化驗技術協(xié)會第八期培訓資料2

****************************************化驗技術協(xié)會第八期培訓資料（微生物檢定工）****************************************************無菌檢查法法無無菌檢查查是檢查查要求無無菌的藥藥品、醫(yī)醫(yī)療器具具、原料料、輔料料及要求求無菌的的其他物物品是否否染有活活菌的一一種方法法。事實實上，若若供試品品符合無無菌檢查查法的規(guī)規(guī)定，僅僅表明了了供試品品在該檢檢驗條件件下未發(fā)發(fā)現(xiàn)細菌菌和真菌菌污染。無無菌檢查查法有薄薄膜過濾濾法、直直接接種種法兩種種方式。細細菌培養(yǎng)養(yǎng)溫度332.55℃±2.5℃，真菌菌培養(yǎng)溫溫度255.5℃±2.5℃。1無菌檢查查的環(huán)境境無菌檢查的的所有操操作均需需在嚴格格控制微微生物污污染的環(huán)環(huán)境下進進行，操操作環(huán)境境的無菌菌保證程程度將直接影影響無菌菌檢查結結果，為為了保證證無菌檢檢查用潔潔凈室((區(qū))環(huán)環(huán)境的穩(wěn)穩(wěn)定性，確確保檢查查結果的的可靠性性，對潔潔凈室((區(qū))的的環(huán)境質質量采取取合理的的控制措措施和評評價方法法是必要要的。無無菌檢查查應在環(huán)環(huán)境潔凈凈度1000000級和局局部潔凈凈度1000級的的單向流流空氣區(qū)區(qū)域內或或隔離系系統(tǒng)中進進行，其其全過程程必須嚴嚴格遵守守無菌操操作，防防止微生生物污染染。單向向流空氣氣區(qū)、工工作臺面面及環(huán)境境應定期期按《醫(yī)醫(yī)藥工業(yè)業(yè)潔凈室室(區(qū)))懸浮粒粒子、浮浮游菌和和沉降菌菌的測試試方法》的的現(xiàn)行國國家標準準進行潔潔凈度驗驗證。隔隔離系統(tǒng)統(tǒng)按相關關的要求求進行驗驗證，其其內部環(huán)環(huán)境的潔潔凈度須須符合無無菌檢查查的要求求。無無菌室應應采光良良好、避避免潮濕濕、遠離離廁所及及污染區(qū)區(qū)。面積積一般不不超過llOm22，不小小于5mm2,高度不超超過2..4m。由由1～22個緩沖沖間、操操作間組組成(操操作間和和緩沖間間的門不不應直對對)，操操作間與與緩沖間間之間應應具備滅滅菌功能能的樣品品傳遞箱箱。在緩緩沖間內內應有洗洗手盆、毛毛巾、無無菌衣褲褲放置架架及掛鉤鉤、拖鞋鞋等，不不應放置置培養(yǎng)箱箱和其他他雜物；；無菌室室內應六六面光滑滑平整，能能耐受清清洗消毒毒。墻壁壁與地面面、天花花板連接接處應呈呈凹弧形形，無縫縫隙，不不留死角角。操作作間內不不應安裝裝下水道道。無無菌操作作室應具具有空氣氣除菌過過濾的單單向流空空氣裝置置，操作作區(qū)潔凈凈度1000級或或放置同同等級別的超凈工工作臺，室室內溫度度控制118～226℃，相對對濕度445％～～65％％。緩沖沖間及操操作室內內均應設置能達到到空氣消消毒效果果的紫外外燈或其其他適宜宜的消毒毒裝置，空空氣潔凈凈級別不不同的相相鄰房間間之間的的靜壓差差應大于于5Paa，潔凈凈室(區(qū)區(qū))與室室外大氣氣的靜壓壓差大于于lOPPa。無無菌室內內的照明明燈應嵌嵌裝在天天花板內內，室內內光照應應分布均均勻，光光照度不不低于3300llx。緩緩沖間和和操作間間所設置置的紫外外線殺菌菌燈(22～2..5W／／m3)，應應定期檢檢查輻射射強度，要要求在操操作面上上達400μW·cm-22。不符符合要求求的紫外外殺菌燈燈應及時時更換。無無菌室應應每周和和每次操操作前用用0.1％％新潔爾爾滅或22％甲酚酚液或其其他適宜宜消毒液液擦拭操操作臺及可能污污染的死死角，開開啟無菌菌空氣過過濾器及及紫外燈燈殺菌11小時。在在每次操操作完畢畢，同樣樣用上述消毒溶溶液擦拭拭工作臺臺面，除除去室內內濕氣，用用紫外燈燈殺菌半半小時。無菌室的潔潔凈度檢檢查無菌菌室在消消毒處理理后，無無菌試驗驗前及操操作過程程中需檢檢查空氣氣中菌落落數(shù)，以以此來判判斷無菌菌室是否否達到規(guī)規(guī)定的潔潔凈度，常常有沉降降菌和浮浮游菌測測定方法法。沉降菌檢測測方法及及標準以以無菌方方式將33個營養(yǎng)養(yǎng)瓊脂平平板帶入入無菌操操作室，在在操作區(qū)區(qū)臺面左左、中、右右各放11個；打打開碟蓋蓋扣置，平平板在空空氣中暴暴露300分鐘后后將碟蓋蓋蓋好，置置32．．