弱反應(yīng)性標(biāo)本結(jié)果處理及報(bào)告課件

1、免疫試驗(yàn)弱反應(yīng)性標(biāo)本處理及結(jié)果報(bào)告皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院 浦 春免疫測定弱反應(yīng)性(弱陽性)的 來源臨床標(biāo)本原因CUT-OFF值的設(shè)定一. 臨床標(biāo)本原因 可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果的標(biāo)本因素內(nèi)源性干擾因素：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、治療性抗體、溶菌酶等外源性干擾因素：溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過長、凝固不全等 （一）內(nèi)源性干擾因素 類風(fēng)濕因子干擾的排除稀釋標(biāo)本改變酶標(biāo)抗體用變性IgG預(yù)先封閉標(biāo)本中RF測抗原,可加入還原劑如2-巰基乙醇去除RF使用特異的雞抗體IgY作為酶標(biāo)或固相抗體 2.補(bǔ)體干擾固相抗體和酶標(biāo)二抗可因?yàn)槠湓诠滔辔郊敖Y(jié)合過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，從而其Fc

2、段的補(bǔ)體C1q結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，這樣C1q就成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。固相抗體也會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合，封閉抗體的抗原表位結(jié)合能力，而引起假陰性結(jié)果或使定量測定結(jié)果偏低。 3.異嗜性抗體的干擾天然的異嗜性抗體（IgG）可分為兩類:一類（85%的假陽性由其引起）可結(jié)合于山羊、小鼠、大鼠、馬和牛IgG的Fab區(qū)域，但不與兔IgG的Fab區(qū)結(jié)合。另一類（15%的假陽性由其引起）可結(jié)合于小鼠、馬、牛和兔IgG的FC區(qū)表位，但不與山羊和大鼠IgG的FC區(qū)表位結(jié)合。異嗜性抗體可通過交聯(lián)固相和酶標(biāo)的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。 異嗜性抗體干擾的排除使用特異的兔F(ab)2片段作為固相

3、或酶標(biāo)抗體。在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過量的動(dòng)物Ig，封閉可能存在的異嗜性抗體。但加入量不足或亞類不同時(shí)無效。使用靶特異的非Ig親和蛋白（Affibody）替代固相或酶標(biāo)抗體之一。采用噬菌體展示技術(shù)展示來自單個(gè)金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）聯(lián)合文庫的人IgA結(jié)合親和蛋白，用于IgA的測定，不受異嗜性抗體的影響。使用特異的雞抗體作為固相和測定抗體。 4.抗鼠Ig 抗體的干擾 抗鼠抗體對(duì)使用鼠源性單克隆抗體的酶免疫測定，可產(chǎn)生假陽性結(jié)果 5.溶菌酶干擾溶菌酶可與等電點(diǎn)較低的蛋白有強(qiáng)的結(jié)合能力。免疫球蛋白等電點(diǎn)約為5，因此，在雙抗體夾心法ELISA測定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶標(biāo)的IgG間形成橋接

4、，從而導(dǎo)致假陽性。 溶菌酶干擾的排除為保證ELISA測定的可靠性，有必要從標(biāo)本中去除溶菌酶或?qū)⑵浞忾]，Cu2+離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶，防止其聯(lián)接IgG。 1.標(biāo)本溶血 注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅蛋白，有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。 2.標(biāo)本被細(xì)菌污染細(xì)菌的生長，其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用細(xì)菌的內(nèi)源性酶會(huì)對(duì)測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。 3.標(biāo)本貯存時(shí)間過長 標(biāo)本在28下保存時(shí)間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法E

5、LISA測定中會(huì)導(dǎo)致本底過深、甚至造成假陽性。血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在28下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時(shí)間保存，應(yīng)在70以下。 4.標(biāo)本凝固不全 血液采集后，血液通常在半小時(shí)后開始凝固，1824h完全凝固。日常檢驗(yàn)中，常在血液還未開始凝固時(shí)即離心分離血清，此時(shí)因血液沒有完全凝固，離出的“血清”并非為完全的血清，其中仍殘留部分纖維蛋白原，如將其加入微孔中，在ELISA測定過程中仍可以形成肉眼可見的纖維蛋白，易造成假陽性結(jié)果血液標(biāo)本采集后，應(yīng)使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?二. CUT-OFF值 1.相關(guān)的基

