宮頸癌篩查技術(shù)HPV檢測(cè)培訓(xùn)課件

1、 一、HPV12+2檢測(cè)的意義及臨床應(yīng)用 一、HPV12+2檢測(cè)的意義及臨床應(yīng)用2HPV的型別目前已發(fā)現(xiàn)超過200種型別的人乳頭瘤病毒（HPV）。依據(jù)與生殖道腫瘤相關(guān)性，將HPV分為： 低危型 常引起外生殖道濕疣等良性病變；6、11、42、43、44等。 高危型 與子宮頸癌及子宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN2/3）的發(fā)生相關(guān)；16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等。2HPV的型別目前已發(fā)現(xiàn)超過200種型別的人乳頭瘤病毒（HPHPV分型檢測(cè)的意義（1）預(yù)測(cè)受檢者發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)度，確定最佳的治療時(shí)期Gary M. Clifford et al ; Cancer Epid

2、emiol Biomarkers Prev 2005;14(5):115764提示：不同的高危型促進(jìn)LSIL（低度鱗狀上皮內(nèi)病變）向SCC（鱗狀細(xì)胞癌）轉(zhuǎn)變的能力有差異。 HPV16，18 的致宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)性大于其他高危型HPV。 HPV分型檢測(cè)的意義（1）預(yù)測(cè)受檢者發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)度，確定最佳基線篩查細(xì)胞學(xué)陰性/高危HPV陽(yáng)性的女性10年內(nèi)CIN3病變的累積發(fā)病率Khan MJ, et al. J Natl Cancer Inst 2005; 97:10721079.Follow-up time (months)Other high-risk HPV+HPV18+High-risk HPVHPV16

3、+Cumulative incidence rate of CIN3 (%)17.2% (11.522.9) HPV16+13.6% (3.623.7) HPV18+3.0% (1.94.2) 其它高危型HPV陽(yáng)性0.8% (0.61.1) 高危型HPV陰性4.51527395163758799119.5111020151050基線時(shí)HPV16/18陽(yáng)性者相比其它12種高危HPV型別陽(yáng)性者，有更高風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)展為高度宮頸病變HPV16/18陽(yáng)性的短期風(fēng)險(xiǎn)也明顯高于其它致癌型HPV陽(yáng)性基線篩查細(xì)胞學(xué)陰性/高危HPV陽(yáng)性的女性10年內(nèi)CIN3病對(duì)204例宮頸癌患者前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，HPV18型感染者是預(yù)后

4、不良的重要指標(biāo)，HPV18陽(yáng)性5年存活率54.1%，而其他高危型感染的存活率為83.8%。HPV18型陽(yáng)性者復(fù)發(fā)率53.6%，而HPV16型復(fù)發(fā)率僅為15.9%51例宮頸癌手術(shù)患者中，9例發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移中有6例為HPV18型107例晚期宮頸癌患者放療治療組中，HPV18型陽(yáng)性者5年存活率為15.5%，而HPV16型為73.1%對(duì)于群體而言HPV16型感染危害最大對(duì)于個(gè)體而言HPV18型感染危險(xiǎn)度最高對(duì)204例宮頸癌患者前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，HPV18型感染者是預(yù)后 （2）16、18亞型持續(xù)感染的危險(xiǎn)性大于其他亞型對(duì)巴西1611名婦女在4個(gè)月間隔2次檢測(cè)HPV，HPV16，18持續(xù)陽(yáng)性致HSIL風(fēng)險(xiǎn)性大

5、于其他高危型HPV持續(xù)陽(yáng)性。（Nicolas F. Schlecht, et.al. JAMA. 2001; 286(24): 3106-3114. ）宮頸癌的必要條件高危型的HPV感染HPV持續(xù)感染 （2）16、18亞型持續(xù)感染的危險(xiǎn)性大于其他亞型對(duì)巴（3）針對(duì)不同型別的感染采取不同的處理方案相同細(xì)胞及組織學(xué)類型HPV陽(yáng)性與陰性要區(qū)別對(duì)待不同HPV感染型別要區(qū)別對(duì)待 例如：建議HPV16,18型的患者直接進(jìn)行陰道鏡檢查；而對(duì)于其他型別的感染，要結(jié)合細(xì)胞學(xué)診斷，一般不需要采取任何治療方法，但需要按時(shí)隨訪。 44歲女性，2008年10月24日，婦檢宮頸光滑，滴蟲（+）HPV16，52（+），TC

