分子檢測技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用

1、 腫瘤靶向治療（Target therapy of cancer）依據(jù)已知腫瘤發(fā)生的異常分子和基因，設(shè)計(jì)和研發(fā)針對這些特定的分子和靶點(diǎn)藥物，選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的治療方法；靶向治療的前提就是明確腫瘤的特異靶基因變異類存在與否和變異類型；個(gè)體化治療的雛形。第一頁，共六十五頁。熒光原位雜交（ Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH ）技術(shù)第二頁，共六十五頁。簡介FISH = Fluorescence In Situ Hybridization利用熒光標(biāo)記的DNA探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)與其互補(bǔ)的DNA片段應(yīng)用：遺傳病診斷 血液腫瘤 實(shí)體瘤樣本：羊水、絨毛、流產(chǎn)組織

2、、外周血、骨髓、體液及各種腫瘤組織等第三頁，共六十五頁。用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位熒光標(biāo)記探針探針變性樣本DNA變性雜交工作原理第四頁，共六十五頁。FISH檢測染色體易位（Translocation）在淋巴瘤分型中的應(yīng)用FISH技術(shù)在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用第五頁，共六十五頁。檢測技術(shù)特點(diǎn)不同類型的淋巴瘤染色體易位類型不同優(yōu)點(diǎn)適用于形態(tài)學(xué)上難以診斷且IHC結(jié)果不理想的標(biāo)本；適用于細(xì)胞數(shù)量少，形

3、態(tài)不典型的活檢及穿刺組織。必須結(jié)合組織形態(tài)學(xué)和免疫組化結(jié)果作最后診斷！第六頁，共六十五頁。FISH基因檢測在淋巴瘤的應(yīng)用第七頁，共六十五頁。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL） 按免疫組化亞型分為 CD5陽性DLBCL 生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型(GCB)、 非生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型(non-GCB) 3類可根據(jù)CD10、BCL6、MUM1的表達(dá)區(qū)分生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型、非生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型。30%瘤細(xì)胞表達(dá)CD10或CD10(-)、BCL-6(+)、MUM-1(-)診斷為GCB;其他病例則為non-GCB。 第八頁，共六十五頁。 BCL6基因斷裂-輔助診斷彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤 BCL6基因斷裂重排-判

4、斷預(yù)后目前研究確定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。 一項(xiàng)針對102名DLBCL患者的BCL6重排情況及其與預(yù)后關(guān)系的研究顯示，BCL6陽性患者診斷治療36個(gè)月后，疾病停止發(fā)展的比率為82%，攜帶有BCL6重排的病例預(yù)后較好。 BCL6 基因斷裂與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤第九頁，共六十五頁。第十頁，共六十五頁。Offit, K. N Engl J Med, 1994. 331(2): p. 74-80.結(jié)果判讀第十一頁，共六十五頁。IGH/CCND1融合基因可見于95%的套細(xì)胞淋巴瘤，是套細(xì)胞淋巴瘤與其他淋巴瘤鑒別的重要指標(biāo)。IGH/CCND1融合基因-輔助診斷套細(xì)胞淋巴瘤。IGH/CC

5、ND1融合基因與套細(xì)胞淋巴瘤第十二頁，共六十五頁。l 正常細(xì)胞：兩個(gè)紅色信號，兩個(gè)綠色信號。l 異常細(xì)胞：一個(gè)紅色信號，一個(gè)綠色信號，兩個(gè)融合信號。第十三頁，共六十五頁。API2/MALT1基因檢測試劑盒 探針：GLP API2/GLP MALT1凋亡抑制因子2基因（apoptosis inhibitor-2,API2）,位于11號染色體;粘膜相關(guān)淋巴組織基因（Mucosa-associated lymphoid tissue 1 ,MALT1 ），位于18號染色體。 API2基因與MALT1基因的融合導(dǎo)致凋亡抑制的增加，引起細(xì)胞不依賴于抗原刺激的生存優(yōu)勢。 第十四頁，共六十五頁。 API2/