5℃±±2.5℃培養(yǎng)448小時時，取出出檢查，33個平板板上生長長的菌落落數(shù)平均均不超過過1個。浮游菌檢測測方法及及標準用用專門的的采樣器器，宜采采用撞擊擊法機理理的采樣樣器，一一般采用用狹縫式或離心式式采樣器器，并配配有流量量計和定定時器，嚴嚴格按儀儀器說明明書的要要求操作作并定期期校驗，采采樣器和和培養(yǎng)皿皿進入被被測房間間前先用用消毒房房間的消消毒劑滅滅菌，使使用的培培養(yǎng)基為為營養(yǎng)瓊瓊脂培養(yǎng)養(yǎng)基或藥藥典認可可的其它它培養(yǎng)基基。使用用時，先先開動真真空泵抽抽氣，時時間不少少于5分分鐘，調調節(jié)流量量、轉盤盤、轉速速。關閉閉真空泵泵，放入入培養(yǎng)皿皿，蓋上上采樣器器蓋子后后調節(jié)縫縫隙高度度。置采采樣口于于采樣點點后，依依次開啟啟采樣器器、真空空泵，轉轉動定時時器，根根據(jù)采樣樣量設定定采樣時時間。全全部采樣樣結束后后，將培培養(yǎng)皿置置32..5±2.5℃培養(yǎng)448小時時，取出出檢查，浮浮游菌落落數(shù)平均均不得過過5個／／m3。每批培養(yǎng)基基應選定定3只培培養(yǎng)皿做做對照培培養(yǎng)。無菌菌操作臺臺面或超超凈工作作臺還應應定期請請有關部部門檢測測其懸浮浮粒子，應應達到llOO級級(一般般用塵埃粒子子計數(shù)儀儀)檢測測塵埃粒粒徑≥0.5μm的粒粒數(shù)不得得超過33.5個／／升，≥≥5μm的粒粒數(shù)為00,空氣氣流速應應≥0.355m／ss，可根根據(jù)無菌菌狀況必必要時置置換過濾濾器。2儀器器及用具具22.1無菌菌室內應應準備好好盛有消消毒用55％甲酚酚或其他他適宜消消毒溶液液的玻璃璃缸、乙乙醇燈、火柴、鑷子子、755％乙醇醇棉、碘碘伏棉等等。恒溫培培養(yǎng)箱及及生化培培養(yǎng)箱。離心機、生生物顯微微鏡、真真空架、高高壓蒸汽汽滅菌器器、標準準pH比比色器((0.02％％酚磺酞酞指示液和溴溴麝香草草酚藍指指示液))、恒溫溫烤箱、開開放或全全封閉過過濾系統(tǒng)統(tǒng)。2.4玻璃器器皿試管、量量筒、三三角瓶、移移液管、刻刻度吸管管(1、55、100ml)、注注射器((2、55、lOml))、雙碟碟等，用用玻璃洗洗滌劑或或清潔液液浸泡，水水洗3次次。如使使用過程程中與細細菌接觸觸(已污污染)，應應先滅菌菌倒出內內容物后后再清洗洗，晾干干。凡無無菌操作作過程中中所用的的器皿，都都應用牛牛皮紙包包扎嚴密密，滅菌菌。移液液管、刻刻度吸管管在管內內上端，塞塞少許原原棉，以以手感不不松不緊緊為宜，然然后放于于吸管筒筒內或牛牛皮紙袋袋內，封封嚴，滅滅菌待用用；試管管、離心心管、三三角瓶等等在管((瓶)口口塞上海海棉膠((或硅膠膠)專用用塞或紗紗布棉塞塞，塞子子應塞進進管口內內2/33處，用用牛皮紙紙將管口口(包括括塞子))包扎嚴嚴，滅菌菌待用；；將注射射器、針針頭(99號、111號、122號)配配對，檢檢查針頭頭是否暢暢通后，將將注射芯芯、管和和針頭分分別放在在雙層紗紗布(或或布)內內，包扎扎嚴密，置置帶蓋容容器(瓷瓷盤或鋁鋁制飯盒盒)內，蓋蓋嚴，用用牛皮紙紙包扎后后，滅菌菌待用。長長柄取樣樣匙，放放于不銹銹鋼長筒筒內，蓋蓋嚴，干干熱滅菌菌待用。手手術鑷、手手術剪洗洗凈、擦擦干。用用雙層紗紗布將11把剪刀刀與1把把鑷子間間隔包扎扎在一起起，放于于帶蓋的的容器（瓷瓷盒或鋁鋁制飯盒盒)內，蓋蓋嚴，用用牛皮紙紙包扎，滅滅菌(參參照附錄錄XV滅滅菌法))待用。高高壓蒸汽汽滅菌的的物品取取出時切切勿立即即置冷處處，避免免因急速速冷卻，使使滅菌物物品內蒸蒸汽冷凝凝造成負負壓，易易染菌，取取出后應應置恒溫溫培養(yǎng)箱箱(或干干燥箱))中烘干干，待用用。2.5無菌衣衣、褲、帽帽、口罩罩等洗凈凈晾干，配配套，用用牛皮紙紙包嚴，滅滅菌待用用或用一一次性的無菌物品品代替。22.6除菌菌濾器及及濾膜有多多種開放放式及封封閉式濾濾器用于于過濾除除菌。微微孔濾膜膜直徑550mmm、孔徑徑約0..45μm。新新購入封封閉式濾濾器或濾濾膜，需需進行孔孔徑大小小的測試試，一般般有三種種方法，其中一種方方法即可可。