免疫熒光技術臨床的應用培訓課件

1、免疫熒光技術臨床的應用免疫熒光技術臨床的應用 隨著人們生活水平和意識的不斷提高，各種因素的影響，近年來每31個人中就有一個人在受到自身免疫性疾病的折磨，臨床表現(xiàn)復雜，不易早期發(fā)現(xiàn)。2免疫熒光技術臨床的應用 隨著人們生活水平和意識的不斷提2 自身免疫性疾病涉及多學科（風濕免疫科、內分泌科、血液科、婦產科、皮膚科、腎病科、消化科等等）3免疫熒光技術臨床的應用 自身免疫性疾病涉及多學科3免疫熒 自身免疫性疾病涉及多病種(混合結締組織病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、磷脂綜合癥、原發(fā)性系統(tǒng)性血管炎、韋格納肉芽腫、壞死性新月體腎小球腎炎、顯微多動脈炎、習慣性流產、干燥綜合征、皮肌炎、多肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性

2、膽管炎等等）4免疫熒光技術臨床的應用 自身免疫性疾病涉及多病種4免疫熒光技術臨 自身免疫性疾病的共同特征：患者血清中有多種自身抗體或自身反應性致敏淋巴細胞存在，患者組織器官的病理特征為免疫炎癥，用相同抗原在某些動物實驗中可復制出相似的疾病模型，多數(shù)病因不明，疾病有重疊現(xiàn)象，即一個病人可同時患一種以上自身免疫病，病程一般較長，多遷延為慢性，有遺傳傾向。鑒于自身免疫性疾病的共同特征，通過檢測自身抗體可以有效準確的診斷自身免疫性疾病，為臨床提供高效準確的診斷依據(jù)。5免疫熒光技術臨床的應用 自身免疫性疾病的共同特征：5免疫熒光技術臨床的 自身抗體檢測的開展，不僅讓我院在自身免疫性疾病診斷治療上有很大的

3、提高，還可為隴東南地區(qū)400萬人口提供更準確、更專業(yè)的自身免疫性疾病診斷服務。節(jié)省患者去外院檢測診斷所花費的時間和費用，使我院在整個地區(qū)具有一定的影響力，也會為醫(yī)院帶來可觀的經(jīng)濟效益。鑒于此，我院完全有必要應用間接免疫熒光技術開展自身抗體項目的檢測。6免疫熒光技術臨床的應用 6免疫熒光技術臨床的應用2酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 1間接免疫熒光法（IFA Indirect Fluorescent Assay ）3免疫印跡法（IB）WesternblotLIA4其它：IDA、RIA等7免疫熒光技術臨床的應用2酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 1間接免疫熒光法（IFA I 間接免疫熒光法實驗原理細胞、

4、組織切片或純化的、生化性質明確的物質均可作為檢測自身抗體或病原體抗體的抗原基質。如標本為陽性，已稀釋血清中的特異性抗體將與包被在固相上的抗原結合。第二步，已結合的抗體與熒光素標記的抗人抗體結合，然后在熒光顯微鏡下觀察結果。陽性標本經(jīng)系列稀釋后可測出其滴度。最適稀釋因子為3.162（10的平方根），這樣，每隔一步就出現(xiàn)一個10的整數(shù)倍數(shù)（1:10、1:32、1:100、1:320、1:1000、 1:3200, 1:10000等8免疫熒光技術臨床的應用 間接免疫熒光法實驗原理細胞、組織切片或純化的、 間接免疫熒光法檢測的特點特異性高：陽性與陰性標本的熒光強度差別明顯。每種已結合的抗體在相應抗原的