6、MALT1融合基因的檢測可以指導(dǎo)抗HP治療 胃MALT淋巴瘤與幽門螺旋桿菌（HP）感染導(dǎo)致的慢性胃炎有關(guān)，MALT1/API2融合基因陰性的患者抗HP治療有效，陽性患者抗HP治療無效。API2/MALT1融合基因檢測意義 第十五頁，共六十五頁。l 正常細(xì)胞：兩個(gè)紅色信號，兩個(gè)綠色信號。l 異常細(xì)胞：一個(gè)紅色信號，一個(gè)綠色信號，兩個(gè)融合信號。第十六頁，共六十五頁。BCL2/IGH重排發(fā)生在約80%-85%的FL患者中，檢測BCL2/IGH基因重排可以輔助診斷FL。 BCL2/IGH陰性的FL患者3年生存率為100%，而陽性者只有54%； 陰性者3年疾病無進(jìn)展為87.5%，而陽性者只有13%。 B

7、CL2/IGH融合基因與濾泡性淋巴瘤 BCL2/IGH融合基因-輔助診斷濾泡性淋巴瘤 BCL2/IGH融合基因-判斷預(yù)后第十七頁，共六十五頁。l 正常細(xì)胞：兩個(gè)紅色信號，兩個(gè)綠色信號。l 異常細(xì)胞：一個(gè)紅色信號，一個(gè)綠色信號，兩個(gè)融合信號。第十八頁，共六十五頁。結(jié)果判讀-陽性結(jié)果第十九頁，共六十五頁。結(jié)果判讀-陽性結(jié)果第二十頁，共六十五頁。 約80%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(8；14) （q24;q32）； 約15%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(2；8)(p11;q24)； 約5%發(fā)生t(8；22)（q24;q11）。 染色體易位導(dǎo)致C-MYC基因斷裂重組可能是伯基特淋巴瘤的一個(gè)標(biāo)志，可以應(yīng)用于臨

8、床上伯基特淋巴瘤的輔助診斷。C-MYC基因斷裂與伯基特淋巴瘤 輔助診斷伯基特淋巴瘤 第二十一頁，共六十五頁。第二十二頁，共六十五頁。結(jié)果判讀-陽性結(jié)果第二十三頁，共六十五頁。FISH技術(shù)在乳腺癌靶向治療應(yīng)用第二十四頁，共六十五頁。乳腺癌 Her-2基因 致癌基因：Her-2基因； 位點(diǎn)：17q11.2-q12； 編碼蛋白：跨膜蛋白（與 表皮生長因子受體部分同源）； 25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴(kuò)增； HER-2基因擴(kuò)增是決定Herceptin治療是否有效的關(guān)鍵性指標(biāo)。HER2擴(kuò)增的乳腺癌更具有侵襲性生長能力。第二十五頁，共六十五頁。乳腺癌Her-2基因及蛋白檢測Cerb-B-2 :3

9、+ 完全強(qiáng)膜陽性細(xì)胞30% 2+,1 +,- FISH檢測是否有基因擴(kuò)增第二十六頁，共六十五頁。Her2基因檢測流程石蠟組織標(biāo)本IHC檢測再用FISH方法檢測1+3+2+Herceptin治療+再用FISH方法檢測Herceptin治療FISH檢測+再用FISH方法檢測+第二十七頁，共六十五頁。A. 無須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號（高度擴(kuò)增）B. 顆粒狀信號（R10，高度擴(kuò)增）C. 須計(jì)數(shù)的顆粒狀信號（R=3.5，低度擴(kuò)增）ACBHer-2基因擴(kuò)增狀況第二十八頁，共六十五頁。30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜高強(qiáng)度著色免疫組化（3+）與FISH對比 40100浸潤性導(dǎo)管癌級IHC：+FISH：呈簇團(tuán)狀高度擴(kuò)增