氣泡法先將濾濾膜浸入入水中，使使完全濕濕潤，然然后用鑷鑷子夾住住一片濾濾膜放于于氣泡點點測定裝裝置或濾濾膜孔徑徑測定儀儀上，膜膜上放一一塊與濾濾膜大小小相同的的尼龍篩篩網(wǎng)，再再加上多多孔板，將將螺旋固固定圈旋旋緊，在在多扎板板上加33～5mmm深的的水(注注意排除除氣泡))關閉放放氣閥，啟啟動空壓壓機或氮氮氣瓶閥閥，使壓壓力緩緩緩上升，注注意觀察察水面上上產生第第一個氣氣泡時，記記錄壓力力表的壓壓力，氣氣泡點壓壓力不應應小于22.2kkg/ccm2(0.2MPPa)。水流量法將濾濾膜裝于于除菌濾濾器上，開開動真空空泵，壓壓力在7700mmmHgg(933kPaa)下，抽抽濾已濾清的水約約5000ml，計算算出每llminn的濾速速。20005年年版中國國藥典對對濾膜的的濾速未未明確規(guī)規(guī)定，而而USPP規(guī)定在在7000mmHHg(993kPPa)壓壓力下，濾濾膜直徑徑47mmm；流流速555～755ml／／minn。細菌過濾法法常常用的細細菌為粘粘質沙雷雷氏菌，將將該菌的的新鮮營營養(yǎng)瓊脂脂斜面培培養(yǎng)物，接接種于營養(yǎng)肉湯培培養(yǎng)基中中，322.5±2.5℃，培養(yǎng)養(yǎng)18——20小小時，用用0.9％無無菌氯化化鈉溶液液稀釋至至10--3((約相當當于7××1055cfuu／m11)，取取此菌液液1mll加至550mll0..9％無無菌氯化化鈉溶液液中，按按薄膜過過濾法過過濾，取取該濾液液5mll接種于于營養(yǎng)肉肉湯培養(yǎng)養(yǎng)基400ml中中，322.5±2.5℃培養(yǎng)244小時,應無菌菌生長。不不符合規(guī)規(guī)定的濾濾膜不得得使用。3菌種種及菌液液制備菌種的傳代代次數(shù)不不得超過過5代((從菌種種保藏中中心獲得得的冷凍凍干燥的的菌種為為第0代；冷冷凍干燥燥的原始始菌種開開啟后轉轉種，為為第一代代)。原始菌種購購到后，應應由專人人負責，接接收菌種種時應檢檢查安瓿瓿的數(shù)量量和菌種種的名稱稱及每一一支安瓿的完整整性。并并在相應應的菌種種接收登登記表上上記錄所所有關于于菌種的的信息。將將安瓿存存于-220℃，使用用時首先先需要復復活凍干干菌種((按菌種種保藏中中心提供供相關資資料操作作)，一一般包括括以下步步驟：冷凍菌種的的復活清潔潔安瓿((可用775％的的酒精或或碘伏))后，用用砂輪在在安瓿上上部三分分之一處劃痕，用用干燥的的無菌紗紗布包裹裹安瓿，將將安瓿掰掰開，用用一無菌菌吸管吸吸取適量量0.5～0..8ml的液體體培養(yǎng)基基(生孢孢梭菌用用液體硫硫乙醇酸酸鹽培養(yǎng)養(yǎng)基；金金黃色葡葡萄球菌菌、大腸腸埃希菌菌、銅綠綠假單胞胞菌和枯枯草芽孢孢桿菌用用營養(yǎng)肉肉湯；白白色念珠珠菌、黑黑曲霉菌菌用液體體真菌培培養(yǎng)基))滴加到到安瓿中中，輕輕輕旋轉安安瓿并吹吹打，使使凍干菌菌種和液液體培養(yǎng)養(yǎng)基充分分混和并并完全溶溶解，再再將安瓿瓿內的菌菌懸液全全部吸出出，轉移移至相應應的培養(yǎng)養(yǎng)基試管管中，根根據(jù)菌種種類型采采用適宜宜的培養(yǎng)養(yǎng)條件((細菌培培養(yǎng)溫度度32..5℃±2.5℃，188～244小時；；真菌培培養(yǎng)溫度度25..5℃±2.5℃，3～～5天))下培養(yǎng)養(yǎng)，觀察察培養(yǎng)基基是否渾渾濁，((如不渾渾濁，細細菌應延延長培養(yǎng)養(yǎng)時間至至7天以以上，真真菌應延延長培養(yǎng)養(yǎng)時間至至14天天以上，仍仍未渾濁濁，按相相關規(guī)定定滅菌處處理。))渾濁說說明菌種種復活生生長，在在應用前前，還應應確認菌菌種的純純度和特特性。菌種確認用無無菌接種種環(huán)取上上述培養(yǎng)養(yǎng)物，在在相應的的培養(yǎng)基基平板上上劃線分分離單個個菌落，適適宜條件下培培養(yǎng)。培培養(yǎng)后觀觀察是否否具有典典型的菌菌落形態(tài)態(tài)，然后后挑取單單一的純純菌落，進進行革蘭蘭染色、鏡鏡檢，觀觀察其染染色特性性及菌形形。并作作生化實實驗或使使用菌種種鑒定系系統(tǒng)進一一步鑒定定該菌種種。對已已通過確確認鑒定定后的菌菌種可以以使用或或傳代保保藏。菌種傳代保保藏方法法很多，各各單位可可根據(jù)情情況采用用，但無無論應用用何種方方法，都都應對采采用的方法進行驗驗證，確確保在相相應保存存條件下下的菌種種不會變變異且性性能穩(wěn)定定，同時時也應兼兼顧到方方法的經(jīng)經(jīng)濟和簡簡便。