分子熒光光譜分析

1、關(guān)于分子熒光光譜分析第1頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四光致發(fā)光（Photoluminescence）: 熒光和磷光是分子吸光成為激發(fā)態(tài)分子，在返回基態(tài)時(shí)的發(fā)光現(xiàn)象. 熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最 低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。 磷光：從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到 基態(tài)所發(fā)出的輻射。第2頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四分子的多重態(tài)單重態(tài) 一個(gè)所有電子自旋都配對(duì)的分子的電子 狀態(tài)。大多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是單重態(tài)。 當(dāng)基態(tài)一對(duì)電子中的一個(gè)被激發(fā)到較高能 級(jí)，其自旋方向不會(huì)立刻改變，分子仍處于 單重態(tài)。三重態(tài) 有兩個(gè)電子的自旋不

2、配對(duì)而平行的狀態(tài)。 激發(fā)三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低。第3頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四第4頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四一、分子退激發(fā)的過(guò)程激發(fā)態(tài)分子回基態(tài)的途徑很多，速度最快的途徑占優(yōu)勢(shì)。1、振動(dòng)馳豫 1）分子吸收光子后，可能被激發(fā)到激發(fā)態(tài)的各個(gè) 振動(dòng)能級(jí) 2）通過(guò)碰撞（非輻射躍遷）到達(dá)同一激發(fā)態(tài)的最 低振動(dòng)能級(jí) 需時(shí)間10-1310-11sec，效率較高2、熒光發(fā)射第5頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四 分子從單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)發(fā)射光子回到基態(tài)熒光發(fā)射。 熒光光譜的波長(zhǎng)比吸收光的波長(zhǎng)大（長(zhǎng)），這種現(xiàn)象叫作紅

3、移或斯托克斯位移。3、內(nèi)部轉(zhuǎn)換 1）分子內(nèi)過(guò)程，熱退激 2）兩個(gè)激發(fā)態(tài)重疊的能級(jí)發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換，因此吸收1、 2 兩種波長(zhǎng)的光后，都產(chǎn)生 2 的熒光。4、外轉(zhuǎn)換 激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其它溶質(zhì)間相互作用和能量轉(zhuǎn)換。第6頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四5、能系間交叉躍遷 電子自旋被反轉(zhuǎn)，使分子的多重性發(fā)生變化6、磷光從三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)，放出磷光。二、影響熒光強(qiáng)度的因素1、熒光效率（熒光量子產(chǎn)率）物質(zhì)分子發(fā)射熒光的能力用熒光量子產(chǎn)率（）表示：第7頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四第8頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四吸收的

4、光子數(shù)發(fā)射的光子數(shù)激發(fā)態(tài)的分子數(shù)發(fā)射熒光的分子數(shù)=Fff與退激發(fā)過(guò)程的速率常數(shù)k有關(guān)iceciffkkkkk+=Ff 凡是使熒光速率常數(shù)kf增大而使其他退激發(fā)過(guò)程（能系間交叉、外轉(zhuǎn)換、內(nèi)轉(zhuǎn)換的速率常數(shù)減小的因素都可使熒光增強(qiáng)。Kf、Ki與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，Kec、Kic與分子所處的環(huán)境有關(guān)第9頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四高熒光分子f 1，無(wú)熒光分子f 02、影響熒光強(qiáng)度的因素 1）熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 a、能吸收紫外可見(jiàn)光，有共軛雙鍵，分子呈剛性、平面、多環(huán)結(jié)構(gòu)，而且共軛平面越大、電子共軛度越大， f越高。 b、取代基的影響 給電子基團(tuán)使f增強(qiáng)，如-NH2、-OH 與