10、100第二十九頁，共六十五頁。免疫組化（）與FISH擴(kuò)增陽性浸潤性導(dǎo)管癌級IHC：FISH：呈簇狀擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞不著色40100第三十頁，共六十五頁?；蛲蛔儥z測方法第三十一頁，共六十五頁。1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage) 2.變性梯度凝膠電泳(DGGE)3. 雜合雙鏈分析法(HA)4. 化學(xué)切割錯(cuò)配(CCM) 5.碳化二亞胺檢測(Carbodiimide,CDI) 6.酶促切割錯(cuò)配(Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) 7.單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (Single-Strand Conformation)8.切割片段長度多態(tài)性 9.DNA測序(Sequencin

11、g) 10.雙脫氧指紋圖譜法(Dideoxy Finger-printing, ddF)11.錯(cuò)配接合蛋白檢測 12.蛋白截短測試（protein truncation test）方法第三十二頁，共六十五頁。13.變性的高效液相色譜檢測(Denaturing High Performance Liguld Chromatography DHPLC) 14.DNA芯片技術(shù)(DNAchip) 15.等位基因特異性擴(kuò)增16.等位基因特異性寡核苷酸片段分析(Allele-Specific Oligonucleotide,ASO)17.引物延伸檢測(Primer Extension,PEX)18.寡核苷

12、酸連接檢測(Oligonucleotide Ligation Assay,OLA)19.限制性片段分析(Restriction Fragment Analysis）20.突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR）21.蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpions amplification refractory mutation system）第三十三頁，共六十五頁。肺癌組織EGFR基因擴(kuò)增和突變檢測及其臨床意義第三十四頁，共六十五頁。研究背景研究顯示吉非替尼對部分晚期NSCLC患者的治療效果非常顯著。存在EGFR基因突變的患者更有可能對吉非替尼的治療敏感。 存在EGFR基因

13、擴(kuò)增的肺癌、腸癌病人對分子靶點(diǎn)藥物更為敏感。檢測大腸癌有無EGFR過度表達(dá)，只要1%的癌細(xì)胞的胞膜強(qiáng)陽性染色即判斷為3+，可作為應(yīng)用西妥昔單抗的指征。第三十五頁，共六十五頁。 FISH檢測EGFR基因擴(kuò)增標(biāo)本類型：石蠟包埋組織（手術(shù)、活檢、穿刺） 冰凍組織 胸、腹水沉渣細(xì)胞 探針類型：GLP EGFR / CSP7 定量PCR檢測EGFR基因突變分型 突變類型： 19 exon （2235-2249位點(diǎn)）15bp缺失突變 19 exon （2240-2257位點(diǎn)）18bp缺失突變 19 exon （2240-2251位點(diǎn)）12bp缺失突變 21 exon 2573位點(diǎn)TG堿基置換突變 21 e

14、xon 2582位點(diǎn)TG堿基置換突變 EGFR基因變異檢測第三十六頁，共六十五頁。第三十七頁，共六十五頁。雙體性三體性多體性擴(kuò) 增EGFR基 因 FISH 檢 測 狀 況肺癌石蠟第三十八頁，共六十五頁。第三十九頁，共六十五頁。 FQ-PCR分型技術(shù)檢測EGFR突變第四十頁，共六十五頁。存在EGFR突變肺癌樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖71例肺癌組織中檢測出6例突變樣本第四十一頁，共六十五頁。FQ-PCR 檢測15bp缺失陽性病例結(jié)果 紅色閾值線以上的擴(kuò)增曲線即為陽性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，按熒光信號值的高低依次為 9號、12號、13號、55號、38號和33號標(biāo)本 第四十二頁，共六十五頁。15bp缺失突變型DN

15、A的測序圖 senseantisense第四十三頁，共六十五頁。紅色閾值線以上的擴(kuò)增曲線即為陽性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，按熒光信號值的高低依次為2號、36號、和40號標(biāo)本 FQ-PCR 檢測18bp缺失陽性病例結(jié)果第四十四頁，共六十五頁。 目前K-RAS突變檢測常用技術(shù)第四十五頁，共六十五頁。方法直接測序焦磷酸測序高分辨率熔解曲線PCR-RFLP芯片雜交Real-Time PCR第四十六頁，共六十五頁。腫瘤組織的確認(rèn)和篩選顯微切割腫瘤提取DNA相應(yīng)的PCR反應(yīng)或雜交相關(guān)的分析和檢測K-ras突變檢測基本流程圖第四十七頁，共六十五頁。直接測序(Direct Sequencing)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物直接測序

