目的基因的制取課件

1、第六章 基因文庫的構(gòu)建與目的基因的獲得一、目的基因 通常把插入到載體內(nèi)的特定基因片段稱為“外源基因”，而將被分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNA片段，稱為“目的基因”。 基因工程的主要工作是在體外將感興趣的DNA片段（目的基因）與載體DNA連接起來，形成重組DNA分子，再導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物。所以，分離獲取目的基因，是基因工程的第一步工作。二、基因文庫基因組文庫:由基因組DNA制成的基因文庫。cDNA文庫:由互補(bǔ)DNA制成的基因文庫。 基因文庫是否具有代表性，是看文庫是否覆蓋起始材料的全部基因或序列而未因克隆操作喪失其中的基因或序列。三、基因組文庫的構(gòu)建1. 基因

2、組文庫 將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片段，并將所有這些片段都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。理論上講，一個(gè)完整的基因文庫含有染色體基因組DNA的全部序列的各種片段。Genomic DNA Cloning2. 構(gòu)建基因文庫的載體選用載體能夠容載的DNA片段大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。（1）對(duì)載體的要求載體容量越大，所要求的DNA片段數(shù)目越少，所需的重組子越少。（2）目前常用的載體載體系列： 容量為24 kpcosmid載體： 容量為50 kbYAC： 容量為100 kbBAC: 容量為300 kb（2）隨機(jī)片段化 限制性內(nèi)切酶局部消

3、化法 控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開。 機(jī)械切割法 . 超聲波：超聲波強(qiáng)烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機(jī)片段。 .高速攪拌：1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片段。 限制酶局部消化的理論依據(jù)是：酶切速度是不均衡的。內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化，可得到10-30kb的隨機(jī)片段。 4.基因組文庫的大小 一個(gè)文庫要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。 N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）p: 文庫包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%） f: 插入載體的DNA片段的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組 DNA的百分?jǐn)?shù) G：Genome大小； f：

4、fragment大小 較大的插入片段、較小的基因組可減少重組體的數(shù)量。 例如：大腸桿菌和人類的基因組分別是4.6106bp、3109bp，若插入DNA片段的平均長(zhǎng)度如果是20kb ,則N E.coli=1.06103 N人類= 6.9105 有哪些可能的原因使一個(gè)基因在DNA庫中丟失？假定這個(gè)基因在高拷貝數(shù)的載體上，由于它的產(chǎn)物太多，而對(duì)宿主是有毒的；在部分消化中，某個(gè)基因中含有所用酶的切點(diǎn)；酶切位點(diǎn)離基因太遠(yuǎn)，結(jié)果由于DNA片段太長(zhǎng)而不能有效地克隆。 2. cDNA文庫的特點(diǎn) （1）不含內(nèi)含子序列。 （2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。 （3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。 （4）比DNA文庫小的多，

5、容易構(gòu)建。 3.構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟 （1）總RNA提取。（kit） （2）mRNA的分離純化 原理 利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA （rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。 mRNA的分離純化 分離mRNA用商業(yè)化的Oligo dT纖維柱（ Column ） 。 cDNA Synthesis（3）cDNA的合成 4. cDNA文庫的大小 一個(gè)cDNA文庫要包含99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。 p: 文庫包含了完整mRNA的概率（99%）1/n:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例 N：所需的重組載體

6、數(shù)（克隆數(shù)）Genomic DNA vs. cDNA 基因組DNA文庫含有某一生物中全部DNA序列，而cDNA文庫只包括在特定的組織或細(xì)胞類型中已被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列，它的復(fù)雜性要比基因組文庫低得多。由于不同的細(xì)胞類型、發(fā)育階段以及細(xì)胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達(dá)狀態(tài)所決定的，因此各自的mRNA的種類就不同，由此產(chǎn)生獨(dú)特的cDNA文庫。 正是由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達(dá)的時(shí)間上并非統(tǒng)一，具有發(fā)育的階段性和時(shí)間性，所以任何一個(gè)cDNA文庫都不可能包含某一生物的全部編碼基因。cDNA文庫與基因組文庫的主要差別： （1）基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文庫克隆的