5、位置產生典型的熒光模型?；|中抗原譜完整，可檢測多種抗體，并且檢出率高?？稍谝环N生物基質上同時檢測多種抗不同生化特性抗原的抗體。當酶免試劑所需要的抗原難以制備或無法獲得時，可選擇間接免疫熒光法。9免疫熒光技術臨床的應用 間接免疫熒光法檢測的特點特異性高：陽性與陰性標本自身抗體檢測的標準和最經(jīng)典的實驗方法是間接免疫熒光檢測法（IFA)。需要熒光顯微鏡。操作者需要一定的專業(yè)知識。操作者需要一定的工作經(jīng)驗。顯微鏡下的結果判斷為綜合知識的體現(xiàn)，到目前為止，尚沒有任何儀器可取代人工讀片。10免疫熒光技術臨床的應用自身抗體檢測的標準和最經(jīng)典的實驗方法是間接免疫熒光檢測法（I 國內現(xiàn)狀自身抗體的測定不普遍欠

6、規(guī)范對其意義了解尚少缺乏研究11免疫熒光技術臨床的應用 國內現(xiàn)狀自身抗體的測定不普遍11免疫熒光技術臨床 自身抗體種類繁多 常見自身抗體：抗核抗體譜(ANAS)檢測抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA）檢測類風濕因子和抗CCP抗體自身免疫性肝病相關自身抗體檢測12免疫熒光技術臨床的應用 自身抗體種類繁多 常見自身 檢驗科 擬開展自身抗體檢測項目介紹及相關自身免疫性疾病13免疫熒光技術臨床的應用 檢驗科13免疫熒光技術臨床的應用 檢驗項目 試劑價格收費標準抗核抗體 （ANA）18.943.8ANA譜3180329.6雙鏈DNA2219.5角蛋白抗體（AKA）29.519.5環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體39

7、78.2肝抗原譜9項176221.4蛋白酶3 （PR3）、髓過氧化物酶（MPO）、腎小球腎炎78146.4抗中性粒細胞漿抗體3897.6過敏原特應性組合30043814免疫熒光技術臨床的應用 檢驗項目 試劑價格收費標 抗核抗體（ANA）定義以細胞核內物質為抗原的抗體ANA可見于多種疾病，特別是結締組織疾病，常作為結締組織病的診斷、病 情判斷和療效觀察的指標（SLE的篩查抗體）。在非結締組織?。ǜ腥?、慢肝、肺纖維化或腫瘤）中也可出現(xiàn)陽性。正常人中（特別是老年人）也可出現(xiàn)陽性，但滴度低，并且常表現(xiàn)為IgM型。高滴度ANA則高度提示自身免疫性疾病。目前，ANA檢測已成為臨床上的一個極重要的自身免疫病

8、的篩查實驗。15免疫熒光技術臨床的應用 抗核抗體（ANA）定義以抗核抗體（ANA）系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動期95100%非活動期80100%藥物誘導的紅斑狼瘡100%混合性結締組織?。∕CTD、Sharp綜合征）100%類風濕性關節(jié)炎2040%進行性系統(tǒng)性硬化癥2050%多發(fā)性肌炎及皮肌炎8595%干燥綜合征3050%慢性活動性肝炎7080%潰瘍性結腸炎3040%其它風濕病26%正常人5-10%16免疫熒光技術臨床的應用抗核抗體（ANA）系統(tǒng)性紅斑狼瘡16免疫熒光技術臨床的應用抗核抗體（ANA）方法間接免疫熒光法結果判斷: 滴度1：100為陽性 常見核型5種 不同核型的臨床意義不同17免疫熒光技術臨

9、床的應用抗核抗體（ANA）17免疫熒光技術臨床的應用ANA常見五種核型及臨床意義核膜型與抗ds-DNA有關， 多見于SLE，特別是有腎炎者均質型與AHA、抗DNA有關，引起LE形成 主要見于SLE、藥物性狼瘡斑點型與抗ENA有關，應進一步查特異性抗體核仁型多見于硬皮病著絲點型多見于CREST綜合征18免疫熒光技術臨床的應用ANA常見五種核型及臨床意義核膜型與抗ds-DNA有關， 核膜型 與抗ds-DNA有關， 多見于SLE，特別是有腎炎者 均質型與AHA（抗組蛋白抗體）、抗DNA有關，引起LE形成主要見于SLE、藥物性狼瘡19免疫熒光技術臨床的應用 核膜型 斑點型 與抗ENA有關，應進一步查特