5、電子體系相互作用小的取代基對(duì)熒光影響小第10頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四 高原子序數(shù)的原子引入電子體系，使熒光減弱 吸電子基團(tuán)，如：-COOH 、NO2 、N=O2、 鹵素使熒光熄滅。 剛性平面結(jié)構(gòu)有利于熒光，因?yàn)閯傂越Y(jié)構(gòu)可以減少分子振動(dòng)，減少能系交叉和碰撞退激。 2）溫度和溶劑效應(yīng) 溫度升高， f下降 溶液黏度下降， f下降 不能使用含有重原子的溶劑第11頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四 溶劑極性增加有時(shí)會(huì)使熒光強(qiáng)度增加，熒光波長(zhǎng)紅移；若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或使熒光物質(zhì)電離狀態(tài)改變，會(huì)使熒光強(qiáng)度、熒光波長(zhǎng)改變。第12頁(yè)，共22頁(yè)，20

6、22年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四 3）pH值的影響 熒光物質(zhì)的電離與非電離形式的f有差別，帶有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與pH關(guān)； 4）溶解氧的影響 溶解氧的存在使f下降第13頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四第二節(jié) 熒光分光光度計(jì)一、基本構(gòu)造 1、光源 強(qiáng)度較高的氙燈或氙汞燈，要求有穩(wěn)定的供電源。 2、單色器 兩個(gè)，互成直角 3、樣品池 四通杯 4、檢測(cè)器 光電倍增管第14頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四二、儀器光路光源激發(fā)單色器樣品池發(fā)射單色器檢測(cè)器第15頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四第三節(jié) 熒光

7、光譜法的基本參數(shù)及測(cè)量一、熒光強(qiáng)度根據(jù)朗伯-比爾定律Ia=I0-I=I0(1-10-bc) 則If=fI0（1-10-kbc)=I0(1-e-2.303k=bc) 對(duì)于稀溶液，kbc=A A0.05 If= 2.303 f I0 kbc當(dāng)I0一定并且濃度C很小時(shí),熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比 If= KC K = 2.303 I0 kb)第16頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四Cmax0.05/kb當(dāng)C超過(guò)Cmax 時(shí)，IfC偏離線性溶液濃度太大，熒光分子之間及熒光分子與溶劑分子之間碰撞，發(fā)生非輻射躍遷，使熒光強(qiáng)度下降。熒光自熄滅：C增大到一定程度，就會(huì)發(fā)生熒光自熄滅現(xiàn)

8、象熒光自吸收：熒光熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)重疊時(shí)，熒光被吸收第17頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四二、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜激發(fā)光譜:固定發(fā)射波長(zhǎng)(EM),一般在最大發(fā)射位置 做If EX的光譜，既不同波長(zhǎng)激發(fā)光所 產(chǎn)生熒光的相對(duì)效率。發(fā)射光譜:固定激發(fā)波長(zhǎng)(Ex),一般在最大吸收位置 做If EM的光譜，既最大吸收波長(zhǎng)下產(chǎn) 生熒光的相對(duì)強(qiáng)度。目的:找到EXmax 和EMmax第18頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四三、熒光分析法直接熒光法：樣品本身發(fā)熒光，直接測(cè)定其熒光強(qiáng) 度，按吸收定律計(jì)算樣品濃度。間接熒光法：樣品本身不發(fā)熒光，通過(guò)探測(cè)劑（強(qiáng) 熒光物質(zhì)）間接測(cè)定。 探測(cè)劑稱為熒光探針樣品濃度的定量計(jì)算采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法第19頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，11點(diǎn)15分，星期四四、熒光分析法的應(yīng)用無(wú)機(jī)物分析 無(wú)機(jī)離子中除少數(shù)例外一般不發(fā)熒光.但很多無(wú)機(jī)離子能與一些有機(jī)試劑形成熒光絡(luò)合物,而進(jìn)行定量測(cè)定.生物化學(xué)及生理醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用 熒光法對(duì)于生物中許多重要的化合物具有很多的靈敏度和較好的物效性,故廣用于生物化學(xué)分析,生理醫(yī)學(xué)和臨床分析.藥物分析熒光分光光度計(jì)作為高效液相色譜,薄層色譜和高效毛細(xì)管電泳等的檢測(cè)器,使有效的分離手段與高靈敏度,高選擇性的測(cè)定方法結(jié)