多房棘球絳蟲混合重組BCG

1、多房棘球絳蟲混合重組BCG【關(guān)鍵詞】多房棘球絳蟲；重組BGInhibitinnapptsisfsplenytesinieiunizedithixedrBGE/3andrBGE1433vaineagainstEhinusultilularis【Abstrat】AI:TiunizeieithixedrBGE/3andrBGE1433vaineagainstEhinusultilularis(E)andtinvestigatetheapptsisfspleenellshallengedithEprtslees.ETHDS:Balb/ieerevainatedsubutaneuslyandintran

2、asallyithixedrBGvainesrespetively.EighteeneeksafterhallengedithEprtsleestheieerekilledttakethespleen.Thespleenellsereislatedteasureappttiratebyflytetry.Blankvetr,BGandPBSservedasntrls.RESULTS:AppttirateintheiunizatingrupaslerthanthatinthePBSntrlgrup(P0.01).NLUSIN:Apptsisfspleenellsinieaybeinduedbyin

3、fetinithalvelarhydatidyst,butitanbeinhibitedbyiunizatinithixedrBGE/3andrBGE1433vaine.【Keyrds】Ehinusultilularis;rBGEII/3vaine;rBGE1433vaine;spleen/ytlgy;apptsis【摘要】目的：多房棘球絳蟲混合重組BGE/3和BGE1433疫苗免疫小鼠并以E原頭節(jié)攻擊后討論以上疫苗對(duì)小鼠脾細(xì)胞凋亡的變化.方法：將混合重組BG疫苗采用皮下注射和鼻腔內(nèi)接種分別免疫Balb/鼠8k后，用多房棘球絳蟲原頭節(jié)進(jìn)展攻擊感染，感染18k殺鼠取脾并別離脾細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)

4、脾細(xì)胞的凋亡發(fā)生率，同時(shí)設(shè)有空載體、BG和PBS對(duì)照.結(jié)果：疫苗接種組的脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯低于感染對(duì)照組.結(jié)論：泡球蚴感染可引起小鼠脾細(xì)胞凋亡，而多房棘球絳蟲混合重組BGE/3和BGE1433疫苗可在一定程度上抑制感染鼠脾細(xì)胞的凋亡.【關(guān)鍵詞】多房棘球絳蟲；重組BGE/3疫苗；重組BGE1433疫苗；脾/細(xì)胞學(xué)；細(xì)胞凋亡0引言Aeisen等1認(rèn)為某些寄生蟲感染誘導(dǎo)的凋亡在疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用.人們發(fā)現(xiàn)小鼠感染惡性瘧原蟲(Plasdiufaliparu)或日本血吸蟲(shistsajapniu)以及大鼠感染卡氏肺孢子蟲(pneuystisarinii)后均可誘導(dǎo)其脾細(xì)胞發(fā)生凋亡2-4.泡

5、型包蟲病(alvelarehinsis,AE)是由多房棘球絳蟲(Ehinusultilularis,E)的中絳期幼蟲寄生在人體肝臟引起的一種嚴(yán)重危害人類安康的人畜共患寄生蟲病.當(dāng)前分子生物學(xué)技術(shù)的開展為研制理想的E疫苗提供了新方法，將E外源DNA引入特定疫苗載體構(gòu)建重組活疫苗可將保護(hù)性抗原傳遞至宿主免疫系統(tǒng).王昌源等5發(fā)現(xiàn)E/3重組抗原ELP蛋白是一種有較好保護(hù)性免疫力的抗原分子.SilesLuas等6證實(shí)E1433抗原位于E原頭蚴的生發(fā)層，其過度表達(dá)與原頭蚴的進(jìn)展性、侵入性和無限制生長(zhǎng)特性有關(guān)，提示它是一種有希望的疫苗分子.irill等7認(rèn)為卡介苗BaillealetteGuerin,BG是

6、一種理想的疫苗載體.atsu等8在BG中成功構(gòu)建了外源抗原分泌系統(tǒng)，這為開展BG成為多價(jià)疫苗載體打下了堅(jiān)實(shí)的根底.本實(shí)驗(yàn)我們?cè)诔晒?gòu)建重組BGE/3和BGE1433疫苗的根底上9-10，等量混合以上兩種疫苗作為混合疫苗免疫小鼠,原頭節(jié)攻擊免疫鼠并觀察其脾細(xì)胞凋亡的情況，從而為研究該疫苗的保護(hù)性免疫機(jī)制提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).1材料和方法1.1材料65只雌性Balb/小鼠，1214周齡，體質(zhì)量2025g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；多房棘球絳蟲重組BGE/3和BGE1433疫苗由本室構(gòu)建9-10，將rBGE/3和rBGE1433疫苗按11的濃度比例混勻，組成混合疫苗；nA購(gòu)自Siga公司.Ann