10、異性抗體核仁型多見于硬皮病20免疫熒光技術臨床的應用 斑點型核仁型20免疫熒 著絲點型多見于CREST綜合征21免疫熒光技術臨床的應用 著絲點型21免疫熒光技術臨床的應用 抗核抗體譜（ANAs）項目包含nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白、AMA M2，共15項?？筺RNP抗體：高滴度的抗U1-nRNP抗體是混合性結締組織（MCTD，夏普綜合征）的標志，陽性率為95-100%，抗體滴度與疾病活動性相關，在30-40%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中也可檢出抗U1-nRNP抗體，但幾乎總

11、伴有Sm抗體?？筍m抗體： 抗Sm抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性抗體，與抗dsDNA抗體一起，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷指標，但陽性率僅為5-10%。抗Ro-52抗體：與其它抗體（如：SS-A）同時出現(xiàn)時則高度提示（SS-A）的相關疾病?？筍cl-70抗體：見于25-75%的進行性系統(tǒng)性硬化癥（彌散型）患者中，因實驗方法和疾病活動性而異（Scl=硬化癥），在局限型硬化癥患者中未檢出該抗體。 22免疫熒光技術臨床的應用 抗核抗體譜（ANAs）項目包含nRNP/Sm、Sm、SS抗核抗體譜（ANAs）抗SS-A抗體：與各類自身免疫性疾病相關，最常見于干燥綜合征（40-80%）、也見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（30-

12、40%）和原發(fā)性膽汁性肝硬化（20%）中，偶見于慢性活動性肝炎。此處，在100%的新生兒紅斑狼瘡中抗SS-A抗體陽性。該抗體可經(jīng)胎盤傳給胎兒引起炎癥反應和新生兒先天性心臟傳導阻滯?？筍S-B抗體：幾乎僅見于干燥綜合征（40-80%）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（10-20%）的女性患者中，男女比例為1：29。在干燥綜合征中SS-A抗體和抗SS-B抗體常同時出現(xiàn)?？笿o-1抗體：見于多肌炎、陽性率為25-30%。常與合并肺間質纖維化相關?？怪z點抗體（CENP B）：與局限型進行性系統(tǒng)性硬化癥（CREST綜合征：鈣質沉著、Raynaud病、食管功能障礙、指硬皮病、遠端血管擴張）有關，陽性率為70-90%。在

13、原發(fā)性膽汁性肝硬化患者中也可檢測到該抗體（陽性率為10-30%。還可出現(xiàn)于雷諾氏綜合征中。23免疫熒光技術臨床的應用抗核抗體譜（ANAs）抗SS-A抗體：與各類自身免疫性疾病相抗核抗體譜（ANAs）抗dsDNA抗體：對系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有很高的特異性。除抗Sm抗體外，抗dsDNA抗體也可做為該病的一個血清學標志，陽性率40-90%，且與疾病的活動度相關，可用于療效監(jiān)測?？购诵◇w抗體：系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中的陽性率為50-95%，特異性幾乎為100%。核小體是細胞染鈀體的功能亞單位，由DNA和組蛋白以特殊的且成。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的早期抗核小體抗體比抗dsDNA抗體、抗組蛋白抗體更早出現(xiàn)，對系統(tǒng)性

14、紅斑狼瘡的誘因和致病有重要作用。組蛋白抗體：一種或幾種組蛋白抗體或抗H2A-H2B復合物抗體在藥物（普魯卡因胺、肼酞嗪以及其它藥物）誘導的藥斑狼瘡中比較常見（陽性率95%）。另外，在30-70%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡和15-50%的類風濕性關節(jié)炎患者中也可檢出抗組蛋白抗體?？购颂求wP蛋白抗體：是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性標志，陽性率為5-15%。普遍認為ARPA的滴度與SLE的活動性相關，還與SLE的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、腎臟或肝臟受累相關。24免疫熒光技術臨床的應用抗核抗體譜（ANAs）24免疫熒光技術臨床的應用25免疫熒光技術臨床的應用25免疫熒光技術臨床的應用免疫熒光技術臨床的應用培訓課件抗環(huán)瓜氨酸肽

