直徑測量結果抑菌圈直徑碟數S1S2S3T1T2T3116.0516.2016.5015.8016.3516.60216.2016.4516.6516.2016.4516.70316.0016.4516.7016.0516.3516.70415.9516.3516.6016.0016.2516.60515.7016.2516.6015.8516.2516.60615.5516.2016.5515.7016.2016.60715.6516.2016.4015.8016.1516.40815.9016.1016.4515.8016.1016.50915.6016.0016.3015.7015.9516.30∑142.60146.20148.75142.90146.05149.00估計效價（AT）=670u/mg劑距（I）=0.0969P=log-1[0.1292（142.9+146.05+149.00-142.6-146.2-148.75]×100%148.75+149.00-142.6-142.9P=101.1%效價（PT）=P×AT=101.1%×670u/mg=676.7u/mg8結果判定8.1可靠性測驗管碟法系根據量反應平行線原理而設計，并要求在試驗所用的劑量（濃度）范圍內，對數劑量（濃度）與反應呈直線關系?？煽啃詼y驗即通過對劑間變異的分析，以測驗標準品和供試品的對數劑量與反應的關系是否顯著偏離平行直線。（2.2）法的劑間變異分析為試品間、回歸和偏離平行三項；（3.3）法還需再分析二次曲線和反向二次曲線，如用游標卡尺測量抑菌圈直徑，可用（2.2）法和（3.3）法的專用數據處理軟件對測量數據進行統(tǒng)計學處理和結果計算。用抑菌圈測量儀測量抑菌圈時，測量與統(tǒng)計學處理一次完成，統(tǒng)計學分析按藥典附錄的生物檢定統(tǒng)計法進行F的顯著性測驗。（2.2）法要求直線回歸和劑間要非常顯著（P<0.01），偏離平行不應顯著（P>0.05）；（3.3）法除（2.2）法的上述規(guī)定外，尚需考察二次曲線和反向二次曲線，且二者均應不顯著（P>0.05），符合以上各項規(guī)定后，才能認為試驗結果可靠，方可進行效價和可信限率計算。8.2可信限率考核試驗的精密度。除藥典各論另有規(guī)定外，管碟法的可信限率不得超過5%。上述各項都能符合者，試驗結果成立。8.3試驗計算所得效價低于估計效價的90%或高于估計效價的110%，則檢驗結果僅作為初試，應調整供試品估計效價，予以重試。8.4原料藥效價測定一般需做雙份樣品平行試驗，以使核對。對于檢驗結果不符合規(guī)定的樣品，應有可靠性測驗及可信限率均符合規(guī)定，且測定結果在估計效價（原料藥）或標示量（制劑）±10%范圍內的至少2個效價測定結果，必要時應請其他檢驗人員復核，才能發(fā)出檢驗報告。8.5效價測定結果的有效數字按藥典規(guī)定及數字的原則取舍。9操作要點9.1抗生素原料藥不含輔料的藥物制劑原料，一般其效價以純度（u/mg或μg/mg）表示。檢驗時，可參考該品種的藥品標準純度限度規(guī)定或廠方提供的純度估計效價，取樣試驗，如估計效價與實際效價相差較遠時，即測定所得效價超出估計效價的±10%時，則重新估計效價，再做準確測定。原料藥一般皆以干燥品或無水物折算效價，須先測其含水或未折干效價，再根據供試品的水分或干燥失重測定結果折算成無水物或干燥品的效價。干燥品或無水物效價（u/mg）=濕品（或未折干品）效價（u/mg）1-供試品干燥失重或水分%9.2抗生素制劑9.2.1粉針劑指注射用無菌粉末或凍干品，用西林瓶橡膠塞鋁蓋封裝或熔封在安瓿內，一般測定其純度（u/mg或μg/mg）或整瓶效價。取裝量差異項下的內容物，稱取適量（50mg以上，根據標示量及平均裝量折算估計效價，并按估計效價及量瓶體積計算取樣量），置量瓶中，加標準中規(guī)定的溶劑溶解，稀釋，測定，計算出1mg的效價單位數，再根據平均裝量及標示量計算平均每瓶的百分含量。9.2.2水針劑（注射液）即抗生素的滅菌水溶液，標示量一般按每毫升含效價單位計。