生物藥物分析與檢驗(yàn) 電泳分析法課件

1、電泳分析法金葉1 1807-1809年，俄國(guó)物理學(xué)家F.F.Reuss首次發(fā)現(xiàn)黏土顆粒的電遷移現(xiàn)象，并開始研究帶電粒子在電場(chǎng)中的電遷移行為，測(cè)定它們的遷移速度。電泳的發(fā)展 1907年，F(xiàn)ield 和Teague研究出填充有瓊脂糖凝膠的橋管，成功地分離了白喉毒素和它的抗體。*2 1937年，蒂塞利烏斯（ Tiselius，瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白；發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定。 第一次的自由溶液電泳；第一臺(tái)電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。*3 1959年，Raymond和We

2、intraub利用人工合成的凝膠作為支持電解質(zhì)，創(chuàng)造了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了區(qū)帶電泳的分辨率。*4一、定義及原理1、電泳：是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。2、原理 電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)作用下，根據(jù)待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、性狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純。 3、應(yīng)用：電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì) (無機(jī)鹽、氨基酸、核苷酸、脂類)的分離分析外，最主要用于生物大分子 (蛋白質(zhì)、核酸、酶) 的研究。二、電泳分類 （一）按有無固體支持物分類按有無固體支持物可以分為兩類：自由界面電泳和支持物電泳。1、自

3、由界面電泳即溶質(zhì)在自由溶液中泳動(dòng)，包括：等電聚焦電泳、等速電泳等。2、支持物電泳根據(jù)所用的支持物不同又可分為紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。3、根據(jù)支持載體的位置或形狀可分成：水平電泳、垂直板式電泳、垂直柱式電泳、U型管電泳、毛細(xì)管電泳等。 1、自由界面電泳 2、區(qū)帶電泳 3、高效毛細(xì)管電泳（二）按分離原理分類區(qū)帶電泳： 是在溶液中加入一些惰性物質(zhì)或凝膠物質(zhì)作為支持物，泳動(dòng)物質(zhì)在支持物間隙中移動(dòng)的電泳方法。 避免對(duì)流的干擾。紙電泳醋酸纖維素電泳瓊脂糖電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 DNA序列分析電泳槽中型雙垂

4、直電泳槽1、區(qū)帶電泳基本理論在眾多電泳技術(shù)中，最常用的為區(qū)帶電泳，同時(shí)也是最簡(jiǎn)潔的電泳模式。推動(dòng)離子/粒子作區(qū)帶電泳的驅(qū)動(dòng)力為電場(chǎng)力（F），離子/粒子所受電場(chǎng)力的大小與離子/粒子的凈電荷（Q）和電場(chǎng)強(qiáng)度（E）呈正比關(guān)系，即： 而離子/粒子在運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)受到一定的溶液阻力（F），對(duì)于球形離子/粒子，此阻力服從Stoke定律，即 在上式中，r為離子/粒子的半徑，為溶液或介質(zhì)的黏度，v為粒子運(yùn)動(dòng)速度。 F=6rv當(dāng)電泳達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，電動(dòng)力等于介質(zhì)的阻力，即F=F。因此，我們得到 v/E表示遷移率，也稱淌度，以U表示 帶電粒子的電泳淌度在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)，即與其所帶電量成正比；與其半徑及介質(zhì)粘

5、度成反比。QE=6rvv/E=Q/6rU=v/E=Q/6r影響電泳遷移率的因素(必考)：1、影響電泳遷移率的外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度溶液的pH值溶液的離子強(qiáng)度電滲現(xiàn)象溶液的溫度和黏度分子篩效應(yīng)2.影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量質(zhì)點(diǎn)的大小和形狀指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區(qū)帶電泳。 平臥式電泳槽裝置示意圖 將濾紙條水平地架設(shè)在兩個(gè)裝有緩沖溶液的容器之間，樣品點(diǎn)于濾紙中央。當(dāng)濾紙條被緩沖液潤(rùn)濕后，再蓋上絕緣密封罩，即可由電泳電源輸入直流電壓（100V1000V）進(jìn)行電泳。 （一）紙電泳醋酸纖維薄膜電泳以醋酸纖維薄膜為支持介質(zhì)。醋酸纖維素是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙酰

6、化而成。它溶于丙酮等有機(jī)溶劑，可涂布成均一細(xì)密的微孔薄膜，即醋酸纖維素膜（cellulose acetate membrane，簡(jiǎn)稱CAM）。(二) 醋酸纖維素薄膜電泳優(yōu)點(diǎn)：精確性高?？焖偈r(shí)。一般電泳45-60min即可。 靈敏度高，樣品用量少。 應(yīng)用面廣。如胎兒甲種球蛋白，溶菌酶，胰島素，組蛋白等用醋 酸纖維薄膜電泳能較好地分離。 有利于掃描定量及長(zhǎng)期保存。 缺點(diǎn)：分離效果不太好。優(yōu)缺點(diǎn)醋酸纖維素薄膜電泳示意圖（1）預(yù)處理 膜的準(zhǔn)備：根據(jù)分離樣品的多少將醋酸纖維薄膜裁切成合適的大小，在膜片無光澤的一面上用鉛筆輕輕劃一條加樣線。加樣線可選在距膜片一端23cm處，有時(shí)也可選在膜片的中央線附近。

7、膜片浸透：在一淺碟或培養(yǎng)皿中倒入所選擇的緩沖液，將膜片小心地浮鋪在緩沖液面上，將膜片的的無光澤面朝下。膜片的底面吸收電極緩沖液后逐漸下沉，直至電極緩沖液將膜片完全浸透。膜片在電極緩沖液完全浸透后，用鈍頭鑷子取出，稍稍用濾紙吸去多余的緩沖液，然后將膜片夾在兩層濾紙之間吸干多余的緩沖液，但不能吸得過干而出現(xiàn)不透明的白色部分。實(shí)驗(yàn)操作步驟 （3）電泳 電泳前，先用鈍頭鑷子將加過樣的膜片安放在電泳槽的支架上，膜片兩端約0.51.0 cm的部分應(yīng)與支架的頂面緊貼，膜面盡可能不與手指直接接觸，以免膜面受到污染。如果在同一電泳槽內(nèi)同時(shí)安放幾張膜片，應(yīng)避免相鄰膜片之間彼此接觸。在電泳槽的兩個(gè)電極室內(nèi)注入適量的

8、電極緩沖液，用3 4層濾紙作鹽橋。膜片的兩端分別用濾紙鹽橋蓋住，以此將膜片拉平固定并使電流通過。蓋上電泳槽蓋，讓膜片在電泳槽內(nèi)水平靜置平衡10分鐘，然后將電泳槽的兩個(gè)電極與直流電源的正負(fù)極分別相接。架膜加蓋接導(dǎo)線，開機(jī)染色劑要求：不應(yīng)溶解醋酸纖維薄膜一般蛋白質(zhì)的染色方法氨基黑10B染色：酸性染料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。麗春紅S方法：是一種水溶性的陰離子重氮染料，帶負(fù)電荷的麗春紅分子與正電荷的蛋白質(zhì)氨基基團(tuán)結(jié)合，也可以非共價(jià)鍵形式與蛋白質(zhì)非極性區(qū)域結(jié)合，顯示紅色蛋白條帶。用3%三氯醋酸配制0.2%麗春紅S溶液，將干燥的膜片浸入此染色劑中。染色時(shí)間不需要嚴(yán)格控制，但

9、一般染色10分鐘比較合適。（4）染色 （6）定量測(cè)定定量測(cè)定的方法有洗脫法和光密度法。洗脫法是將確定的樣品區(qū)帶剪下，用適當(dāng)?shù)南疵搫┫疵摵筮M(jìn)行比色或分光光度測(cè)定。光密度法是將染色后的干濾紙用光密度計(jì)直接定量測(cè)定各樣品電泳區(qū)帶的物質(zhì)含量。 醋酸纖維薄膜電泳應(yīng)用范圍較廣，可用于檢測(cè)和分析血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、體液、脊髓液、脫氫酶、多肽、核酸以及其他生物大分子物質(zhì)。由于醋酸纖維薄膜電泳法快速且簡(jiǎn)便，目前在醫(yī)學(xué)和臨床生物化學(xué)等領(lǐng)域已成為一種常規(guī)技術(shù)。應(yīng)用人血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 原理：以醋酸纖維薄膜為支持物，在pH=8.6的巴比妥緩沖液中，人血清蛋白的pI均小于8.6，帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)。

10、由于遷移率不同而被分離。人血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和遷移率概念：以瓊脂糖凝膠作支持體的電泳方式。(三)瓊脂糖凝膠電泳天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉，從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。瓊脂糖（agarose）瓊脂膠（agaropectin） 天然瓊脂(agar)是一種多聚糖，主要由瓊脂糖(約占80%)及瓊脂膠組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。 瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下： (1)瓊脂糖