常常用的有有甘油冷冷凍管保保藏法、斜斜面低溫溫保藏法法等，此此類方法法簡單易易行。甘油冷凍管管保藏法法將將待保藏藏菌接種種平板或或瓊脂斜斜面，適適宜溫度度下培養(yǎng)養(yǎng)適宜時時間后((細菌24～448小時時的培養(yǎng)養(yǎng)物，白白色念珠珠菌722小時的的培養(yǎng)物物)，用用無菌接接種環(huán)輕輕輕刮取取菌苔，并并通過接接種環(huán)與與試管壁壁之間的的輕輕摩摩擦使細細菌充分分擴散到到預先裝裝于試管管中的無無菌蒸餾餾水中，調調整菌液液濃度，向向已制備備好的菌菌懸液中中加入等等體積、濃濃度為220％的的無菌甘甘油，輕輕輕振搖搖小管，使使內容物物充分混混和，分分裝于無無菌小管管，制好好的甘油油冷凍管管最好在在-300℃貯存。斜面低溫保保藏法將工工作用菌菌種的典典型菌落落接種在在適宜的的固體斜斜面培養(yǎng)養(yǎng)基，按按規(guī)定的的溫度和時間培培養(yǎng)，待待菌生長長充分以以后，把把培養(yǎng)好好的新鮮鮮菌種管管用牛皮皮紙包好好，轉移移至4℃℃左右冰冰箱保存存，如菌菌種保藏藏管的塞塞子是橡橡膠塞，并并采用半半固體高高層培養(yǎng)養(yǎng)基穿刺刺培養(yǎng)，則則可以保保存時間間較長。銅銅綠假單單胞菌不不宜用本本法保存存。3.1菌種(1)金黃黃色葡萄萄球菌((Staaphyyloccocccuauureuus)[[CMCCC(BB)2660033](2)枯草草芽孢桿桿菌(BBaciilluussuubtiiliss)[CCMCCC(B))635501]](3)大腸腸埃希菌菌(Esscheericchiaacolli)[[CMCCC(BB)4441022](4)銅綠綠假單胞胞菌(PPseuudommonaasaeerugginoosa))[CMMCC((B)1101004](5)生孢孢梭菌((Cloostrridiiumssporrogeeness)[CCMCCC(B))649941]](6)白色色念珠菌菌(Caandiidaaalbiicanns)[[CMCCC(FF)9880011](7)黑曲曲霉(AAspeergiilluusniigerr)[CCMCCC(F))980003]]3.2菌液制制備制備的菌液液，一般般當日使使用。取金黃色葡葡萄球菌菌、枯草草芽孢桿桿菌、大大腸埃希希菌、銅銅綠假單單胞菌的的新鮮培培養(yǎng)物少少許接種種至營養(yǎng)肉湯湯培養(yǎng)基基中，生生孢梭菌菌的新鮮鮮培養(yǎng)物物少許接接種至硫硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基中，332.5±2.55℃培養(yǎng)118～224小時時；白色色念珠菌菌的新鮮鮮培養(yǎng)物物接種至至改良馬馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基或改改良馬丁丁瓊脂培培養(yǎng)基中中，255.5℃±2.5℃培養(yǎng)224～448小時時，上述述培養(yǎng)物物用0..9％無無菌氯化化鈉溶液液制成每每毫升含含菌小于于1000菌落形形成單位位(cffu)的的菌懸液液。將黑曲霉菌菌斜面的的新鮮培培養(yǎng)物接接種至改改良馬丁丁瓊脂斜斜面培養(yǎng)養(yǎng)基上，225.5℃±2.5℃培養(yǎng)5～7天，使使大量的的孢子成成熟。加加入3～～5mll0.9％無無菌氯化化鈉溶液液，用玻玻棒或白白金餌輕輕輕振搖搖將孢子子洗脫。然然后，用用管口帶帶有能過過濾菌絲絲的裝置置(如薄薄層無菌菌棉花或或紗布的的無菌毛毛細吸管管)的吸吸管吸出出胞子懸懸液至無無菌試管管內，用用0.9％無無菌氯化化鈉溶液液將其稀稀釋至每每毫升含含小于1100ccfu的的孢子懸懸液(可可采用比比濁法))。以上菌液在在供試驗驗的同時時，金黃黃色葡萄萄球菌、銅銅綠假單單胞菌、大大腸埃希希菌、枯枯草芽孢孢桿菌用營養(yǎng)瓊瓊脂，白白色念球球菌和黑黑曲霉用用改良馬馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基注皿皿(1mm1)或或平板涂涂布(00.1m11)，按按規(guī)定條條件培養(yǎng)養(yǎng)后，計計數(shù)。