7、exinVFIT試劑盒(LHK601100)購(gòu)自深圳晶美生物工程公司.1.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)分組65只雌性Balb/小鼠隨機(jī)分為5組，每組13只.第1組為5106fu混合疫苗懸浮于100LPBS于小鼠后背部皮下單次注射；第2組為5105fu疫苗懸浮于10LPBS于小鼠鼻腔黏膜單次接種；第3組為5106fu的空載體含pBG質(zhì)粒的BG皮下單次注射對(duì)照組；第4組為5106fu的BG皮下單次注射對(duì)照組；第5組為100LPBS皮下單次注射對(duì)照.1.2.2攻擊感染多房棘球絳蟲混合重組BGE/3和重組BGE1433疫苗免疫8k后用50個(gè)泡球蚴原頭節(jié)腹腔內(nèi)注射進(jìn)展攻擊.對(duì)照組的攻擊方案同免疫組.1.2.3脾

8、細(xì)胞制備攻擊感染后18k剖殺各組小鼠，750L/L乙醇消毒、無菌取脾臟、勻漿、200目尼龍網(wǎng)過濾；滅菌雙蒸水溶解紅細(xì)胞后，用含100L/L滅活小牛血清的RPI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5109/L，并參加青霉素1105U/L和鏈霉素1105U/L；臺(tái)盼藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞存活率為93%97%.1.2.4脾細(xì)胞培養(yǎng)將別離的小鼠脾細(xì)胞參加24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)標(biāo)本設(shè)2孔，分別參加原液、10g/LnA各1L,3750L/L2培養(yǎng)1216h.1.2.5AnnexinVFIT染色法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞凋亡培養(yǎng)1216h后，搜集5109/L脾細(xì)胞，用4預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，2500r/in離心5in；用250

9、L結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度至1109/L；取100L的細(xì)胞懸浮液參加5L流式細(xì)胞管中，參加AnnexinVFIT5L和20g/L碘化丙錠溶液10L；混勻后室溫避光孵育15in；在反響管中加400LPBS，用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BetnDikinsn公司)記錄FIT標(biāo)記的凋亡細(xì)胞在波長(zhǎng)為495n紫外光激發(fā)下產(chǎn)生525n的綠色熒光以及PI標(biāo)記的凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞在波長(zhǎng)為340n的紫外光激發(fā)下產(chǎn)生620n的紅色熒光，用ellQuest軟件分析細(xì)胞凋亡.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：各免疫組小鼠脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率采用SPSS11.0軟件進(jìn)展分析，計(jì)量資料采用xs表示，組間比擬采用方差分析，組間兩兩比擬用SNK法.2

10、結(jié)果2.1原液組脾細(xì)胞凋亡當(dāng)脾細(xì)胞不用任何刺激物時(shí)，5106fu混合rBG疫苗皮下注射免疫小鼠后，脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率與PBS對(duì)照組相比降低P0.01；5105fu混合疫苗鼻腔內(nèi)接種免疫小鼠后，脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率低于PBS對(duì)照組P0.01；皮下注射組的脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率與鼻腔內(nèi)接種組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05；空載體和BG皮下注射組的脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率分別與PBS對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05，表1.表1重組BGE/3和BGE1433疫苗免疫，原頭節(jié)攻擊后小鼠脾細(xì)胞凋亡檢測(cè)略2.2nA刺激組脾細(xì)胞凋亡變化當(dāng)脾細(xì)胞用nA刺激培養(yǎng)時(shí)，皮下注射組和鼻腔內(nèi)接種組的脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率低于PBS對(duì)照組P0.01

11、；鼻腔內(nèi)接種組的脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率低于皮下注射組P0.01；空載體和BG皮下注射組的脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率分別與PBS對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05，表1.3討論碘化丙啶(prpidiuidide,PI)是一種DNA染料，可特異性與DNA結(jié)合，但其不能透過細(xì)胞膜.由于凋亡細(xì)胞的膜通透性增加，因此可著染PI.當(dāng)用熒光激活細(xì)胞分檢器flureseneativatedellsrter,FAS檢測(cè)時(shí)，著染PI的凋亡細(xì)胞在一定壓力下，通過殼液包圍的進(jìn)樣管進(jìn)入流動(dòng)室，排成單列細(xì)胞，經(jīng)流動(dòng)室的噴嘴噴出形成細(xì)胞液流.在波長(zhǎng)為340n紫外光激發(fā)下產(chǎn)生波長(zhǎng)為620n的紅色熒光信號(hào)，經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理形成熒光直方圖.凋亡