11、凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進(jìn)行電泳。 (2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大(約占98-99%)，近似自由電泳，樣品擴(kuò)散度較自由電泳小，對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。 (3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈監(jiān)測(cè)及定量測(cè)定。 (4)電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。 瓊脂糖凝膠電泳的缺點(diǎn)：(1) 機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。(2) 易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。(3) 瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。(4) 與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。 目前，瓊脂糖凝膠電泳常

12、用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。 瓊脂糖也可用作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1g蛋白質(zhì)就可檢出。 (四) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由丙稀酰胺（acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr）和亞甲基雙丙稀酰胺(N，N- methylenebisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis)聚合而成的，具有一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在形成凝膠的化學(xué)聚合過程中，可以人為控制聚合成具有一

13、定大小孔徑的凝膠。在電泳過程中，凈電荷相近的物質(zhì)在通過凝膠孔洞時(shí)，所受到的阻力和樣品分子的大小和形狀密切相關(guān)，即分子篩作用。原理電泳不僅能分離含有各種大分子物質(zhì)的混合物，而且可以研究生物大分子的特性。諸如如電荷、分子量、等電點(diǎn)以至于構(gòu)象。在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中來分離蛋白質(zhì)，屬于非解離電泳。在電泳過程中仍然保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、亞基之間的相互作用及其生物活性，因而根據(jù)其電泳遷移率，可得到天然蛋白質(zhì)的分子量。 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理PAGE的特點(diǎn)1.具有分子篩效應(yīng)，分辨率高2.樣品不易擴(kuò)散，用量少，靈敏度可達(dá)10-6g3.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團(tuán)4.凝膠不帶電荷，

14、消除了電滲現(xiàn)象5.機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明6.網(wǎng)孔可調(diào)節(jié)。聚丙烯酰胺凝膠膠體的制備示范PAGE 垂直板式電泳PAGE應(yīng)用范圍較廣，可用于脫輔基蛋白的分離、cDNA合成產(chǎn)物的分離、DNA片斷的分離制備、DNA順序分析、生物大分子分子量的測(cè)定、及RNA序列分析等。應(yīng)用例1：玉米改良單交種的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。不同玉米種子清蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。條件：分離膠T = 13.8%， 濃縮膠T = 4.9%，清蛋白樣品16 加樣， 電壓 300350 V 1015 min 后將電壓逐漸升至500 V 并穩(wěn)壓電泳4045 min，考馬斯亮蘭R250 染色5 min。十二烷基磺

15、酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS），簡(jiǎn)稱 SDS電泳，主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)分子量研究。(五) 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳在聚丙烯酰胺凝膠中加入陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS），不影響凝膠的形成，不影響蛋白質(zhì)的電泳遷移率，蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要取決于其自身分子量的大小。SDS能打開蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和疏水鍵，使蛋白質(zhì)變性成為松散的線狀(緩沖液中加入巰基乙醇)。 同時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)的每個(gè)氨基酸能與固定量的SDS相結(jié)合 ，形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后

16、，所帶上的SDS負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而也就掩蓋或消除了不同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳具有設(shè)備簡(jiǎn)單，樣品用量甚微，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為測(cè)定大多數(shù)蛋白質(zhì)分子量的常用方法。免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進(jìn)行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開，然后加入抗體做雙相免疫擴(kuò)散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴(kuò)散而相遇，在二者比例適當(dāng)?shù)牡胤?，形成肉眼可見的沉淀弧。（六）免疫電?七)高效毛細(xì)管電泳法（HPCE） 傳統(tǒng)電泳最大的局限性是難以克服由兩端的高電壓所引起的電介質(zhì)離子流的自熱，或

17、稱焦耳熱, 從而導(dǎo)致區(qū)帶展寬，影響遷移，降低效率, 因此極大地限制了高壓的使用.當(dāng)然也就難以加快整個(gè)過程的速度。 45 毛細(xì)管電泳（ capi1lary electrphoresis，CE）和傳統(tǒng)電泳的根本區(qū)別在于前者設(shè)法使電泳過程在散熱效率極高的毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行，從而確保引入高的電場(chǎng)強(qiáng)度，全面改善分離質(zhì)量。46l967年Hjerten最先提出在高電場(chǎng)強(qiáng)度，直徑為3mm的毛細(xì)管中作自由溶液的毛細(xì)管區(qū)帶電泳，開創(chuàng)了CE的先河。1981年，J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs實(shí)驗(yàn)上和理論上為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。198889年，商品化的毛細(xì)管電泳儀推出，毛細(xì)管電泳法迅速發(fā)展起來。 第

