腸出血性大腸桿菌O104H4檢測技術(shù)課件

1、腸出血性大腸桿菌EHEC O104:H4檢測技術(shù)海淀疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科 2012年3月26日腸出血性大腸桿菌正常菌群，一般不致病條件致病某些帶有致病基因的血清型，引起腸道感染。可引起腹瀉的大腸桿菌稱為腸道致病性大腸桿菌或致瀉性大腸桿菌。細(xì)菌居住部位改變引起的腸外感染：尿路感染最常見致病菌株大腸桿菌正常菌群，一般不致病條件致病某些帶有致病基因的血清型，引起腸H抗原(鞭毛)O抗原(LPS側(cè)鏈)K抗原(莢膜)F抗原(菌毛)復(fù)雜的抗原構(gòu)造H抗原O抗原K抗原F抗原復(fù)雜的抗原構(gòu)造腸道致病性大腸桿菌分類目前根據(jù)毒力因子、致病機(jī)理和流行病學(xué)特征，通常將腸道致病型大腸桿菌分為5 類：腸致病性大腸桿菌（

2、EPEC）腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）腸集聚性大腸桿菌（EAEC）腸出血性大腸桿菌（EHEC）腸道致病性大腸桿菌分類目前根據(jù)毒力因子、致病機(jī)理和流行病學(xué)菌株EPECETEC作用部位小腸小腸所致疾病嬰兒腹瀉旅行者腹瀉嬰幼兒腹瀉致病機(jī)理粘附和破壞上皮細(xì)胞腸毒素EIECEAECEHEC大腸小腸大腸較大兒童或成人痢疾樣腹瀉急慢性腹瀉出血性結(jié)腸炎侵襲和破壞結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞集聚性粘附上皮細(xì)胞志賀毒素腸道致病性大腸桿菌引起的腹瀉菌株作用部位所致疾病嬰幼兒腹瀉致病機(jī)理EIEC大腸較大兒童或腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic Escherichia coli, EPE

3、C）致病機(jī)制：LEE毒力島和EAF質(zhì)粒（編碼束狀菌毛）病原菌在十二指腸、空腸和回腸上段粘膜表面大量繁殖，粘附于微絨毛，導(dǎo)致刷狀緣被破壞、微絨毛萎縮、上皮細(xì)胞排列紊亂和功能受損 （A/E損傷），造成嚴(yán)重腹瀉。腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic Esch腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC）典型EPEC（含有LEE 和70100kb 的大毒力質(zhì)粒EAF）是發(fā)展中國家引起嬰幼兒特別是06個(gè)月嬰兒腹瀉的主要病原菌，在某些發(fā)展中國家EPEC引起的嬰兒腹瀉可達(dá)3040%。上世紀(jì)4050年代之前，EPEC常引起發(fā)達(dá)國家嬰幼兒腹瀉的暴

4、發(fā)；非典型EPEC（含有LEE但不含毒力質(zhì)粒EAF）是發(fā)達(dá)國家引起腹瀉的重要病原菌，并能引起發(fā)達(dá)國家嬰幼兒和成人的腹瀉暴發(fā)。非典型EPEC感染引起的腹瀉通常持續(xù)時(shí)間更長，可超過14天。典型EPEC的儲(chǔ)存宿主主要是人，而非典型EPEC人和動(dòng)物都可作為儲(chǔ)存宿主。腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic Esch腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）致病機(jī)制：腸毒素和定植因子腸毒素有不耐熱腸毒素（heat labile enterotoxin, LT）和耐熱腸毒素（heat stable enterotoxin, ST）兩種。LT與

5、腺苷環(huán)化酶作用，使胞內(nèi)cAMP水平增高，導(dǎo)致腸粘膜細(xì)胞內(nèi)水、鈉、氯等過度分泌至腸腔，導(dǎo)致腹瀉；而ST通過激活腸粘膜細(xì)胞上的鳥苷環(huán)化酶，使胞內(nèi)cGMP升高而導(dǎo)致腹瀉。腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic Esche腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive Escherichia coli, EIEC）致病機(jī)制：侵襲性大質(zhì)粒與志賀菌相似。細(xì)菌經(jīng)消化道進(jìn)入大腸后，穿過粘液層，粘附到腸上皮細(xì)胞上，引起細(xì)胞內(nèi)吞，被帶入細(xì)胞內(nèi)空泡中。其毒力主要表現(xiàn)在能使空泡破壞，細(xì)菌進(jìn)入上皮細(xì)胞胞漿中增殖，最后殺死細(xì)胞，再擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞，導(dǎo)致組織破壞和隨后的炎癥發(fā)生。腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinv

6、asive Escher腸集聚性大腸桿菌（Enteroaggregative Escherichia coli, EAEC）致病機(jī)制：毒素和粘附素毒 素 包 括 腸 集 聚 耐 熱 毒 素 （ enteroaggregative heat-stabletoxin, EAST）和不耐熱毒素（plasmid encoding toxin，Pet），可導(dǎo)致大量液體分泌。細(xì)菌通過集聚性粘附菌毛粘附于腸粘膜上皮細(xì)胞，在細(xì)胞表面聚集，形成磚狀排列。腸集聚性大腸桿菌（Enteroaggregative Esc腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）

7、致病機(jī)制：志賀毒素和LEE毒力島EHEC產(chǎn)生的毒素能使vero細(xì)胞產(chǎn)生病變，故稱vero毒素；又因與志賀菌的毒素在生物學(xué)特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦 稱 志 賀 樣 毒 素 （ shiga-like toxin ， SLT ） 或 志 賀 毒 素 Stx ；EHEC的Stx分兩型，Stx1與痢疾志賀菌的ST基本相同，可被抗志賀菌抗毒素中和。Stx2則與ST有60%的同源，Stx2目前發(fā)現(xiàn)有多種亞種。兩型毒素均由溶原性噬菌體介導(dǎo)。腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Esc腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）

8、O157:H7 是EHEC 的主要血清型，此外還包括O26 、O111 、O103、O113、O117、O128等四十多個(gè)血清型。由EHEC O157:H7引起的大暴發(fā)：1982年美國首次報(bào)道大腸桿菌O157:H7引起出血性腸炎。1996年日本報(bào)告一起學(xué)校兒童的暴發(fā)疫情，病例7470例，住院病例近千例，有約100病例并發(fā)HUS，死亡3例。1999年我國蘇皖等地發(fā)生了大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉的暴發(fā)，估計(jì)2萬人感染，195例HUS，死亡177人。2006年美國暴發(fā)一起由污染的包裝菠菜造成的暴發(fā)，具有高的住院率（50%）和HUS（16%）。腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic

9、 Esc腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）臨床表現(xiàn)：EHEC O157:H7感染的潛伏期是34天，但在某些暴發(fā)中可以長達(dá)58天或短至12天。我國暴發(fā)流行的地區(qū)最短潛伏期為8小時(shí)，平均為15天。臨床表現(xiàn)主要有：腹部絞痛和輕度腹瀉，一些病例為血性腹瀉（出血性腸炎）。多數(shù)病人10天內(nèi)康復(fù)，少數(shù)病人特別是幼兒和老年人，可出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，如以急性腎功能衰竭、溶血性貧血和血小板減少為特點(diǎn)的溶血尿毒綜合癥（HUS）。一般5%10%的EHEC感染者可發(fā)展為溶血尿毒綜合癥，病例死亡率為3%至5%。腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagi

10、c Esc腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）STEC， Shiga toxin- producing Escherichia coli人們把產(chǎn)生志賀毒素的大腸桿菌統(tǒng)稱為STEC 。相對(duì)來說，STEC 的 范 圍 大 一 些 , EHEC 覆 蓋 的 范 圍 小 一 些 。 STEC 包 括EHEC, EHEC只是STEC的一部分。并不是所有的產(chǎn)Stx毒素的大腸桿菌都能引起出血性腸炎或溶血性尿毒綜合癥。腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic EscEHEC O104:H4德國腸出血性大腸桿菌O104:H4暴發(fā)疫情20

11、11 年5 月初，德國暴發(fā)了規(guī)模較大的腸出血性大腸桿菌疫情，隨后波及法國、瑞典、美國、加拿大等16個(gè)國家。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，自2011 年5月1 日至7 月7 日共計(jì)報(bào)告3941 例EHEC O104:H4 感染病例，死亡48 例，其中909 例發(fā)生溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome, HUS)，死亡36例；腸出血性大腸桿菌腸炎3032 例，死亡16 例。是德國迄今最嚴(yán)重的一次EHEC 疫情， 也是世界范圍內(nèi)造成HUS 重癥病例最多的一次致病大腸桿菌暴發(fā)。EHEC O104:H4德國腸出血性大腸桿菌O104:H4暴EHEC O104:H4德國腸出血

