遺傳工程簡介精要

1、遺傳工程染色體工 程基因工程細胞工程第三節(jié) 遺傳工程簡介p75 genetic engineering1通過細胞融合cell fusion即細胞雜交cell hybridization來探索遺傳變化或通過細胞器的轉移來研究其功能。細胞工程cellular engineering2染色體工程chromosomal engineering即分離提取某一染色體或某一段染色體，然后將其轉移至另一細胞來分析其遺傳效應。3是建立在分子遺傳學理論基礎之上，以控制性狀遺傳的基因為操作對象，按著預先的構想，在嚴格控制條件下完成基因轉移，達到改造遺傳性目的的過程?；蚬こ蘥enetic engineering4綜

2、上，所謂遺傳工程，即根據(jù)遺傳學的原理，采用類似工程設計的方法，對生物遺傳物質進行有計劃的技術操作，從而達到定向改造生物遺傳組成，使其獲得新的遺傳性狀，這一過程稱為遺傳工程。5*一、細胞工程 細胞工程主要技術和研究領域包括： (一)、細胞、原生質體植株再生(二)、植物原生質體作為基因工程的受體(三)、細胞、原生質體融合p75四細胞核移植五細胞器移植6一、動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境要求 1、溫度2、pH3、溶氧及氣體環(huán)境4、滲透壓7二、動物細胞的營養(yǎng)需求1、天然培養(yǎng)基其優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果好；缺點是成分復雜、個體差異大、來源有限。 天然培養(yǎng)基的種類主要包括生物性體液如血清、組織浸出液如胚胎浸出液、

3、凝固劑如血漿、水解乳蛋白等。82、合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質對細胞體內生存環(huán)境中物質在體外人工條件的模擬，經過反復試驗篩選、強化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。 合成培養(yǎng)基的優(yōu)點：既能給細胞提供一個近似于體內的生存環(huán)境，又便于控制和提供標準化體外生存環(huán)境。 合成培養(yǎng)基的主要成分：氨基酸、維生素、糖類、無機離子和其它輔助成分。二、動物細胞的營養(yǎng)需求9三、動物細胞工程的主要技術及其實踐意義一單克隆抗體技術在現(xiàn)代醫(yī)學中的應用二胚胎移植和核移植技術在畜牧業(yè)中的應用三動物細胞大量培養(yǎng)生產次生產物四動物克隆技術的應用潛力10*二、染色體工程染色體工程是物種間遺傳轉移的最傳統(tǒng)的方式，也

4、是目前廣泛進入生產應用的遺傳工程。利用染色體替換來改變生物遺傳特性，如利用染色體的易位、缺體、三體等方法，獲得新的染色體組合。p7711(四)、 染色體工程中的現(xiàn)代技術一多倍體 二雙二倍體(三)、 削減、添加、代換、易位12基因決定性狀一青霉菌能產生對人類有用的抗生素青霉素 13基因決定性狀二豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮14基因決定性狀三家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用15定向基因改造設想 設想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細菌“吐出蠶絲？設想二能否讓微生物產生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設想三經過多年的努力，科學家于20世紀70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術基因工程

5、。16返回把大鼠生長因子轉入小鼠得到巨大型的轉基因小鼠。17基因工程簡介在各種酶的作用下，將目的基因的DNA分子與載體DNA分子相連接，形成重組的DNA分子，以一定的方式導入原無該類分子的宿主細胞，并使宿主生物變?yōu)樽匀唤缭瓉頉]有并能連續(xù)傳代的新生物。18要點： 供體、載體、受體基因工程分狹義上游：重組、克隆、表達的設計和構建。廣義下游：表達工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)和產物的純化。目的：DNA擴增，外源基因表達產物，表達調控，改造生物遺傳特性等?；蚬こ毯喗?9基因工程概念p78基因工程：在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切和“拼接，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞進行無性繁殖，使重