18、一節(jié) 毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)和分類一、電泳和色譜1.分離原理47 電泳是溶液中帶電粒子在電場(chǎng)力作用下發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)，因粒子所帶電荷數(shù)、形狀、大小等不同，導(dǎo)致不同的遷移速度而分離。 色譜是不同組分在流動(dòng)相的推動(dòng)下，由于在固定相流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，導(dǎo)致不同的遷移速度而分離。某些毛細(xì)管電泳的分離模式也包含了色譜的分離機(jī)制。2.分離過程 電泳和色譜的分離過程都是差速遷移過程，可用相同的理論來描述。色譜中所用的一些名詞概念和基本理論，如保留值、塔板理論、速率理論等均可借用于毛細(xì)管電泳中。483.儀器流程49二、毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1. 柱效高 高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，

19、特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。2.消耗低 CE所需樣品為nl級(jí), 流動(dòng)相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為l級(jí), 流動(dòng)相則需幾百毫升乃至更多。503.速度快一般幾十秒至十幾分，最多半小時(shí)，即可完成一個(gè)試樣的分析。4.應(yīng)用廣泛 通過改變操作模式和緩沖液的成分，CE有很大的選擇性，可以根據(jù)不同的分子性質(zhì)，對(duì)極廣泛的對(duì)象進(jìn)行有效的分離。 CE分離有機(jī)分子、藥物分子，特別是手性分子和生物大分子方面的能力，對(duì)HPLC地位提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。 51三、毛細(xì)管電泳的分類按分離模式分類，常用的技術(shù)有六種：毛細(xì)管區(qū)帶電泳，膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜，毛細(xì)管凝膠電泳，毛細(xì)管等電聚焦，毛細(xì)管等速電泳 ，毛細(xì)管電色譜 毛細(xì)管區(qū)

20、帶電泳是CE中最基本、應(yīng)用最普遍的一種模式。52四、電滲和電滲流1電滲現(xiàn)象 當(dāng)固體與液體相接觸時(shí)，如果固體表面因某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶相反電荷，當(dāng)液體兩端施加一定電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種現(xiàn)象叫做電滲。53 高效毛細(xì)管電泳大多使用石英毛細(xì)管，在內(nèi)充緩沖液PH2時(shí)，管壁的硅醇基（SiOH）離解成硅醇基陰離子（SiO），使管壁帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，在管壁和溶液之間形成雙電層。Zeta電位54 由于溶液中的陽離子實(shí)際上是溶劑化的，在外電場(chǎng)的作用下，溶劑化的陽離子向負(fù)極移動(dòng)，將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，這就是毛細(xì)管電泳中的電滲現(xiàn)象。2。電滲流（elec

21、troosmotic flow，EOF） 電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流。553. 電滲流的大小和方向電滲流的大小用電滲流速度vos表示，其大小決定于電滲淌度os和電場(chǎng)強(qiáng)度E。即 、分別是電泳介質(zhì)的介電常數(shù)和粘度, 毛細(xì)管壁的Zeta電位，它近似等于擴(kuò)散層與緊密層界面上的電位。該界面內(nèi)凈電荷數(shù)（正電荷數(shù)）越多、擴(kuò)散層越厚，Zeta電位越大.56 Lef毛細(xì)管有效長(zhǎng)度； tos電滲流標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時(shí)間。電滲流的速度是電泳速度的57倍。 一般情況下，石英毛細(xì)管內(nèi)壁表面帶負(fù)電荷，則電滲流帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)。但如果將毛細(xì)管內(nèi)壁改性，比如在在內(nèi)壁表面涂漬或鍵合一層陽離子表面活性劑，將使壁

22、表面帶正電荷，則電滲流帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。VOS可通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定57 在外電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下產(chǎn)生的電滲流為平流，即塞式流形。液體流動(dòng)速度除在管壁附近因摩擦力迅速減小到零以外，其余部分幾乎處處相等。這一點(diǎn)和HPLC中靠泵驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)相的流形完全不同。4.電滲流的流形58 HPLC流動(dòng)相的流形為拋物線形的層流，在管壁處的速度為零，管中心的速度是平均速度的2倍，引起的譜峰展寬較大。電滲流呈平流，引起的譜峰展寬很小，是毛細(xì)管電泳能獲得較HPLC更高分離效率的重要原因。4. 電滲流的作用 電滲流通常流向負(fù)極，電滲流速度約等于一般離子電泳速度的57倍。所以，各種電性物質(zhì)在毛細(xì)管中的遷移速度為兩種速度的矢量和，稱為表