12、性大腸桿菌O104:H4暴發(fā)疫情臨床特點(diǎn)：HUS發(fā)生率（510%）死亡率（35%）年齡：89% (HUS) 為20歲以上成年人88% (EHEC)（WHO，6月6日）性別：70% (HUS) 為女性62% (EHEC)（WHO，6月6日）感染來源：黃瓜、西紅柿、豆芽？EHEC O104:H4德國腸出血性大腸桿菌O104:H4暴EHEC O104:H4感染流行大事記（2011）5月15日，德國一位83歲婦女，因血樣便腹瀉就診。5月21日，德國15日因血樣便腹瀉就診的83歲婦女死亡，實(shí)驗(yàn)室檢查確診為感染大腸桿菌。5月25日，德國EHEC參考實(shí)驗(yàn)室在5例患者糞便樣本中，發(fā)現(xiàn)EHEC的血清型為O104

13、。5月26日，德國懷疑受感染的蔬菜來自西班牙5月31日，德國衛(wèi)生官員公布了實(shí)驗(yàn)室初步檢測結(jié)果，稱西班牙黃瓜未檢出引發(fā)“毒蔬菜”事件的EHEC菌株，德國當(dāng)局宣布拓寬EHEC污染源警示。西班牙境內(nèi)的瓜果類蔬菜價(jià)格一落千丈,正考慮對(duì)德國的錯(cuò)誤警告采取法律行動(dòng)。EHEC O104:H4感染流行大事記（2011）5月15日EHEC O104:H4感染流行大事記（2011）6月5日，德國懷疑下薩克森州芽苗菜是腸病疫情傳染源。6月6日，德國下薩克森州農(nóng)業(yè)部宣布，對(duì)被疑是本次EHEC疫情傳染源的芽苗菜的初步抽樣檢查，并沒有發(fā)現(xiàn)致病菌。6月10日，德國國家疾病控制中心羅伯特科赫研究所等多家機(jī)構(gòu)在柏林表示，他們發(fā)

14、現(xiàn)，這些顧客中感染EHEC的患者都吃了帶有生芽苗菜的食物，食用芽苗菜者患病的幾率是未食用者的9倍。他們已確認(rèn)豆芽等芽苗菜是造成此次EHEC疫情的源頭。EHEC O104:H4感染流行大事記（2011）6月5日，EHEC O104:H4感染流行大事記（2011）7月4日，德國表示各種流行病學(xué)的統(tǒng)計(jì)參數(shù)顯示，歷時(shí)近兩個(gè)月的德國EHEC疫情目前已接近尾聲。這是德國迄今最嚴(yán)重的一次EHEC疫情，也是世界范圍內(nèi)造成HUS重癥病例最多的一次致病大腸桿菌暴發(fā)。EHEC O104:H4感染流行大事記（2011）EHEC O104:H4德國腸出血性大腸桿菌O104:H4暴發(fā)疫情菌株特點(diǎn)（Robert Koch

15、Institute）：血清型O104:H4Shigatoxin 1: -Shigatoxin 2 (vtx2a) : +Intimin (eae) : -Enterohemolysin : -aatA-PCR:aggR-PCR:+aap-PCR:aggA-PCR:aggC-PCR:+EHECEAECenteroaggregative Verocytotoxin-producingE. coli (EAggEC VTEC) O104:H4EHEC O104:H4Shigatoxin 2 (EHEC O104:H4檢測技術(shù)流程不同種類標(biāo)本增菌6小時(shí)*PCR 檢 測 eaeA 、 ehxA 、agg

16、R、wzy、fliC基因*細(xì)菌分離培養(yǎng)可疑菌落革蘭染色系統(tǒng)生化鑒定血清型鑒定毒力基因檢測分子分型結(jié)果判定和上報(bào)提取核酸PCR檢測stx1和stx2基因stx1和/或stx2陽性EHEC O104:H4檢測技術(shù)流程不同種類標(biāo)本增菌6小時(shí)*腸出血性大腸桿菌O104:H4病例定義1. 疑似病例。發(fā)病前10天內(nèi)曾在EHEC O104:H4流行地區(qū)旅行或居住，或者發(fā)病前10天內(nèi)與臨床診斷/確診病例有密切接觸，且符合下列條件之一者：（1）有血性腹瀉或腹部痙攣性疼痛等癥狀，無實(shí)驗(yàn)室證據(jù)診斷為其他非EHEC O104:H4感染者；（2）有微血管病性溶血性貧血（外周血涂片破碎紅細(xì)胞2）、血小板減少、腎臟受累（血