6、本概念2.CUT-OFF值與“灰區(qū)”3.結(jié)果的報(bào)告基本概念標(biāo)準(zhǔn)差適用于正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)差（SD），不能泛泛地用于酶免疫測定結(jié)果的判定。這是因?yàn)殛幮詤⒖佳宓拿该庖邷y定值的分布常為非正態(tài)分布，呈一正向偏斜?；靖拍钭儺愊禂?shù)重復(fù)性（Reproducibility）：一般通過重復(fù)兩次測定樣本來觀察。測定下限（Detectability）：是指超過零劑量精密度的最低抗原濃度，可通過 t 分布（一邊拖尾，因?yàn)榇藭r(shí)曲線只有上升趨勢(shì)）計(jì)算在測定下限時(shí)的吸光度值的均值差。測定敏感性（Sensitivity): 是指一實(shí)驗(yàn)的測定反應(yīng)對(duì)待測物質(zhì)濃度變化的改變。 基本概念陽性結(jié)果的可靠性（預(yù)示值）即測定為陽性的標(biāo)本實(shí)

7、際上為陽性的可能性。 =真陽性/（真陽性+假陽性） 100%陰性結(jié)果的可靠性則為一份給出陰性結(jié)果的樣本實(shí)際上為陰性的可靠性。 = 真陰性/（真陰性+假陰性） 100% 結(jié)果報(bào)告需了解的概念一般要考慮的問題: 測定下限 (detection limits) 陽性判定值 (Cut-off values) 敏感性 (Sensitivity) 特異性 (Specificity) 符合率(功效率) (Efficiency) 金標(biāo)準(zhǔn)(“Gold standards”) 2.定性免疫測定的CUT-OFF值 “灰區(qū)”的計(jì)算“灰區(qū)”的范圍可通過計(jì)算相應(yīng)于這些Cut-off值的u統(tǒng)計(jì)值（假設(shè)為正態(tài)分布）而得到。例

8、如，陰性血清的Cut-off值0.11相應(yīng)于陽性血清測定值分布的均值2.21SD，于是，一個(gè)t2.21相應(yīng)于95.4的可信限，因此可疑區(qū)域?yàn)?4.1；同樣，陽性血清的Cut-off值0.08相應(yīng)于陰性血清測定值分布的均值+1.058SD，可得陰性的“灰區(qū)”為14.0。 選擇CUT-OFF值的標(biāo)準(zhǔn) （Galen Gambino建議）敏感性最高: 疾病嚴(yán)重，希望不要漏檢，疾病可治，出現(xiàn)假陽性結(jié)果不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心理或經(jīng)濟(jì)問題，治療不當(dāng)后果不嚴(yán)重。特異性最高：疾病嚴(yán)重但不可治，漏檢無心理或公共衛(wèi)生問題，或假陽性結(jié)果可能引起嚴(yán)重的心理或經(jīng)濟(jì)問題（如抗HIV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)）。高預(yù)示值：在不適當(dāng)治療會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果

9、時(shí)。高符合率：疾病嚴(yán)重但可治，假陽性或假陰性結(jié)果同等嚴(yán)重時(shí)。要在上述指標(biāo)之間達(dá)到一個(gè)適當(dāng)平衡，試劑研制需檢測三個(gè)人群的樣本：感染者、健康者、其他疾?。ǚ翘囟膊「腥菊撸┱?。 確定CUT-OFF值的方法一： 標(biāo)準(zhǔn)差比率法預(yù)先假定一個(gè)cut-off值，然后測定大量的標(biāo)本，將測定反應(yīng)如吸光度（OD）值大于此假定cut-off值的棄掉計(jì)算余下的測定反應(yīng)的均值（M1）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD1），再將超出M1+5 SD1的測定值棄去；最后計(jì)算余下的測定值的均值（M2）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD2），以M2+2 SD2作為測定的cut-off值。 確定CUT-OFF值的方法二： 均值2或3個(gè)SD法首先測定大量（數(shù)千）正常人血清