4培養(yǎng)養(yǎng)基4.1一一般采用用商品脫脫水培養(yǎng)養(yǎng)基，臨臨用時按按照使用用說明書書進行配配制，配配制培養(yǎng)養(yǎng)基時稱稱量要迅速以免吸吸潮而影影響稱量量的準確確性，同同時為避避免增加加培養(yǎng)基基中的金金屬離子子及其他他微量化化學元素而影響微微生物的的生長、鑒鑒別、所所用器具具應為潔潔凈玻璃璃器皿，所所用溶解解用水為為純水。4.2培養(yǎng)基基的pHH值應符符合規(guī)定定，否則則必須校正。調調節(jié)pHH值：測測定pHH值的標標準溫度度為25℃±22℃，調節(jié)節(jié)pH值值可用無無菌的llmoll／L((1N))氫氧化化鈉或110％碳碳酸鈉溶溶液、llmoll／L鹽鹽酸溶液液或155%冰醋醋酸溶液液。分裝裝好的培培養(yǎng)基及及時密封封后必須須在配制制當天((2小時時內最佳佳)進行行滅菌處處理。4.3新鮮配配制的培培養(yǎng)基，應應按中國國藥典規(guī)規(guī)定的處處方，對對培養(yǎng)基基的原材材料要進進行挑選選，化學學藥品均均需用CCP試劑劑規(guī)格。4.3.11除葡葡萄糖和和指示液液外，將將處方中中各成分分加水后后置有石石棉網(wǎng)的的電爐、可可調電磁磁爐或其它適宜的的加熱設設備中，微微溫溶解解。用llmoll/L氫氫氧化鈉鈉溶液調調節(jié)pHH，使其其比規(guī)定定的pHH值略高高0.44～0.66，煮沸沸，用棉棉(紙))漿減壓壓抽濾或或以脫脂脂棉，濾濾紙等濾濾材過濾濾，使培培養(yǎng)基澄澄清。4.3.22加加入葡萄萄糖和指指示液，搖搖勻，補補足水量量，調節(jié)節(jié)pH值值(比規(guī)規(guī)定的ppH值略略高0..2～0.4)，使使滅菌后后為7..1±0.22，分裝裝，裝量量不宜超超過容器器的2／／3，以以免滅菌菌時溢出出。4.3.33硫硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基I，分分裝至適適宜的容容器中，其其裝量與與容器高高度的比比例應符合培養(yǎng)結結束后培培養(yǎng)基的的氧化層層(粉紅紅色)不不超過培培養(yǎng)基深深度的11／2，滅滅菌。在在供試品品接種前前，培養(yǎng)養(yǎng)基氧化化層的顏顏色不得得超過培培養(yǎng)基深深度的ll／5，否否則，須須經(jīng)1000℃水浴或或流通蒸蒸汽加熱熱至粉紅紅色消失失(不超超過200分鐘))，迅速速冷卻。培培養(yǎng)基只只限加熱熱一次，并并防止被被污染。4.3.44滅滅菌應采采用驗證證合格的的滅菌程程序進行行。培養(yǎng)養(yǎng)基應只只能進行行一次蒸蒸汽滅菌菌處理。固體培養(yǎng)基基使用前前的融化化，不宜宜使用蒸蒸汽滅菌菌柜融化化瓊脂培培養(yǎng)基，宜宜選用沸沸水浴融融化培養(yǎng)養(yǎng)基。4.4未開封封脫水培培養(yǎng)基應應避光儲儲存于225℃以下陰陰涼干燥燥處，已已開封的的脫水培培養(yǎng)基應應蓋緊，避光儲儲存于225℃以下陰陰涼干燥燥處。制制備好的的培養(yǎng)基基應保存存在2～～25℃℃避光的的環(huán)境，有有條件置置冰箱44℃～8℃冷藏儲儲存較好好。培養(yǎng)養(yǎng)基若保保存于非非密閉容容器中，應應在三周周內使用用；若保保存于密密閉容器器中，可可在一年年內使用用。44.5培養(yǎng)養(yǎng)基的裝裝量對于采用直直接接種種法檢查查的液體體樣品，培培養(yǎng)基的的裝量與與供試品品的裝量量相關，供供試品的裝量量小于220mll的樣品品，培養(yǎng)養(yǎng)基裝量量15mml；供供試品的的裝量大大于或等等于200ml小于550mll的樣品品，培養(yǎng)養(yǎng)基裝量量40mml；供試試品的裝裝量大于于或等于于50mml小于于1000ml的樣品品，培養(yǎng)養(yǎng)基裝量量80mml；4.5.22對對于采用用直接接接種法檢檢查的固固體樣品品(含藥藥品及外外科用輔輔料棉花花及紗布布)，培培養(yǎng)基的裝量均均為1000mll；對于于縫合線線、一次次性醫(yī)用用材料及及醫(yī)療器器具，如如果醫(yī)療療器具體體積過大大，培養(yǎng)養(yǎng)基的裝裝量可在在20000mll以上，以以將其完完全浸沒沒為準。4.5.33對對于采用用薄膜過過濾法檢檢查的樣樣品，若若用封閉閉式薄膜膜濾器操操作的，培培養(yǎng)基裝裝量100mll；若用用開放式式薄膜濾濾器操作作的，培培養(yǎng)基裝裝量500ml。