6、組基因在受體細胞內表達，產生出所需要的基因產物?；蚬こ痰膭e名基因拼接技術或DNA重組技術操作環(huán)境生物體外操作對象基 因操作水平DNA分子水平基本過程剪切拼接導入表達結果人類需要的基因產物20基因工程過程示意圖從細胞中分離出DNA限制酶截取DNA片斷分離大腸桿菌中的質粒 DNA重組用重組質粒轉化大腸桿菌培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因21基因工程操作的工具將目的基因片斷從人體細胞內提取，需要基因的剪刀限制性內切酶。將目的基因與運載體DNA連接，需要基因的針線DNA連接酶。將目的基因運入大腸桿菌，需要基因的運輸工具運載體。22限制性內切酶分布：主要在微生物中。特點：特異性，即識別特定核苷酸序列， 切割特

7、定切點。結果：產生黏性未端堿基互補配對。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。 一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點上將DNA 分子切斷。目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有200多種。23限制性內切酶作用過程點擊播放24DNA連接酶連接酶的作用：將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵。問題用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要連接幾個磷酸二酯鍵？25DNA連接酶的作用過程點擊播放26運載體p79作用：將外源基因送入受體細胞。條件：能在宿主細胞內復制并穩(wěn)定地保存。具有多個限制酶切點。具有某些標記基因種

8、類：質粒、噬菌體和動植物病毒。要讓一個從甲生物細胞內取出來的基因在乙生物體內進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的細胞內去。能將外源基因送入細胞的工具就是運載體。27質 粒返回28目的基因與質粒的連接返回292噬菌體： 303p79病毒： 常用的為SV40，通過感染方式將其DNA送入哺乳動物細胞中進行增殖。目前應用相對較少。 31基因操作的基本步驟提取目的基因目的基因與運載體結合將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測和表達32提取目的基因將需要的基因從供體生物的細胞內提取出來。取 出DNA用限制酶切斷DNA 目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯

9、藏蛋白基因、植物抗病基因等。33提取目的基因的方法一p79 直接分離基因鳥槍法 用限制酶切成許多片斷34提取目的基因的方法二 人工基因合成法逆轉錄法：以信使RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成合成DNA(基因)。直接合成法：根據(jù)蛋白質的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應的基因。DNA合成儀PCR擴增儀35一基因的分離各種生物中所含的基因很多。例如，最簡單的DNA病毒也有近幾十年基因，原核細胞有幾千個基因，真核細胞那么有上萬個基因。這些不同的基因，在化學結構上都是由4種核苷酸組成，它們間性質極為相似，這樣增加了基

10、因分離和提純的困難。目前，分離基因的方法有下述幾種：1.物理化學法 2.化學合成法3.酶促合成法36目的基因與運載體結合用與提取目的基因相同的限制酶切割質粒使之出現(xiàn)一個切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補配對后，在連拉酶的作用下連接形成重組DNA分子。提取質粒并用限制酶切割用連接酶將目的基因和質粒連接37將目的基因導入受體細胞并擴增基因工程中常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌和動植物細胞等。導入受體細胞常用的方法是借鑒細菌或者病毒侵染細胞的途徑。通常還要對一些受體細胞進行增大通透性的處理。目的基因可以隨著受體細胞進行快速的繁殖，在很短的時間內獲得大

11、量的基因。將目的基因導入受體細胞將受體細胞進行擴增38目的基因的檢測和表達一 前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。 細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產物。淘汰無表達產物的菌落，保留有表達產物的進一步培養(yǎng)、研究。無表達產物無表達產物有表達產物無表達產物39目的基因的檢測和表達二多細胞生物的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)并誘導發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達是否表現(xiàn)出相應的性狀。淘汰無變化的個體，保留有