效價測定時，量取平均裝量項下的內容物或5～10支的內容物，混勻，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供試品，將吸管外壁用濾紙拭凈，再棄去多余的溶液，使供試品至吸管刻度，沿量瓶頸部內壁緩緩流放入已盛有一定量溶劑（以免抗生素結晶析出）的量瓶內，混勻，繼續(xù)加溶劑至刻度，搖勻，再量取適量稀釋至規(guī)定的濃度。9.2.3片劑包括素片、薄膜衣片、糖衣片及腸溶片。素片、薄膜衣片稱取20片的總量，求出平均片重，研細混勻后，精密稱取適量（約相當于1片的重量或根據標示量按平均片重及所用量瓶體積折算取樣量），置量瓶中，用標準中規(guī)定的溶劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻。再量取適量稀釋至規(guī)定濃度。注意點：研磨時應注意環(huán)境干燥，可在干燥操作柜內操作，研磨要迅速，避免吸濕，因片劑內含輔料較多，輔料可能漂浮于溶液表面，稀釋時量取供試溶液應讀取輔料下層的溶液切面；如沉淀較多，須待其下沉后再量取上層液；有些輔料吸附抗生素，應加以注意。為節(jié)約供試品，可與重量差異檢查結果進行。糖衣片、腸溶片取標準中規(guī)定的片數，置于乳缽中，研細，分次加入規(guī)定的溶劑，研磨使其溶解，將研磨液轉移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶體積根據供試品標示量、所取片數及抗生素儲備液濃度（一般為1000單位/ml）選定，用規(guī)定溶劑稀釋至刻度，搖勻，靜置，使輔料下沉而抗生素已溶解在溶液內，精密吸取量瓶中的上層液適量，作進一步稀釋。個別品種標準如同時收載了糖衣片和薄膜衣片，可能規(guī)定薄膜衣片也取整片制備供試品溶液。9.2.4膠囊劑取裝量差異項下的內容物，混合均勻，研細，根據平均裝量，精密稱取約相當于1粒膠囊的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，如供試品含有較多的輔料，則照片劑項下的方法進行。9.2.5顆粒劑、干混懸劑取裝量差異項下的內容物，混勻，根據平均裝量，精密稱取約相當于1袋（包）的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。量取適量稀釋制成供試品溶液。測得效價后，再根據裝量差異項下的平均裝量，計算出平均每袋（包）的效價，根據標示量即可算出含量。9.2.6軟膏劑、眼膏劑擦凈軟膏劑或眼膏劑軟管的外壁，切開封口，置于干燥器內約1小時，取干燥的潔凈分液漏斗，帶手套操作，將膏劑軟管連同內容物在天平上稱重，取出，將內容物擠入分液漏斗，量約2g，再稱取膏劑軟管的重量，按減重法以前后稱量之差計算分液漏斗內膏劑供試品的量，以不號過氧化物的乙醚或石油醚等作溶劑溶解基質，但基質中抗生素則應不溶于或幾乎不溶于該有機溶劑中，以避免提取過程中抗生素的損失。按標準中的規(guī)定加提取溶劑至分液漏斗中，振搖，使基質溶解，用規(guī)定的緩沖溶液提取抗生素至說相中，用緩沖溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加緩沖溶液至刻度，搖勻，量取適量稀釋至規(guī)定的濃度，滴加雙碟，培養(yǎng)，測量抑菌抗生素微生物比濁法10儀器與用具10.1操作室要求同管低法10.2分光光度計應有數字顯示功能和自動記錄裝置，數顯精度應在小數點后三位。10.3玻璃大試管20.5mm×2.5mm或適宜的試管，應大小一致，厚薄均勻，玻璃質地相同，使用同一品牌和批號。使用過的試管經滅菌后，將培養(yǎng)基傾出，用水清洗，瀝干，再用硫酸－重鉻酸鉀洗液浸泡，清水沖洗干凈后，晾干，在16010.4移液管10ml或20ml刻度容量，管口需磨粗（大），以便快速分裝培養(yǎng)基。10.5恒溫水浴箱工作體積600mm×300mmmm×150mm（長×寬10.6電動攪拌器將二臺電動攪拌器的槳葉置于恒溫水浴的大試管隨機區(qū)組培養(yǎng)方列的兩側，于水中攪動，以使水溫均勻。本身帶有攪拌或循環(huán)水系統(tǒng)的恒溫水浴箱，可不再配備電動攪拌器。10.7分光光度計用吸收池方形玻璃吸收池或石英吸收池，透光面1cm，用硝酸－硫酸混合液（取濃硫酸95ml，加濃硝酸3～5ml，混10.8其他分析天平、稱量瓶、量瓶、25ml及50ml滴定管、秒表、濾紙及鏡頭紙等。