10、樣本，然后將所得到的吸光度均值2或3個(gè)SD作為陽性判斷值 確定CUT-OFF值的方法三： 綜合陰陽性測定值法如測定值為正態(tài)分布，則根據(jù)u檢驗(yàn)，以單側(cè)99.5%的可信限先分別確定陰性和陽性的Cut-off值；如為非正態(tài)分布，則百分位數(shù)法單側(cè) 95或99來確定Cut-off值。 確定CUT-OFF值的方法四： 綜合考慮加轉(zhuǎn)化血清盤法 ROC曲線在Cut-off值設(shè)定中的應(yīng)用 ROC是英文Receiver Operating characteristic的縮寫，可直譯為接收機(jī)工作特性，其最初主要是用于雷達(dá)領(lǐng)域。在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域內(nèi)，ROC不僅可用于不同檢驗(yàn)方法之間的比較，而且可用于對(duì)檢驗(yàn)項(xiàng)目臨床準(zhǔn)確

11、性的評(píng)價(jià)以及決定正常和異常的分界點(diǎn)。 ROC曲線描述的是：真陽性率(TPR)（又稱靈敏度）=真陽性數(shù)/(真陽性+假陰性) 假陽性率(FPR)=假陽性數(shù)/(假陽性+真陰性) ； 以FPR為橫坐標(biāo)、TPR為縱坐標(biāo)所作出來的一條曲線 根據(jù)這種關(guān)系，可確定區(qū)分正常與異常的分界點(diǎn)究竟在何處最為合適，也就是說此時(shí)的假陽性和假陰性率最低或比例最為適當(dāng)或最為符合使用目的。因此，當(dāng)然就可以用于ELISA測定Cut-off值的確定。但注意血站與臨床應(yīng)用應(yīng)有所區(qū)分，血站應(yīng)更嚴(yán)格（一般為臨床Cut-off值50%）。ROC曲線應(yīng)用（確定Cut-off值） 定性測定結(jié)果的確定定性測定結(jié)果確定的依據(jù)在于陽性陰性判定值（C

12、ut-off）的建立， Cut-off 值的確立應(yīng)盡可能地避免假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。除了 Cut-off 值以外，還有許多其它的設(shè)值方法以判斷陰性和陽性結(jié)果，如S/N（常稱為P/N）比值（Ratio）等。 CUT-OFF值的不確定性可致假陽性 3. 測定結(jié)果的報(bào)告酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的報(bào)告在理想情況下應(yīng)達(dá)到下述要求（至少）: (1)易于讓不熟悉該試驗(yàn)的人所理解; (2)定性測定必須結(jié)果明確,即陽性或陰性，在正常范圍內(nèi)或不正常等；（3）數(shù)據(jù)的可重復(fù)性； 結(jié)果報(bào)告和解釋陰性或陽性的概念問題？ 試驗(yàn)解釋 臨床解釋 reactive 有反應(yīng)性 陽性 nonreactive 無反應(yīng)性 陰性 臨界結(jié)果（灰

13、度區(qū)）的處理重要的是建立進(jìn)一步檢測的程序： 標(biāo)本的重復(fù)檢測 第二份標(biāo)本的檢測 數(shù)周或數(shù)月后采取樣本檢測 可能的話，用另一個(gè)更敏感特異的 方法（確認(rèn)試驗(yàn)）檢測 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中和試驗(yàn)：如HBsAg檢測加HBsAb重組免疫印跡（RIBA）reconbinant immunoblot assay 蛋白印跡（WB） 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)(confirmatonry test)特異性應(yīng) 98-99%可為非免疫學(xué)（如培養(yǎng)或核酸檢測）或免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法包括蛋白印跡、抗原或抗體封閉阻斷試驗(yàn)如果一個(gè)檢測方法特異性很高或高陽性預(yù)示值，則不必進(jìn)行確認(rèn)。 結(jié)果的報(bào)告認(rèn)真閱讀試劑盒說明書，按照其要求報(bào)告結(jié)果如出現(xiàn)臨界結(jié)果，應(yīng)明確是否需對(duì)患者進(jìn)一步追蹤觀察清楚說明結(jié)果對(duì)特定疾病診斷意義（可能性高或不可能）和/或需進(jìn)一步檢測。如果已在進(jìn)行進(jìn)一步的檢測，應(yīng)在報(bào)告中予以說明 結(jié)果的解釋結(jié)果解釋的責(zé)任屬于臨床實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)根據(jù)所檢測的人群解釋結(jié)果。臨床解釋的責(zé)任屬于