16、雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger法) DNA 片段是熒光標(biāo)記的，這些片段經(jīng)過平板膠電泳或毛細(xì)管電泳得到分離，熒光分子被激發(fā)而發(fā)光，發(fā)出的光信號被檢測系統(tǒng)檢測 第四十八頁，共六十五頁。第四十九頁，共六十五頁。K-ras突變檢測結(jié)果第五十頁，共六十五頁。療效預(yù)測標(biāo)志物與預(yù)后判斷標(biāo)志物療效預(yù)測標(biāo)志物：能夠預(yù)測某種特定治療方式療效的標(biāo)記物KRAS基因突變導(dǎo)致腫瘤對EGFR抑制劑抵抗預(yù)后判斷標(biāo)志物：在不考慮治療因素的情況下能夠判斷患者結(jié)局的標(biāo)記物18號染色體長臂（18q）缺失 某些分子標(biāo)志物兼具兩種作用胸腺嘧啶合成酶（Thymidylate synthase）第五十一頁，共六十五頁。EGFR 作為預(yù)后

17、因子的價(jià)值EGFR expression correlates with poor prognosisDFS = Disease-free survival; OS = overall survival第五十二頁，共六十五頁。Cetuxamab(西妥昔單抗)人源化嵌合單抗（ IgG1 ）靶向作用于表皮生長因子受體（EGFR）阻斷EGF 和TGF與EGFR 的結(jié)合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的腫瘤生長200年獲得FDA審批資格治療結(jié)直腸癌Panitumumab（帕尼單抗）完全人源化單克隆抗體(IgG2)靶向作用于表皮生長因子受體（EGFR）2005年7月獲得FDA快速通道審批資格治療結(jié)直腸癌結(jié)直腸

18、癌分子靶向治療藥物 第五十三頁，共六十五頁。KRAS 突變KRAS 突變可不依賴EGFR受體途徑，自行激活RAS/MAPK 通路導(dǎo)致ERBITUX 耐藥KRAS 突變與Erbitux療效及患者生存相關(guān)KRAS 突變并非孤立事件KRAS 突變常伴隨BRAF突變，并與 CpG 島甲基化表型(CIMP)1,2相關(guān)KRAS 突變常伴隨 PI3K 突變3 Livre A, et al. J Clin Oncol 2008;26:374379MAPK = mitogen-activated protein kinase第五十四頁，共六十五頁。K-ras基因野生型患者能從這類藥物治療中獲益。 K-ras基因

19、突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益,反而徒增不良反應(yīng)危險(xiǎn)和治療費(fèi)用；抗EGFR治療和K-ras突變相互排斥K-ras基因抗EGFR治療關(guān)系密切第五十五頁，共六十五頁。2009年7月FDA批準(zhǔn)了對西妥昔單抗和帕尼單抗說明書標(biāo)簽的修改： 結(jié)直腸癌分子靶向治療藥物 注明KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者不推薦這使用這兩種用藥物。 第五十六頁，共六十五頁。 K-ras基因突變: 20-60%結(jié)直腸癌 K-ras基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早期，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的K-ras基因高度保持一致K-ras基因突變第五十七頁，共六十五頁。 NCCN臨床實(shí)踐指南指南明確指出所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者 都應(yīng)檢測K-ras基因狀態(tài)。 美國美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)推薦把K-ras基因突變檢測作為 結(jié)直腸癌患者接受EGFR單抗治療的預(yù)測指標(biāo)。 歐盟藥品審評管理局規(guī)定：cetuximab 及panitumumab 用于mCRC的治療前，患者必須確定為K-ras野生型。K-ras與結(jié)直腸癌治療第五十八頁，共六十五頁。結(jié)直腸癌（CRC）缺乏EGFR基因突變對愛必妥單藥治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）臨床