基于基于抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)方法

1、關(guān)于基于基于抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法第1頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四學(xué)習(xí)目的 ：一、掌握抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)二、了解影響抗原-抗體反應(yīng)的因素三、學(xué)習(xí)抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測(cè)方法第2頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四抗原-抗體反應(yīng)： 指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。主要應(yīng)用：用已知抗原檢測(cè)未知抗體用已知抗體檢測(cè)未知抗原定性或定量檢測(cè)體內(nèi)各種大分子 物質(zhì)用已知抗體檢測(cè)某些藥物、激素和 炎性介質(zhì)等各種半抗原物質(zhì)第3頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四一、抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)高度特異性定義：一種抗原通常僅能與

2、由它刺激所產(chǎn)生的抗體 結(jié)合。分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體的抗原結(jié)合部位間存在 分子結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，二者可特異性結(jié)合。交叉反應(yīng) 共同抗原決定基刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體分別與兩種抗原 ( 共同抗原 ) 結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。機(jī)理：具有相同的抗原表位第4頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四抗原-抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見(jiàn)性前帶現(xiàn)象：抗體過(guò)剩 后帶現(xiàn)象：抗原過(guò)剩網(wǎng)格復(fù)合體：抗原、抗體的數(shù)量比例合適。 反應(yīng)體系基本不存在游離的抗原或抗體，形成肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）?？赡嫘?抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。 過(guò)剩方結(jié)合價(jià)未被完全占據(jù)，成游離小分子復(fù)合物或解離，不可見(jiàn)第5頁(yè)

3、，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四二、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素內(nèi)因：1）抗體的特異性和親和力 2）抗原理化性質(zhì)、抗原表位多寡和種類(lèi) 3）抗原抗體的濃度、比例 （影響最大，決定因素）外因：1）電解質(zhì) 使抗原-抗體復(fù)合物失 去電荷而凝集，出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng) 2）酸堿度 最適pH68 3）溫度 適宜（可增加抗原 與抗體的碰撞機(jī)會(huì)，加快結(jié)合速度）第6頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四三、抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測(cè)方法凝集反應(yīng)：細(xì)菌或紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)出現(xiàn)凝集。沉淀反應(yīng)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后， 在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀。補(bǔ)體參與的反應(yīng)：應(yīng)用

4、抗體與紅細(xì)胞表面抗 原結(jié)合，激活反應(yīng)體系中的補(bǔ)體成分， 根據(jù)溶血現(xiàn)象判定試驗(yàn)結(jié)果。免疫標(biāo)記技術(shù)：用熒光素、酶、 放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo) 記抗體或抗原，進(jìn)行抗原-抗體 反應(yīng)的檢測(cè).第7頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四第8頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四單向免疫擴(kuò)散：特點(diǎn)：定性半定量用途：可用于測(cè)定血清IgG IgM IgA 和C3等的含量原理：沉淀環(huán)的直徑與抗原含量呈正相關(guān)操作：鋪板 打孔 加樣 放濕盒 看結(jié)果第9頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四雙向免疫擴(kuò)散用途：鑒定兩種抗原是否相同特點(diǎn)：定性半定量操作：鋪板 打孔 加

5、樣 放濕盒 看結(jié)果第10頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四免疫電泳常用于血清蛋白的組分分析第11頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四 在一定量的抗體中，分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時(shí)間后形成抗原抗體復(fù)合物，用濁度計(jì)測(cè)量反應(yīng)液體的濁度，并與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，由此推算樣品中的抗原含量。免疫比濁原理：抗體濃度（高濃度）固定時(shí)，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。第12頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四免疫標(biāo)記技術(shù)：（1）免疫熒光法（2）酶免疫測(cè)定（3）放射免疫測(cè)定法（4）化學(xué)發(fā)光免疫分析（5）免疫印

6、跡法第13頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四（1）免疫熒光法優(yōu)點(diǎn):特異性高缺點(diǎn):檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。間接熒光法優(yōu)點(diǎn):敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二 抗即可用于多種抗原的檢測(cè)。缺點(diǎn)：非特異性反應(yīng)亦增強(qiáng)。直接熒光法熒光素與抗體連接，再與抗原反應(yīng)（對(duì)抗原定性或定位）第14頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四（2）酶免疫測(cè)定 將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效 性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：測(cè)定可溶性抗原或抗體。免疫組化技術(shù)：應(yīng)用標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀(guān)察，

7、對(duì)組織或細(xì)胞表面抗原進(jìn)行定性、定量、定位。雙抗體夾心法間接法酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) ELISPOTBAS-ELISA（生物素-親和素系統(tǒng)）第15頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四雙抗體夾心法：用于檢測(cè)特異性抗原。操作步驟： 用已知抗體包板 洗滌 封板 洗滌 加入待檢標(biāo)本 洗滌 加酶標(biāo)抗體 洗滌 加底物顯色 結(jié)果觀(guān)察第16頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四 間接法：用于檢測(cè)特異性抗體?；静襟E：用已知抗原包板洗滌加入待檢抗體洗滌加酶標(biāo)二抗洗滌加底物顯色觀(guān)察結(jié)果第17頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)A: 用已知抗原檢測(cè)分

8、泌特異性抗原的B細(xì)胞： 用已知抗原包被固相載體，B細(xì)胞分泌的抗體與之結(jié)合，加入酶標(biāo)記的第二抗體，通過(guò)底物顯色反應(yīng)可檢測(cè)B細(xì)胞分泌的特異性抗體。第18頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四B:用抗細(xì)胞因子抗體檢測(cè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子： 用抗細(xì)胞因子抗體包被固相載體，加入不同來(lái)源的細(xì)胞，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子與包被抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體，通過(guò)底物顯色反應(yīng)測(cè)定結(jié)合在固相載體上的細(xì)胞因子。第19頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四BAS-ELISA 生物素-親和素系統(tǒng) 借助所形成的親和素-生物素-酶復(fù)合物追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)酶催化底物顯色，可

9、檢出相應(yīng)抗體或抗原。原理：生物素與親和素的高度親和力、 生物素能與抗體結(jié)合第20頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四（3）放射免疫測(cè)定法 用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性。（4）化學(xué)發(fā)光免疫分析 將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過(guò)氧化陰離子）激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)回復(fù)至穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)發(fā)射光子，通過(guò)自動(dòng)發(fā)光分析儀測(cè)定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。第21頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)50分，星期四（5）免疫印跡法 又稱(chēng)Western印跡法，其結(jié)合凝膠電泳與固相免疫技術(shù)，將借助電泳所區(qū)分的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體，再應(yīng)用酶免疫、放射免疫等技術(shù)進(jìn)行