12、相應變化的個體進一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，那么說明攝入了抗蟲基因并得到表達。40轉基因動物及其在醫(yī)藥行業(yè)中的應用SeminarI41什么是轉基因動物轉基因動物是指用實驗導入的方法將外源基因在染色體基因內穩(wěn)定整合并能穩(wěn)定表達的一類動物。包括基因敲除的動物42外源基因導入的時機初期生殖細胞的改造；將DNA或基因結構用微注射技 術注射到受精卵中；將改造的細胞包括胚胎干細胞 融合到后期胚胎。精子卵子受精卵胚胎干細胞43轉基因的技術手段 DNA顯微注射核轉移技術克隆胚胎干細胞技術逆轉錄病毒介導的基因轉移RNA干

13、擾精子作為載體44一、DNA顯微注射技術 2003 John Wiley and Sons Publishers優(yōu)缺點：1.可靠性高、重復性好2.對于小鼠來說，產生轉基因動物的效率比較高3.導入DNA片段的大小和類型不受限制4.轉基因在代與代之間傳遞的穩(wěn)定性好5.整合位點的隨意性可能對轉基因表達造成影響6.可能會出現(xiàn)不希望的插入突變7.開發(fā)裝置和技術的花費大時間長1980 PNAS 77,7380-7384轉基因的技術手段45二、核移植技術優(yōu)點：轉基因效率顯著超過顯微注射可以方便的建立生產畜群可以預測基因表達水平可以使用定點整合目標基因的技術方法處理胚胎數(shù)移植數(shù)生產牛犢數(shù)轉基因牛數(shù)顯微注射11

14、5411541292克隆法 276 33 33顯微法和克隆法效率比較1997 Nature 385, 81081346三、胚胎干細胞技術(1993) Nature 365, 878947四、逆轉錄病毒介導的基因轉染缺點：低拷貝數(shù)需要逆轉錄病毒插入DNA大小有限可能產生不希望的重組高頻的鑲嵌現(xiàn)象逆轉錄病毒的序列可能干擾轉基因表達(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 6148615248五、RNA干擾技術(1998) Nature 391, 80681149六、精子介導法將外源DNA與精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過受精過程將外源DNA導入

15、受精卵。此法不僅可免去復雜而昂貴的設備，且可省去不少繁雜的操作和條件準備。但該法有些結果不能重復。Lavitrano, M. et al. (1989) Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 57, 71772350小結方法顯微注射核移植胚胎干細胞逆轉錄病毒基因敲除精子介導優(yōu)點外源基因整合效率較高，不需要載體，目的基因的長度可達100Kb轉基因效率高；預測基因表達水平；可以使用定點整合技術外源DNA的整合率高； 整合在生殖細胞中的比例也

16、很高。 可在整合點整合轉移基因的單個拷貝； 該方法簡單、方便 缺點精密儀器， 技術操作較難，易造成宿主動物基因組的插入突變供體細胞易衰老ES細胞株不易建立，長期培養(yǎng)后出現(xiàn)分化現(xiàn)象；生產的轉基因動物都是嵌合體 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在動物各種組織中的分布不均 應用具有一定局限性有些結果不能重復 51轉基因動物在醫(yī)藥行業(yè)中的應用人類疾病造模藥物產品的生產異種移植52人類疾病造模動物模型對疾病產生機理和治療是必不可少的工具利用轉基因動物可以創(chuàng)造出多種動物模型轉基因動物用于發(fā)病機理研究的例子：AD對AD患者死亡后腦部解剖發(fā)現(xiàn)腦部存積了一種淀粉狀蛋白的蛋白質將人類淀粉狀蛋白的基因轉到大鼠體內使其發(fā)病，再清除淀粉狀蛋白，發(fā)現(xiàn)確實能夠減慢甚至停止病情。 (1991) Science 253, 323325(2004) Mol. Psychiatry 9, 66468353藥物產品的生產主要通過乳腺生產動物乳腺生物反應器，少數(shù)通過腎臟和膀胱。1999年，只有三種產品進入臨床實驗；到2004年，已經有40多種進入臨床實驗或即將進入市場。2005 DDT