12、細(xì)胞信號(hào)出現(xiàn)于亞G1蜂上，但只代表G0/G1期發(fā)生凋亡的細(xì)胞，而不能檢測(cè)S期和G2期發(fā)生凋亡的細(xì)胞；在單細(xì)胞懸液制備過程中，易產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片，晚期凋亡細(xì)胞經(jīng)洗滌處理可引起胞內(nèi)DNA喪失，造成亞G1峰前移，與碎片峰交融在一起，因此不能區(qū)分凋亡細(xì)胞和碎片；同時(shí)壞死細(xì)胞也可著染PI，因此也不能區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞.AnnexinVFIT染色法可彌補(bǔ)PI染色法的缺乏，早期凋亡細(xì)胞因細(xì)胞膜的磷脂對(duì)稱性改變而使磷脂酰絲氨酸phsphatidylserine,PS暴露于細(xì)胞外，PS可特異結(jié)合標(biāo)記有異硫氰酸熒光素(fluresEinisthiyanate,FIT)的連接素VannexinV；標(biāo)記FIT的凋

13、亡細(xì)胞在波長(zhǎng)為495n紫外光激發(fā)下產(chǎn)生525n的綠色熒光，標(biāo)記PI的凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞在波長(zhǎng)為340n的紫外光激發(fā)下產(chǎn)生620n的紅色熒光，經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理形成DNA二維圖.可見AnnexinVFIT染色法不僅可以區(qū)分凋亡細(xì)胞綠色與壞死細(xì)胞紅色，而且可檢測(cè)DNA含量紅色，因此AnnexinVFIT染色法是研究細(xì)胞凋亡的一種較理想方法.李富榮等11將正常Balb/鼠脾D4+T淋巴細(xì)胞用EAg刺激培養(yǎng)16h后，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(terinaldexynuletidyltranseferaseediateddUTPnikendlabeling,TUNEL)檢測(cè)其凋亡發(fā)

14、生率為0.92%，而小鼠感染泡球蚴12k和25k時(shí)凋亡發(fā)生率為4.29%和34.72%.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠感染泡球蚴18k時(shí)，用AnnexinVFIT染色法檢測(cè)脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率為16.92%21.35%，類似上述結(jié)果，提示泡球蚴感染可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞發(fā)生凋亡，推測(cè)泡球蚴抗原經(jīng)抗原提呈細(xì)胞加工處理后，形成1317個(gè)氨基酸殘基組成的抗原肽，該肽與H分子連接形成抗原肽H分子復(fù)合物，經(jīng)高爾基體運(yùn)送到AP外表，與小鼠脾細(xì)胞TR/D3復(fù)合物結(jié)合后，誘導(dǎo)胞內(nèi)Fas/Ap1/D95及其配體FasL表達(dá)，導(dǎo)致脾細(xì)胞凋亡12，此過程稱激活誘導(dǎo)的凋亡ativatininduedelldeath,AID.Kreer等1

15、3證實(shí)BG接種可抑制人外周血單核細(xì)胞發(fā)生凋亡.本文發(fā)現(xiàn)BG和空載體皮下注射組小鼠脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率細(xì)微低于感染對(duì)照組，說明BG免疫對(duì)泡球蚴感染鼠脾細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示皮下注射組和鼻腔內(nèi)接種組小鼠脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著低于感染對(duì)照組，提示疫苗接種可抑制泡球蚴感染鼠脾細(xì)胞發(fā)生凋亡，推測(cè)混合重組BGE/3和BGE1433疫苗免疫小鼠后可激活體內(nèi)的免疫細(xì)胞，促進(jìn)其分泌免疫效應(yīng)分子，這些免疫細(xì)胞與免疫效應(yīng)分子互相促進(jìn)和互相調(diào)節(jié)，抑制泡球蚴感染鼠脾細(xì)胞發(fā)生凋亡，使小鼠脾細(xì)胞數(shù)目相對(duì)增加，從而加強(qiáng)小鼠抗泡球蚴感染的保護(hù)性免疫反響.【參考文獻(xiàn)】1AeisenJ,EstaquierJ,Idzi

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