6、T：炎細(xì)胞中度。未行陰道鏡檢查，2010年10月18日。陰道鏡下宮頸活檢病理:鱗狀細(xì)胞癌（中分化）。未按規(guī)范篩查及隨訪，導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生。 廣東省婦幼保健院案例分析（3）針對(duì)不同型別的感染采取不同的處理方案相同細(xì)胞及組織學(xué)類 二、凱普HPV12+2檢測(cè)試劑盒 二、凱普HPV12+2檢測(cè)試劑盒熒光PCR原理 在PCR反應(yīng)體系中有上下游引物，在熒光PCR體系中也有上下游引物，還加入了一個(gè)熒光基團(tuán)-探針 在PCR擴(kuò)增過程中,特異性引物和探針分別與靶序列結(jié)合，由于此時(shí)熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)離的很近，猝滅基團(tuán)對(duì)熒光基團(tuán)的發(fā)光起到了抑制作用，因此熒光基團(tuán)不發(fā)光。 Taq酶在引物的引導(dǎo)下復(fù)制靶序列；當(dāng)遇到結(jié)合在兩

7、條引物之間的探針時(shí)，發(fā)揮5端外切酶功能，將探針?biāo)?，水解下?lái)的熒光基團(tuán)受激發(fā)發(fā)射熒光，每合成一條DNA鏈發(fā)射一次熒光信號(hào)。 當(dāng)靶序列呈指數(shù)增長(zhǎng)時(shí)，發(fā)射的熒光信號(hào)量相應(yīng)增長(zhǎng)，因此只要標(biāo)本中含相應(yīng)型別的HPV病毒就會(huì)有熒光信號(hào)的積累，從而達(dá)到檢測(cè)HPV DNA的目的。熒光猝滅熒光PCR原理 在PCR反應(yīng)體系中有上下游引物，在熒光PCRHPV系列產(chǎn)品13種高危型HPV檢測(cè)試劑盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68） 不分型14種高危型HPV檢測(cè)試劑盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68） 對(duì)HP

8、V16、18分型HPV系列產(chǎn)品13種高危型HPV檢測(cè)試劑盒14種高危型HPV14種高危型人乳頭狀瘤病毒聯(lián)合16/18基因分型檢測(cè)（12+2）試劑盒產(chǎn)品特點(diǎn)至少需要四通道以上的熒光PCR檢測(cè)儀器，一次檢測(cè)出14種高危HPV型別：HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-56， HPV-58，HPV-59 , HPV-66和HPV-68，同時(shí)能對(duì)HPV16和HPV18進(jìn)行分型檢測(cè)。具有-globin基因內(nèi)對(duì)照，可以監(jiān)測(cè)所檢測(cè)樣本的可靠性。在全封閉體系中完成擴(kuò)增與檢測(cè)，有效控制污染操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化操作，完成整個(gè)過程只需要2-3個(gè)小時(shí)。檢

9、測(cè)區(qū)域設(shè)計(jì)在HPV基因組E區(qū)，避免造成漏診。 70%-80%的宮頸癌都是由HPV16、18型感染引發(fā)的，可見在HPV熒光分型的產(chǎn)品中，對(duì)HPV16、18分型的重要性SFDA與歐盟的CE認(rèn)證 資質(zhì)14種高危型人乳頭狀瘤病毒聯(lián)合16/18基因分型檢測(cè)（12+DNA提取 取800ul樣本離心得沉淀 加入細(xì)胞裂解液50ul，煮沸10min 12000離心10min即可上機(jī)若肉眼未見沉淀，可增加取樣量，再次離心收集沉淀；若沉淀雜質(zhì)較多，可用細(xì)胞保存液洗滌1-2次；血液多樣本，用蒸餾水洗滌1-2次；粘液多樣本，取樣時(shí)盡量去除粘液。應(yīng)注意防止爆蓋：金屬浴可壓重物（冰盒、冰袋等）水浴應(yīng)采用螺旋管蓋的離心管確保

10、離心管質(zhì)量合格優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快捷、方便。缺點(diǎn)：HPV DNA純度較差，含有血紅素、蛋白、脂類等PCR抑制劑。針對(duì)男性樣本或女性疣體樣本（棉拭子樣本），先用細(xì)胞保存液/生理鹽水洗脫，收集沉淀，而后與上述操作一致DNA提取 取800ul樣本離心得沉淀若肉PCR試劑配制HPV12+2 PCR MIX（l） Taq 酶（l） DNA 模板（l）1人份量 17.5 0.5 2/人份10人份量 175 5 2/人份按樣本數(shù)加入所需溶液的對(duì)應(yīng)量，充分混勻再分裝PCR試劑配制HPV12+2 PCR MIX（l）儀器檢測(cè)通道選擇HPV12+2 報(bào)告熒光 淬滅熒光12種高危型FAM NoneHPV16HEX/JOE

11、NoneHPV18ROX/Red 610None-globin Cy5 None儀器檢測(cè)通道選擇HPV12+2 報(bào)告熒光 淬 我們一般把熒光PCR的前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline，基線期） ，即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋。檢查調(diào)整基線 熒光閾值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍（儀器自動(dòng)設(shè)置，auto）。但我們通常采用手動(dòng)設(shè)置（manual），手動(dòng)設(shè)置的原則是該閾值要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，真正的信號(hào)出現(xiàn)在熒光信號(hào)超過閾值后。檢查調(diào)整閾值結(jié)果分析 我們一般把