4.6培養(yǎng)基基的適用用性檢查查培養(yǎng)基的檢檢查包括括無菌檢檢查和靈靈敏度檢檢查；符符合規(guī)定定者方可可用于供供試品的的無菌檢檢查。培養(yǎng)基的無無菌檢查查可在供供試品的的無菌檢檢查前或或與供試試品的無無菌檢查查同時進進行，但但是所用用培養(yǎng)基不符符合無菌菌要求，供供試品的的無菌檢檢查結果果應視為為無效。培養(yǎng)基的靈靈敏度檢檢查應對對購進的的每個批批號的脫脫水培養(yǎng)養(yǎng)基進行行靈敏度度檢查，檢檢查合格格后方可使用，但但當培養(yǎng)養(yǎng)基的配配制方法法和滅菌菌程序發(fā)發(fā)生變更更時，應應再次對對培養(yǎng)基基的靈敏敏度進行行檢查。4.6.11培培養(yǎng)基無無菌檢查查的操作作及結果果判定每批培養(yǎng)基基隨機取取不少于于5支((瓶)，按按規(guī)定溫溫度培養(yǎng)養(yǎng)14天天，應無無菌生長長。4.6.22培培養(yǎng)基靈靈敏度檢檢查的操操作及結結果判定定取每管裝量量為122ml的的硫乙醇醇酸鹽流流體培養(yǎng)養(yǎng)基9支支，分別別接種金金黃色葡葡萄球菌菌、銅綠綠假單胞菌、枯枯草芽孢孢桿菌、生生孢梭菌菌各2支支，每支支接種菌菌量為llml((含菌小小于1000cffu)，另另1支不不接種作作為空白白對照，培培養(yǎng)3天天；取每每管裝量量為9mml的改改良馬丁丁培養(yǎng)基基5支，分分別接種種白色念念珠菌、黑黑曲霉各各2支，每每支接種種菌量為為lmll(含菌菌小于1100ccfu))，另11支不接接種作為為空白對對照，培培養(yǎng)5天天，逐日日觀察結結果?？湛瞻讓φ照展軕獰o無菌生長長，若加加菌的培培養(yǎng)基管管均生長長良好，判判該培養(yǎng)養(yǎng)基的靈靈敏度檢檢查符合合規(guī)定。對于配制后后的選擇擇性培養(yǎng)養(yǎng)基的靈靈敏度檢檢查試驗驗同上。5方法法驗證試試驗為保證檢驗驗質量，對對所用的的檢驗方方法必須須經(jīng)過驗驗證，才才能確保保檢驗結結果的準準確可靠靠。當建立藥品的的無菌檢檢查法時時，應進進行方法法的驗證證，以確確認供試試品在該該實驗條條件下無無抑菌活活性或其其抑菌活活性可以以忽略不不計。若若供試品品的生產產工藝，原原、輔料料組分或或檢驗條條件發(fā)生生改變時時，檢查查方法應應進行重重新驗證證。針對藥品的的無菌檢檢查試驗驗，在確確定產品品的無菌菌檢查試試驗方法法時或建建立新的的檢查方方法時，或當試驗條條件(包包括培養(yǎng)養(yǎng)條件))發(fā)生變變更時，都都必須要要對新的的或變更更后的檢檢驗方法法加以驗驗證，以以確認供供試品在在該實驗驗條件下下無抑菌菌活性或或其抑菌菌活性可可以忽略略不計。確確保在實實際檢驗驗條件下下，該供供試品的的無菌檢檢查法的的準確性性、有效效性和重重現(xiàn)性。驗驗證時，按按“供試品品的無菌菌檢查”的規(guī)定定及下列列要求進進行操作作試驗。供供試品對對每一試試驗菌的的抑菌活活性應逐逐一進行行驗證。驗證用菌種種、菌液液制備、各各試驗菌菌所對應應的培養(yǎng)養(yǎng)基及培培養(yǎng)溫度度、參見見3.1及33.2部分分。5.1薄膜過過濾法驗驗證試驗驗將規(guī)定量的的供試品品按薄膜膜過濾法法過濾，沖沖洗，在在最后一一次的沖沖洗液中中加入試試驗菌少少于100CFFU。取取出濾膜膜接種至至相應的的培養(yǎng)基基中，或或將培養(yǎng)養(yǎng)基直接接加至濾濾筒內。另另取一濾濾筒，不不過濾供供試品，其其它操作作同上，作作為陽性性對照，將將含培養(yǎng)養(yǎng)基的容容器按規(guī)規(guī)定溫度度培養(yǎng)33～5天天。各試試驗菌及及相應的的培養(yǎng)基基逐一進進行驗證證。5.2直接接接種法驗驗證試驗驗取適宜裝量量的硫乙乙醇酸鹽鹽流體培培養(yǎng)基88管，分分別加入入金黃色色葡萄球球菌、枯枯草芽孢孢桿菌、銅綠假單胞胞菌、生生孢梭菌菌的菌液液各兩管管；取適適宜裝量量的改良良馬丁培培養(yǎng)基44管，分分別加入入白色念念珠菌、黑黑曲霉菌菌菌液各各兩管。每每管加菌菌量小于于1000cfuu。其中中1管接接入規(guī)定定量的供供試品，另另1管作作為陽性性對照，各各試驗管管按相應應規(guī)定的的溫度培培養(yǎng)3～～5天。