11試管除同管碟法的要求外，比濁法用的緩沖液應澄清無色，緩沖液配制后用垂熔玻璃漏斗濾過，除去沉淀等不溶物，使溶液澄清。使用前滅菌。12培養(yǎng)基除同管碟法的要求外，比濁法使用的培養(yǎng)基應澄清，顏色以盡量淺為佳，培養(yǎng)后培養(yǎng)基本身不得出現渾濁。培養(yǎng)基經滅菌后不得發(fā)生沉淀。根據這一原則，通過對培養(yǎng)基原材料的預試，挑選合適品牌廠家的產品使用。目前，已有一些種類的市售干燥培養(yǎng)基，如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基等，使用方便。13試驗用菌液13.1金黃色葡萄球菌（Staphylococusaureus）懸液取金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在35～37℃13.2大腸桿菌（Eschehchiacoli）懸液取大腸桿菌[CMCC（B）44103]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在35～37℃13.3白色念珠菌（Candidaalbicans）懸液取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的改良馬丁瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，接種于10ml培養(yǎng)基Ⅸ（中國藥典2005年版二部附錄ⅪA抗生素微生物檢定法）中，在35～37℃培養(yǎng)8小時，再用培養(yǎng)基Ⅸ14操作方法14.1稱量要求同管碟法。14.2稀釋標準品與供試品溶液的稀釋應使用經標定的量瓶，每步稀釋的量取量以不少于2ml為宜，稀釋步驟一般不超過3步。14.3標準曲線法14.3.1標準品溶液按中國藥典該品種含量測定項下的要求，制成一定濃度的標準品貯備液。在該品種項下規(guī)定的劑量反應線性范圍內，以線性濃度范圍的中間值作為中間濃度，標準品溶液選擇5個劑量，劑量間的比例應適宜（通常為1:1.25或更?。?。14.3.2供試品溶液根據估計效價或標示量，取供試品按標準品溶液的制備方法，選擇中間濃度，不少于3個試管。14.3.3含試驗菌液體培養(yǎng)基的制備臨用前，取規(guī)定的試驗菌懸液適量（35～3714.3.4線性試驗取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，再各個試管內分別精密加入各個濃度的標準品和供試品溶液各1.0ml，再精密加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即混勻，按隨機區(qū)組分配將各個試驗管放置于恒溫水浴內，在規(guī)定的條件下培養(yǎng)（通常約4小時）至適宜測量的濁度值（吸光度值）。各濃度不少于4個試管。14.4平行線測定法（二劑量（2.2）和三劑量（3.3）法）14.4.1標準品溶液按中國藥典該品種含量測定項下的要求，制成一定濃度的標準品貯備液。在該品種項下規(guī)定的劑量反應線性范圍內，選擇2個或3個劑量，劑量間的比例應適宜（二劑量通常為2:1或4:1，三劑量通常為1:0.8）。14.4.2供試品溶液根據估計效價或標示量，取供試品按標準品溶液的制備方法，選擇2個或3個劑量。14.4.3含試驗菌液體培養(yǎng)基的制備同14.3.3配制方法。14.4.4標準品及樣品測定取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，在各個試管內分別精密加入2個或3個濃度的標準品和供試品溶液各1.0ml，再精密加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即混勻，按隨機區(qū)組分配將各管在規(guī)定條件下培養(yǎng)至適宜測量的濁度值（通常約為4小時）。各濃度不少于4個試管。14.5空白試驗另取2支試管各加入藥品稀釋劑1.0ml，再分別加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，其中在一支試管中立即加入12%甲醛溶液0.5ml