23、觀電泳速度，用vap表示。5960 當(dāng)把試樣從陽極端注入到毛細(xì)管內(nèi)時(shí)，不同電性的粒子將按不同的速度向負(fù)極遷移，從負(fù)極端先后流出毛細(xì)管。出峰次序是： 陽離子中性分子陰離子中性分子與電滲流速度相同，不能互相分離。v=E=(電滲流ep)E61+ =電滲流 + +ep 陽離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致； - =電滲流 - -ep 陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反； 0 =電滲流 中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；電滲流具有像HPLC中泵一樣的作用，推動(dòng)離子前進(jìn)，加上不同離子電泳速度和方向的差異，完成陽離子、陰離子和中性離子的分離。改變電滲流的大小和方向，可以改變分離效率和選擇性。這是HPCE中優(yōu)化分離的重要因素。電滲

24、流在HPCE 的分離中起著極其重要的作用：電滲流的微小變化影響分離結(jié)果的重現(xiàn)性（遷移時(shí)間和峰面積） 。電泳中影響電滲流的因素很多，應(yīng)設(shè)法控制電滲流的恒定。62三、HPCE中影響電滲流的因素1.電場(chǎng)強(qiáng)度的影響 電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細(xì)管材料的影響 酸度影響毛細(xì)管的表面Si-OH基的電離，特別是在pH47范圍內(nèi)，影響更顯著，此時(shí)溶液pH值與EOF成近線性關(guān)系 633. 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響 對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢(shì)增大，電滲流增大，pH=7，達(dá)到最大； pH3，完全被氫離

25、子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）緩沖液陰離子的影響 在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時(shí)，毛細(xì)管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。 64緩沖溶液離子強(qiáng)度，影響雙電層的厚度、溶液粘度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液濃度增加，離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。（3）緩沖液濃度（離子強(qiáng)度）的影響65664. 溫度的影響 毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的粘度下降，電滲流增大。 溫度變化來自于“焦耳熱” 焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過時(shí)，產(chǎn)生的熱量； HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。 溫度每變化1度，將引起背景電解質(zhì)溶液粘度變化

26、2%3%；675. 添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向 某些陽離子表面活性劑使電滲流減小，某些陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負(fù)電荷增加，電滲流增大（3）加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使溶液的粘度減小，電滲流增大。68第三節(jié) 毛細(xì)管電泳儀 毛細(xì)管電泳儀結(jié)構(gòu)比高效液相色譜儀 簡(jiǎn)單。CE只需高壓直流電源、進(jìn)樣裝置、毛細(xì)管和檢測(cè)器等。前三個(gè)部件均易實(shí)現(xiàn), 困難之處在于檢測(cè)器。6970HPCE儀器流程與主要部件 process and main assembly 電壓：030kV； 分

27、離柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；（可檢測(cè)到：10-1910-21 mol/L）2022/10/121.高壓電源（1）030 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；2. 毛細(xì)管柱 （1）材料：石英 （2）規(guī)格：內(nèi)徑2075m，外徑350400m；長(zhǎng)度電泳,陰離子在負(fù)極最后流出。CZE是最基本、應(yīng)用最廣的分離模式7576774.2、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC或MEKC） 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜是在緩沖溶液中加入濃度高于膠束臨界濃度的表面活性劑，膠束相在分離中起到了準(zhǔn)固定相的作用

28、，是電泳技術(shù)與色譜技術(shù)的結(jié)合。 把離子型表面活性劑 (如十二烷基硫酸鈉)加到緩沖液中, 當(dāng)其濃度超過臨界濃度后就形成有一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。雖然膠束帶負(fù)電, 但電滲流的速度仍大于膠束的遷移速度, 故膠束將慢速向負(fù)極移動(dòng)。（一）分離原理 7879 中性粒子按其疏水性不同，在緩沖溶液（流動(dòng)相）和膠束（準(zhǔn)固定相）之間分配。疏水性強(qiáng)、親水性弱的粒子分配到膠束中的多，分配到緩沖溶液中的少；反之，親水性強(qiáng)、疏水性弱的溶質(zhì)分配到膠束中的少，分配到緩沖溶液中的多。當(dāng)溶質(zhì)進(jìn)入膠束時(shí)，以膠束的速度慢速遷移；溶質(zhì)進(jìn)入緩沖溶液時(shí)，以電滲的速度快速前移。分配系數(shù)越大的粒子，在柱中遷移速度慢，從而使疏水性稍有差別的中性物質(zhì)在電泳中得以分離。80 MECC的突出優(yōu)點(diǎn)是除