7、是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因； （2）基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響，cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響； （3）基因組文庫中的編碼基因是真實(shí)基因，含有內(nèi)含子和外顯子，而cDNA文庫克隆的是不含內(nèi)含子的功能基因。五、目的基因的制?。ㄒ唬?鳥槍法 是一種由生物基因組提取目的基因的方法，實(shí)際上是從基因組文庫中篩選出目的基因。這個(gè)方法最明顯的缺點(diǎn)是，所形成的重組體分子，是一群帶有大小不同的插入片段的重組體的混合群體。要想從如此巨大數(shù)量的群體（基因組文庫）中，篩選出帶有目的基因的克隆，顯然十分費(fèi)事，而且還會(huì)造成不必要的人力和物力上的浪費(fèi)。（

8、二）酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法 此法即先構(gòu)建cDNA文庫，再選用適當(dāng)方法從cDNA文庫中篩選出目的基因。 例如：非洲爪蛙編碼核糖體RNA基因（rDNA）和編碼5s RNA的5s DNA的分離：提取細(xì)胞的基因組DNA，放到CsSO4介質(zhì)中超速離心，并添加Hg+。由于非洲爪蛙的rDNA 和5s DNA的A+T含量較高，而Hg+能夠特異地與A、T結(jié)合，從而增大了密度差，使rDNA 和5s DNA很容易地從整體DNA中分離出來。單鏈酶法： 堿基GC比AT之間穩(wěn)定性高。當(dāng)用加熱或其他變性試劑處理DNA時(shí)，雙鏈上AT配對(duì)較多的部位先變成單鏈，應(yīng)用單鏈特異的S1核酸酶切除單鏈，再經(jīng)氯化銫超速離心，獲得無單鏈切口的DN

9、A。 例如：海膽的rDNA含較多的G C堿基對(duì)，在對(duì)海膽細(xì)胞的DNA加熱處理時(shí)，雙鏈DNA上的A=T堿基對(duì)部分首先變性，這部分局部地分開成為單鏈，而G C堿基對(duì)較多的部分在這一溫度下仍保持其雙鏈狀態(tài)，用專門作用于單鏈DNA的S1核酸酶切去單鏈區(qū)段，再進(jìn)行密度梯度離心，即可分離出海膽的rDNA。（四）化學(xué)合成法 DNA合成儀的發(fā)明，使人工合成DNA成為一種常規(guī)技術(shù)。如果已知某基因的核苷酸序列，或者基因產(chǎn)物的氨基酸序列，推導(dǎo)出該多肽編碼基因的核苷酸序列，就都可以用化學(xué)方法合成該基因的核苷酸片段。人工化學(xué)合成法一般合成200bp，如果基因較大，可先合成若干個(gè)短DNA片段，再連接成一個(gè)長(zhǎng)的完整基因。

10、磷酸二脂法和亞磷酸三脂法是DNA自動(dòng)合成儀廣泛采用的兩種方法。 為保證DNA合成的定向性和專一性，反應(yīng)時(shí)應(yīng)將不必反應(yīng)的基團(tuán)保護(hù)起來，而在每一循環(huán)之后，清除多余的單核苷酸，并將未反應(yīng)的固著核苷酸鏈封閉起來。（五）PCR擴(kuò)增法 1. 直接從基因組中擴(kuò)增 （1）提取基因組DNA作模板 （2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物 （3）PCR擴(kuò)增 適合擴(kuò)增原核生物基因。 真核生物基因組含有內(nèi)含子！ 2. 從mRNA中擴(kuò)增: RT-PCR （1）提取total RNA （2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板 （3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物 （4）PCR擴(kuò)增 適合擴(kuò)增真核生物基因。 原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾巴。 問題：將含有外源基因組一個(gè)酶切片段的質(zhì)粒稱為一個(gè)基因組DNA克隆，各種此類質(zhì)粒的集合體稱之為構(gòu)建了一個(gè) 。將含有一個(gè)mRNA的DNA拷貝的克隆稱作一個(gè)cDNA克隆，源于同一批RNA制備物的克隆群則構(gòu)建了一個(gè) 。cDNA技術(shù)是進(jìn)行真核生物基因克隆的一種通用方