17、尿、蛋白尿、急性腎損傷）等HUS臨床表現(xiàn)者。2. 確診病例。疑似病例具備下列二項(xiàng)之一者:（1）從糞便標(biāo)本中分離到EHEC O104:H4菌株, stx1和/或stx2基因檢測陽性；（2）從糞便標(biāo)本中檢測到stx1和/或stx2基因陽性，同時(shí)aggR、wzy(O104)和fliC (H4)基因檢測全部陽性。腸出血性大腸桿菌O104:H4病例定義1. 疑似病例。發(fā)病前毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法1、stx1slt-1-a：slt-1-b:5-CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG-35-CACCAGACAATGTAACCGCTG-3PCR反應(yīng)體系(20l)：2l1l1l1l0.2l1

18、l13.8l10PCR Buffer (含Mg2+ )slt-1-a引物 (10M)slt-1-b引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2OPCR反應(yīng)條件：94 3min94 30sec60 30sec 30循環(huán)72 45sec72 5minMstx12000bp1000bp750bp500bp250bp100bp348bp毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法slt-1-a：5-毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法2、stx2slt-2-a：slt-2-b:5-ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG-35-GCGTCATCGTATAC

19、ACAGGAGC-3PCR反應(yīng)體系(20l)：2l1l1l1l0.2l1l13.8l10PCR Buffer (含Mg2+ )slt-2-a引物 (10M)slt-2-b引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2OPCR反應(yīng)條件：94 3min94 30sec56 30sec 30循環(huán)72 45sec72 5minMstx22000bp1000bp750bp500bp250bp100bp589bp毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法slt-2-a：5-毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法3、eaeAeaeA-a：eaeA-b:5-ATTACC

20、ATCCACACAGACGGT-35-ACAGCGTGGTTGGATCAACCT-3PCR反應(yīng)體系(20l)：2l1l1l1l0.2l1l13.8l10PCR Buffer (含Mg2+ )eaeA-a 引物 (10M)eaeA-b 引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2OPCR反應(yīng)條件：94 3min94 30sec56 30sec 30循環(huán)72 45sec72 5minMeaeA2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp397bp毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法eaeA-a：5-A毒力基因/抗原特異性基因PCR

21、檢測方法4、ehxAMFS-1Fb：MFS-1R：5-CCAGGAGAAGAAGTTAGAG -35-CTTCACGTCACCATACATAT-3PCR反應(yīng)體系(20l)：2l1l1l1l0.2l1l13.8l10PCR Buffer (含Mg2+ )MFS-1Fb 引物 (10M)MFS-1R 引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2OPCR反應(yīng)條件：94 3min94 30sec56 30sec 30循環(huán)72 45sec72 5minMehxA2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp369bp毒力基因/抗原特異性基因

22、PCR檢測方法MFS-1Fb：5-毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法5、aggRaggR-F：aggR-R:5-GTATACACAAAAGAAGGAAGC-35-ACAGAATCGTCAGCATCAGC-3PCR反應(yīng)體系(20l)：10PCR Buffer (含Mg2+ )aggR-F 引物 (10M)aggR-R引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)2l1l1l1l0.2l1l13.8lDNA模板dH2OPCR反應(yīng)條件：94 3min94 30sec56 30sec 30循環(huán)72 45sec72 5minMaggR2000bp1000bp750bp50

23、0bp250bp100bp254bp毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法aggR-F：5-G毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法6、aatAaatA-F： 5-TATATTGAAATGCTTAGTGAGAG -3aatA-R:5-CTGATACCCAGACTAGCACT-3PCR反應(yīng)體系(20l)：10PCR Buffer (含Mg2+ )aatA-F 引物 (10M)aatA-R引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2O2l1l1l1l0.2l1l13.8lPCR反應(yīng)條件：94 3min94 30sec56 30sec 30循環(huán)72 45

24、sec72 5minMaatA2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp510bp毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法aatA-R:5-C毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法7、aapaap-F：5-ATGAAAAAAATTAA GTTTGTTATCTT-3aap-R： 5-TTATTTAACCCATTCG GTTAGAGC-3PCR反應(yīng)體系(20l)：10PCR Buffer (含Mg2+ )aap-F 引物 (10M)aap-R引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2O2l1l1l1l0.2l1l13.8lPCR反應(yīng)條件：94 3min94 30sec56 30sec 30循環(huán)72 45sec72 5minMaap2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp356bp毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法aap-F：5-AT毒力基因/抗原特異性基因PCR檢測方法8、wzywzy-F：wzy-R:5-AGTTCATTAGATCGAGGTT-35-CTCCTTGCAAATGTGCAA-3PCR反應(yīng)體系(20l)：10PCR Buffer