基于基于抗原抗體反應(yīng)檢測方法

1、關(guān)于基于基于抗原抗體反應(yīng)的檢測方法第1頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四學(xué)習(xí)目的 ：一、掌握抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)二、了解影響抗原-抗體反應(yīng)的因素三、學(xué)習(xí)抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測方法第2頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四抗原-抗體反應(yīng)： 指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。主要應(yīng)用：用已知抗原檢測未知抗體用已知抗體檢測未知抗原定性或定量檢測體內(nèi)各種大分子 物質(zhì)用已知抗體檢測某些藥物、激素和 炎性介質(zhì)等各種半抗原物質(zhì)第3頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四一、抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)高度特異性定義：一種抗原通常僅能與

2、由它刺激所產(chǎn)生的抗體 結(jié)合。分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體的抗原結(jié)合部位間存在 分子結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，二者可特異性結(jié)合。交叉反應(yīng) 共同抗原決定基刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體分別與兩種抗原 ( 共同抗原 ) 結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。機(jī)理：具有相同的抗原表位第4頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四抗原-抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見性前帶現(xiàn)象：抗體過剩 后帶現(xiàn)象：抗原過剩網(wǎng)格復(fù)合體：抗原、抗體的數(shù)量比例合適。 反應(yīng)體系基本不存在游離的抗原或抗體，形成肉眼可見的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。可逆性 抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價鍵結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。 過剩方結(jié)合價未被完全占據(jù)，成游離小分子復(fù)合物或解離，不可見第5頁

3、，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四二、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素內(nèi)因：1）抗體的特異性和親和力 2）抗原理化性質(zhì)、抗原表位多寡和種類 3）抗原抗體的濃度、比例 （影響最大，決定因素）外因：1）電解質(zhì) 使抗原-抗體復(fù)合物失 去電荷而凝集，出現(xiàn)可見反應(yīng) 2）酸堿度 最適pH68 3）溫度 適宜（可增加抗原 與抗體的碰撞機(jī)會，加快結(jié)合速度）第6頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四三、抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測方法凝集反應(yīng)：細(xì)菌或紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)出現(xiàn)凝集。沉淀反應(yīng)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后， 在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的沉淀。補(bǔ)體參與的反應(yīng)：應(yīng)用

4、抗體與紅細(xì)胞表面抗 原結(jié)合，激活反應(yīng)體系中的補(bǔ)體成分， 根據(jù)溶血現(xiàn)象判定試驗(yàn)結(jié)果。免疫標(biāo)記技術(shù)：用熒光素、酶、 放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo) 記抗體或抗原，進(jìn)行抗原-抗體 反應(yīng)的檢測.第7頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四第8頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四單向免疫擴(kuò)散：特點(diǎn)：定性半定量用途：可用于測定血清IgG IgM IgA 和C3等的含量原理：沉淀環(huán)的直徑與抗原含量呈正相關(guān)操作：鋪板 打孔 加樣 放濕盒 看結(jié)果第9頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四雙向免疫擴(kuò)散用途：鑒定兩種抗原是否相同特點(diǎn)：定性半定量操作：鋪板 打孔 加

5、樣 放濕盒 看結(jié)果第10頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四免疫電泳常用于血清蛋白的組分分析第11頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四 在一定量的抗體中，分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時間后形成抗原抗體復(fù)合物，用濁度計測量反應(yīng)液體的濁度，并與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對照，由此推算樣品中的抗原含量。免疫比濁原理：抗體濃度（高濃度）固定時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。第12頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四免疫標(biāo)記技術(shù)：（1）免疫熒光法（2）酶免疫測定（3）放射免疫測定法（4）化學(xué)發(fā)光免疫分析（5）免疫印

6、跡法第13頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四（1）免疫熒光法優(yōu)點(diǎn):特異性高缺點(diǎn):檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。間接熒光法優(yōu)點(diǎn):敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二 抗即可用于多種抗原的檢測。缺點(diǎn)：非特異性反應(yīng)亦增強(qiáng)。直接熒光法熒光素與抗體連接，再與抗原反應(yīng)（對抗原定性或定位）第14頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四（2）酶免疫測定 將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效 性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：測定可溶性抗原或抗體。免疫組化技術(shù)：應(yīng)用標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，

7、對組織或細(xì)胞表面抗原進(jìn)行定性、定量、定位。雙抗體夾心法間接法酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) ELISPOTBAS-ELISA（生物素-親和素系統(tǒng)）第15頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四雙抗體夾心法：用于檢測特異性抗原。操作步驟： 用已知抗體包板 洗滌 封板 洗滌 加入待檢標(biāo)本 洗滌 加酶標(biāo)抗體 洗滌 加底物顯色 結(jié)果觀察第16頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四 間接法：用于檢測特異性抗體?；静襟E：用已知抗原包板洗滌加入待檢抗體洗滌加酶標(biāo)二抗洗滌加底物顯色觀察結(jié)果第17頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)A: 用已知抗原檢測分

8、泌特異性抗原的B細(xì)胞： 用已知抗原包被固相載體，B細(xì)胞分泌的抗體與之結(jié)合，加入酶標(biāo)記的第二抗體，通過底物顯色反應(yīng)可檢測B細(xì)胞分泌的特異性抗體。第18頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四B:用抗細(xì)胞因子抗體檢測細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子： 用抗細(xì)胞因子抗體包被固相載體，加入不同來源的細(xì)胞，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與包被抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體，通過底物顯色反應(yīng)測定結(jié)合在固相載體上的細(xì)胞因子。第19頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四BAS-ELISA 生物素-親和素系統(tǒng) 借助所形成的親和素-生物素-酶復(fù)合物追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，可

9、檢出相應(yīng)抗體或抗原。原理：生物素與親和素的高度親和力、 生物素能與抗體結(jié)合第20頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四（3）放射免疫測定法 用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性。（4）化學(xué)發(fā)光免疫分析 將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)回復(fù)至穩(wěn)定的基態(tài)時發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分析儀測定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。第21頁，共24頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四（5）免疫印跡法 又稱Western印跡法，其結(jié)合凝膠電泳與固相免疫技術(shù)，將借助電泳所區(qū)分的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體，再應(yīng)用酶免疫、放射免疫等技術(shù)進(jìn)行