12、熒光PCR的前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信1 定性結(jié)果判讀1）陰性對(duì)照Ct值均應(yīng)顯示為Undet。 陽(yáng)性對(duì)照Ct值36。 符合以上兩個(gè)條件，此反應(yīng)是為有效。2）樣品的Ct值顯示為Undet，判斷為陰性。3）樣品的Ct值40，判斷為陽(yáng)性；4）若為40Ct值45的樣本建議重做，重做結(jié)果Ct值40者為陽(yáng)性，否則為陰性。5）如果出現(xiàn)Ct值15的強(qiáng)陽(yáng)性樣本，可直接報(bào)告為陽(yáng)性或自動(dòng)分析，并將其從樣品表中剔除，再按上面步驟分析其他樣本，或建議進(jìn)行1/100稀釋重做。定性報(bào)告單上，定量結(jié)果欄及參考范圍設(shè)置為N/A（無(wú)效欄）結(jié)果分析1 定性結(jié)果判讀定性報(bào)告單上，定量結(jié)果欄及參考范圍設(shè)置為N/1 擴(kuò)增曲線出現(xiàn)交叉

13、擴(kuò)增曲線出現(xiàn)交叉，主要是因?yàn)槎嘁?、多探針反?yīng)體系中，每種型別的擴(kuò)增效率不一樣所致。同時(shí)，樣本本身的原因也可能造成熒光曲線的差異。常見問題及解決方案2 單個(gè)臨床樣本擴(kuò)增曲線底部上坡式不斷抬高加入的樣本DNA含有很多雜質(zhì)。重做，加樣前，樣本DNA 13000rpm離心10分鐘，移液時(shí)取上清，移液器槍頭浸入液面2mm處。1 擴(kuò)增曲線出現(xiàn)交叉常見問題及解決方案2 單個(gè)臨床樣本擴(kuò)增曲3 個(gè)別熒光曲線突然(較大)下降反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后可能會(huì)造成氣泡破裂，使熒光值突變降低，加入模板DNA后混勻離心，把反應(yīng)管放置儀器內(nèi)時(shí)要檢查管內(nèi)是否有氣泡。4 陰性對(duì)照產(chǎn)生較高熒光反應(yīng)MIX被污染；反應(yīng)管不干

14、凈，有雜物；反應(yīng)過程中探針降解。5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳加樣存在誤差，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解，應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。常見問題及解決方案3 個(gè)別熒光曲線突然(較大)下降常見問題及解決方案6 閾值設(shè)置不同，是否會(huì)導(dǎo)致陰陽(yáng)性結(jié)果判斷的不統(tǒng)一？結(jié)果的判讀不能只依賴于Ct值的大小，還要看是否出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線。二者結(jié)合才能判斷試驗(yàn)結(jié)果。閾值設(shè)置的高低會(huì)使Ct值有一定的變化，但變化一般都比較小。只有很少的樣本會(huì)出現(xiàn)在Ct=40左右波動(dòng)。這樣的樣本如擴(kuò)增曲線明顯可以判讀為陽(yáng)性，如擴(kuò)增曲線不明顯或熒光增長(zhǎng)值不高則建議重做。常見問題及解決方案6 閾值設(shè)置不同，是否會(huì)導(dǎo)致陰陽(yáng)

15、性結(jié)果判斷的不統(tǒng)一？常見問題7 檢測(cè)方法中“定性”和“定量”的問題目前，尚沒有任何一種檢測(cè)方法可以達(dá)到“定量”檢測(cè)HPV病毒的目的。這是由于采樣方法本身的局限性所造成的：在采集宮頸脫落細(xì)胞的過程中，雖然反復(fù)強(qiáng)調(diào)要采集“HPV易感區(qū)轉(zhuǎn)化帶”的脫落細(xì)胞，但由于不同操作人員對(duì)“易感區(qū)”部位的判斷以及取樣手法的不同，我們不能準(zhǔn)確評(píng)估出取得的細(xì)胞樣品中攜帶病毒分子的細(xì)胞數(shù)量。比如：在第一次采集細(xì)胞樣品時(shí)，取得了500個(gè)攜帶病毒分子的細(xì)胞，經(jīng)過檢測(cè)后，我們得出患者攜帶病毒數(shù)量是500；而對(duì)同一位患者進(jìn)行第二次采集細(xì)胞時(shí)，由于多刷了一圈或者恰恰取到了“病灶區(qū)”，所以取得了1000個(gè)攜帶病毒分子的細(xì)胞，經(jīng)過檢測(cè)，又得出攜帶病毒數(shù)量是1000。因?yàn)椴?/p>