15、抗體（抗CCP）瓜氨酸是RA血清抗聚角蛋白微絲蛋白相關 抗體的主要抗原決定簇對RA診斷具有高度特異性（98%）可在RA早期出現(xiàn)預測早期關節(jié)炎發(fā)展為RARA關節(jié)侵蝕破壞的早期識別及預測27免疫熒光技術臨床的應用抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP）瓜氨酸是RA血清抗聚角蛋白微絲蛋我科開展的自身免疫肝炎系列抗體包括：抗肝細胞膜抗體(抗LMA)抗肝腎微粒體抗體（抗LKM抗體）抗肝-胰抗體(抗LP抗體)抗可溶性肝細胞抗體（抗SLA）抗線粒體抗體（AMA）28免疫熒光技術臨床的應用我科開展的自身免疫肝炎系列抗體包括：28免疫熒光技術臨床的應肝抗原譜9項SLA/LP：抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體；是AIH的最特異診

16、斷指標，陽性率10-30%，特異性100%。RO-52：不具有疾病特異性AIH其他診斷指標：1）ANA30-40%；2）ASMA抗平滑肌抗體（F-肌動蛋白）40-90%3）肝細胞膜抗原抗體35%4）去唾液酸糖蛋白受體80-90%PBC其他診斷指標：1）AMA-M4 55%2）AMA-M8 55%3）AMAM9 35-85%4）核點30 %PSC（原發(fā)性硬化性膽管炎）：在PSC中最常見的自身抗體為PANCA（陽性率為70-80%）重疊綜合征（主要發(fā)生于自免性肝病之間）29免疫熒光技術臨床的應用肝抗原譜9項SLA/LP：抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體；是A(一)類風濕關節(jié)炎（RA）類風濕因子（RF）

17、早期診斷的系列指標抗RA33/36抗體抗核周因子（APF）抗角蛋白抗體（AKA）抗Sa抗體抗環(huán)瓜氨酸抗體（抗CCP）30免疫熒光技術臨床的應用(一)類風濕關節(jié)炎（RA）類風濕因子（RF）30免疫熒光技(二)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種臨床表現(xiàn)有多系統(tǒng)損害癥狀的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其血清有以抗核抗體為主的大量不同的自身抗體自身抗體（1）抗核抗體譜ANA、抗ds-DNA、抗ENA抗體（2）抗磷脂抗體（3）抗組織細胞抗體抗RBC抗體 抗血小板相關抗體 抗神經(jīng)元抗體（4）其它RF、p-ANCA31免疫熒光技術臨床的應用(二)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種臨床表現(xiàn)有多系統(tǒng)損害癥狀(三)皮肌炎/多

18、發(fā)性肌炎（PM/DM）免疫學檢查ANAENA抗Jo-1陽性其它檢查肌酶譜肌酸磷酸激酶（CPK）: MM-心肌和骨骼肌 MB-心肌 BB-平滑肌和腦內乳酸脫氫酶（LDH）谷草轉氨酶（AST）谷丙轉氨酶（ALT）堿性磷酸酶（ALP）32免疫熒光技術臨床的應用(三)皮肌炎/多發(fā)性肌炎（PM/DM）免疫學檢查32免疫熒光(四)干燥綜合征（SS）ANA陽性率40%70%ENA抗SSA抗體陽性率70%96% 抗SSB抗體陽性率50%87%抗-Fordrin對于pSS或sSS的診斷有一 定意義，但特異性和敏感性并不理想。RF陽性率75%100%高球蛋白血癥WBC下降33免疫熒光技術臨床的應用(四)干燥綜合征（SS）ANA陽性率40%70%33免(五)系統(tǒng)性硬化病（pSS）ANA陽性率50%55%ENA抗Scl-70陽性率15%40%抗著絲點抗體(ACA)陽性34免疫熒光技術臨床的應用(五)系統(tǒng)性硬化?。╬SS）ANA陽性率50%55%3(六)混合性結締組織病