5.3判斷與陽性對照照比較，如如含供試試品各容容器中的的試驗菌菌均生長長良好，并并且與陽陽性對照照容器內內的培養(yǎng)結果相相似，則則供試品品的該檢檢驗量在在該檢驗驗條件下下無抑菌菌作用或或抑菌作作用消除除，供試試品可按按該法進進行無菌菌檢查。若若含供試試品的任任一容器器中微生生物生長長微弱、緩緩慢或不不生長，則則供試品品的該檢檢驗量在在該檢驗驗條件下下有抑菌菌作用，若若采用的的是直接接接種法法，可根根據(jù)實際際情況增增加培養(yǎng)養(yǎng)基的用用量、在在沖洗液液中或培培養(yǎng)基中中使用中中和劑((如β-內酰酰胺酶、對對氨基苯苯甲酸、聚聚山梨脂脂80))、或改改為薄膜膜過濾法法。若采采用的是是薄膜過過濾法，可可采用增增加沖洗洗液的用用量、改改變沖洗洗液的種種類、更更換濾膜膜品種等等方法消消除供試試品的抑抑菌作用用。并重重新進行行驗證試試驗。已已進行過過無菌檢檢查法方方法驗證證試驗的的供試品品，按此此法進行行無菌檢檢查。66供試試品的無無菌檢查查66.1檢驗數(shù)數(shù)量及檢檢驗量檢驗數(shù)量是是指一次次試驗所所用供試試品最小小包裝的的數(shù)量。除除另有規(guī)規(guī)定外，出出廠產品品應盡量量抽取批批生產開開始和結結束或生生產過程程出現(xiàn)異異常情況況下的產產品進行行檢驗；；一般情情況下，供供試品無無菌檢查查若采用用薄膜過過濾，應應增加11/2的的最小檢檢驗數(shù)量量作陽性性對照用用；若采采用直接接接種法法，應增增加供試試品1支支(或瓶瓶)作陽陽性對照照用。檢驗量是指指一次試試驗所用用的供試試品總量量(g或ml)。采用用直接接接種法時時，若每每支(瓶瓶)供試試品的裝裝量按規(guī)規(guī)定足夠夠接種兩兩份培養(yǎng)養(yǎng)基，則則應分別別接種硫硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基和改良良馬丁培培養(yǎng)基。采采用薄膜膜過濾法法時，檢檢驗量應應不少于于直接接接種法的的總接種種量，只只要供試試品特性性允許，應應將所有有容器內內的全部部內容物物過濾。66.2培養(yǎng)養(yǎng)基用量量除除另有規(guī)規(guī)定外，供供試品無無菌檢查查時，每每支培養(yǎng)養(yǎng)基的實實際裝量量及所占占容器高高度的比比例應與與“驗證試試驗”所用的的培養(yǎng)基基相同。66.3陽性對對照供供試品無無菌檢查查應進行行陽性對對照試驗驗。陽性性對照菌菌的選擇擇原則：：應根據(jù)據(jù)驗證試試驗結果果選擇相相應對照照菌，陽陽性對照照管的加加菌量為為小于1100個個cfu。陽陽性對照照管培養(yǎng)養(yǎng)48～～72小小時，應應生長良良好。6.4陰陰性對照照凡凡無菌檢檢查，均均應取相相應溶劑劑和稀釋釋劑同法法操作作作為陰性性對照。陰陰性對照照不得有有菌生長長。66.5無菌菌檢查操操作無無菌檢查查法包括括薄膜過過濾法和和直接接接種法。只只要供試試品性狀狀允許，應應采用薄薄膜過濾濾法。66.5.1供試品品在移入入緩沖間間前應除除去外包包裝、消消毒外表表面并編編號，培培養(yǎng)基管管(瓶))用0..1%新潔爾滅滅或酒精精棉擦拭拭瓶(管管)外壁壁，然后后連同其其他用具具(包括括無菌衣衣、帽、口口罩等))移入緩緩沖間，開開啟操作作間紫外外燈和空空氣過濾濾裝置并并使其工工作1小小時以上上。66.5.2操作人人員用肥肥皂、水水清洗雙雙手，關關閉紫外外光燈，進進入緩沖沖間，換換拖鞋，再再用755％乙醇醇棉球擦擦手，穿穿戴衣、帽帽、口罩罩、手套套。將所所需物品品剝去牛牛皮紙，移移入無菌菌間，每每次試驗驗中所用用物品必必須計劃劃好，并并有備用用物。66.5.3供試品品外部消消毒6.5..3.1將消毒毒過的粉粉針劑、油油劑等鋁鋁蓋壓封封的橡皮皮塞小瓶瓶，先用用75％％乙醇或或碘伏棉棉球擦拭拭外壁及及瓶塞，待待干，用用滅菌鑷鑷子剔去去鋁蓋上上的鋁質質小圓片片，過火火焰數(shù)次次。將消毒過的的安瓿針針劑先用用碘酒棉棉球或碘碘伏棉球球將安瓿瓿外部擦擦拭滅菌菌，待干干，用砂輪或滅菌菌銼輕割割安瓿頸頸部（便便于折開開安瓿），再再用755%乙醇醇棉球將將磺酒擦擦凈，待待干。6.5.33.3其他供供試品容容器表面面或外包包裝，可可參照上上述用適適當消毒毒液擦拭拭或浸沒沒后以無無菌的方方式取內內容物。6.5.44供試試品制備備用滅菌鑷取取出注射射器，在在火焰旁旁將針芯芯插入針針管并安安上針頭頭，供試試品瓶蓋蓋和注射射器針頭頭均應迅迅速通過過火焰數(shù)數(shù)次；當當供試品品為粉針針劑，瓶瓶蓋為橡橡膠塞時時，用注注射器吸吸取規(guī)定定的溶劑劑，在已已消毒好好的橡膠膠塞中心心位置刺刺入小瓶瓶加入溶溶劑，溶溶解，混混勻后吸吸出溶液液，或選選用其它它適宜的的方法。如如為注射射液、供供角膜創(chuàng)創(chuàng)傷及手手術用的的滴眼劑劑或滅菌菌溶液可可直接用用注射器器吸取藥藥液，或或選用其其它適宜宜的方法法。按規(guī)規(guī)定或需需滅活的的供試品品可用滅滅活劑溶溶解，將將瓶內供供試液抽抽出稀釋釋至規(guī)定定的濃度度。需加加入空氣氣加壓后后便于抽抽出的供供試品，應應用注射射器對著著火焰抽抽取空氣氣加入，抽抽取瓶中中液體時時，應將將供試品品倒置并并使針頭頭在液面面下。供供試品如如為直接接分裝成成注射用用無菌粉粉末的原原料藥（大大包裝粉粉針劑），取取樣時為為縮短暴暴露時間間，應由由兩人操操作。將將放置于于緩沖間間的包裝裝瓶用00.1%%新潔爾爾滅抹凈凈外壁，且且經(jīng)紫外外線照射射1小時時后移入入操作間間（臺），除除去鋁蓋蓋，用775%乙乙醇棉或或碘伏棉棉球擦拭拭瓶口橡橡膠塞外外壁和瓶瓶口縫隙隙，待干干，戴好好醫(yī)用消消毒手套套，在火火焰旁小小心揭開開瓶塞，用用專用取取樣器取取出規(guī)定定量的樣樣品，置置滅菌試試管中，密密塞待用用，立即即蓋好大大包裝瓶瓶塞，用用橡皮膠膠布及時封封口，再再用封箱箱紙包扎扎瓶口。如如果容器器內有一一定的真真空，可可用適當當?shù)臒o菌菌器材（如如一端帶帶有除菌菌過濾器器的針頭頭），向向供試品品容器內內導入無無菌空氣氣，再按按無菌操操作開啟啟容器取取出內容容物。供試品處理理時所用用的溶劑劑、乳化化劑、分分散劑、中中和劑及及其用量量應驗證證是有效效的，并并對微生生物生長長無影響響。除另有規(guī)定定外，供供試品處處理及接接種，按按下列方方法進行行。6.5.55薄膜膜過濾法法無菌檢查用用的濾膜膜孔徑為為不大于于0.445μm，直徑徑約為550mmm。應根根據(jù)供試試品及其其溶劑的的特性選選擇濾膜膜材質，如如抑菌性性供試品品采用低低吸附性性的濾膜膜，油性性供試品品選用疏疏水性濾濾膜。水水溶性供供試液過過濾前先先將少量量的沖洗洗液過濾濾以潤濕濕濾膜。油油類供試試品，其其濾膜和和過濾器器在使用用前應充充分干燥燥。使用用時，應應保證濾濾膜在過過濾前后后的完整整性。同同時每片片濾膜的的總過濾濾量不宜宜太大，以以避免濾濾膜上的的微生物物受損傷傷。薄膜過濾法法采用封封閉式薄薄膜過濾濾器或開開放式薄薄膜過濾濾器，可可優(yōu)先選選用封閉閉式薄膜膜過濾器器。如采采用封閉閉式過濾濾器時，將將一次性性集菌培培養(yǎng)器（依依供試品品種類不不同選擇擇適宜的的集菌培培養(yǎng)器如如抗生素素類采用用抗生素素專用集集菌培養(yǎng)養(yǎng)器）放放于電控控集菌儀儀的排液液槽上，培培養(yǎng)器的的塑膠軟軟導管放放于電控控集菌儀儀的蠕動動泵的管管槽內，其其進液導導管的雙雙芯針頭頭，插入入供試液液或沖洗洗液等容容器的塞塞上。6.5.55.1操作作打開待檢樣樣品的鋁鋁蓋，復復溶。吸吸取適量量藥液加加入0..9%無無菌氯化化鈉溶液液或其他他適宜的的溶液至至具塞的的瓶中，混混勻。如如采用封封閉式過過濾器，取取出培養(yǎng)養(yǎng)器先檢檢查包裝裝是否完完好無損損，將培培養(yǎng)器逐逐個插放放在不銹銹鋼座上，將將培養(yǎng)器器的彈性性軟管裝裝入集菌菌儀泵頭頭，注意意定位準準確，軟軟管走勢勢順暢。將將培養(yǎng)器器導管上上的針頭頭插至供供試液容容器塞上上，開動動電控集集菌儀電電源，將將樣品瓶瓶倒置固固定于支支架上，使使藥液均均勻通過過集菌培培養(yǎng)器，待待藥液排排盡，關關閉電源源，將針針頭取下下，插至至裝有適適宜沖洗洗液的瓶瓶塞內，沖沖洗集菌菌培養(yǎng)器器的濾膜膜，照上上述操作作要求，沖沖洗次數(shù)數(shù)及沖洗洗量與驗驗證試驗驗保持一一致。濾濾干，關關閉電源源。將集集菌培養(yǎng)養(yǎng)器的排排氣孔上上膠帽取取下，集集菌培養(yǎng)養(yǎng)器底部部的排液液管口擰擰上，將將沖洗瓶瓶取下?lián)Q換上相應應的培養(yǎng)養(yǎng)基瓶，啟啟動電源源，將培培養(yǎng)基泵泵入指定定