蛋白質(zhì)復性方法

1、包涵體表達的蛋白的復性摘要綜述了包涵體形成、包涵體分離和溶解、 包涵體折疊復性的方法、復性產(chǎn)率低下的主要因 素以及通過分子伴侶、低分子量添加物等的應用 而提高了蛋白質(zhì)復性產(chǎn)率。關鍵詞 包涵體 蛋白質(zhì) 復性Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields w

2、ere included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.Key words inclusion body , protein , renaturation外源基因在大腸桿菌中的高表達常常導致包 涵體的形成，雖然包涵體具有富集目標蛋白質(zhì)、 抗蛋白酶、對宿主毒性小等優(yōu)點，但包涵體蛋白 質(zhì)的復性率一般都很低，而分子伴侶、低分子量 添加物等在復性過程中的應用及新的復性方法

3、 的建立都大大提高了重組蛋白質(zhì)復性產(chǎn)率。一、 包涵體：包涵體的定義、組成與特性：包涵體是指細菌表達的蛋白在細胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒 素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀 或缺口的質(zhì)粒DNA,以及脂體、脂多糖等，大小 為，具有很高的密度（約 ml）,無定形，呈非水 溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸服等。NMR等新技術的應用表明包涵體具有一定量的二級 結構，他們可能在復性的啟動階段中具有一定的 作用。1包涵體的形成：主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些 蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成 正確的次級鍵等

4、原因形成的?；蚬こ叹谋磉_產(chǎn)率過高，超過了細 菌正常的代謝水平，由于細菌的6因子的蛋白水 解能力達到飽和，使之表達產(chǎn)物積累起來。研究 發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越 容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以 至于沒有足夠的時間進行折疊， 二硫鍵不能正確 的配對，過多的蛋白間的非特異性結合， 蛋白質(zhì) 無法達到足夠的溶解度等。重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨 基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯 與包涵體的形成呈正相關。重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞 內(nèi)pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于 缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和輔助因 子

5、，如折疊酶和分子伴侶等，致使中間體大量積 累，容易形成包涵體沉淀。蛋白質(zhì)在合成之后，于中性 pH或接近 中性pH的環(huán)境下，其本身固有的溶解度對于包 涵體的形成比較關鍵，即是說，有的表達產(chǎn)率很 高，如Aspartase和Cyanase表達產(chǎn)率達菌體蛋 白的30%,也不形成包涵體，而以可溶形式出現(xiàn)。2在細菌分泌的某個階段，蛋白質(zhì)分子間 的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學作用導致了包 涵體的形成。包涵體破菌、分離、洗滌及溶解基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后，可用： 機械破碎、超聲破碎：單純超聲破碎，在小規(guī)模 下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞 和局部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細胞懸液的 破碎，這樣

6、部分未破碎細胞與包涵體混在一起， 給后期純化帶來困難。因此，在較大規(guī)模純化時 先用溶菌酶破碎細菌的細胞膜，再結合超聲破碎 方法，可顯著提高包涵體的純度和回收率。以及化學方法破碎使細菌裂解 ，然后以5000-20000g 15min離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性 蛋白分離。洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)， 如 膜蛋白或核酸，應用洗滌液洗滌包涵體，通常用 低濃度的變性劑，過高濃度的尿素或鹽酸服會使 包涵體溶解，如2M尿素在50mM Tris左右,1mM EDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100 洗滌去除膜碎片和膜蛋白。3溶解：一般用強的變性劑如尿素(6-8M)、 鹽酸月瓜

7、(GdnHCl 6M),通過離子間的相互作用， 打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學 鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸服優(yōu)于尿素， 因為鹽酸肌是較尿素強的變性劑， 它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氟酸鹽 能導致多肽鏈的自由氨基甲?；?特別是在堿性 pH值下長期保溫時?；蛴萌ス竸?，如 SDS正 十六烷基三甲基俊氯化物、Sarkosyl等，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。Kandula Suntha 等人用 TritonX-100 來溶解 Zymononas mobilis levansucrase 包涵體蛋白。另 外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)， 分離的包涵體

8、 中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非 活性二硫鍵。還需加入還原劑，如疏基乙醇、二 硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤薛糖醇、半胱氨酸。還原劑的使用濃度一般是 50-100mM 2-BME或 DTT,也有文獻使用 5mM濃度。在較粗放的條 件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃 度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關，而有些沒有二硫鍵 的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵 體的增溶。對于目標蛋白沒有二硫鍵某些包涵體 的增溶，有時還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。4二、復性：由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學活性，加上劇烈的處理條件，使蛋白的高級結構破壞，因 此重組

9、蛋白的復性特別必要。通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復到 正常的折疊結構，同時去除還原劑使二硫鍵正常 形成。一般在尿素濃度4M左右時復性過程開始， 到2M左右時結束。對于鹽酸服而言，可以從4M 開始，到1.5M時復性過程已經(jīng)結束。包涵體蛋白復性方法稀釋復性：直接加入水或緩沖液，放置過 夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快， 不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、 分段稀 釋和連續(xù)稀釋三種方式。透析復性：好處是不增加體積，通過逐漸 降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱 易形成無活性蛋白質(zhì)聚體，且不適合大規(guī)模操 作，無法應用到生產(chǎn)規(guī)模。超濾復性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模

10、較 大，易于對透析速度進行控制，缺點是不適合樣 品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中 不可逆的變性。柱上復性：是最近研究較多并成功的在生 產(chǎn)中應用的一種復性方法，包涵體蛋白變性后，在色譜柱上復性，大致可分成疏水柱復性及凝膠 柱復性兩類。其中的凝膠柱復性均是用 Sephacry1S-100或 Superdex75 等分子篩填料，柱 較長（40cm-100cm不等）。相比稀釋和透析兩種 方法，色譜柱復性回收率高（高達90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數(shù)小（一般五倍左右） 5高蛋白質(zhì)濃度下的復性：通常有兩種方 法，一是緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入 到復性緩沖液中，使得蛋白質(zhì)在加入過程

11、中或加 入階段之間有足夠的時間進行折疊復性；二是采用溫度跳躍式復性，即讓蛋白質(zhì)先在低溫下折疊 復性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成，當形成聚集體的 中間體已經(jīng)減少時，迅速提高溫度以促進蛋白質(zhì) 折疊復性。止匕外，吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都 可用蛋白質(zhì)的復性。包涵體蛋白復性效率復性是一個非常復雜的過程，除與蛋白質(zhì)復性 的過程控制相關外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身 的性質(zhì)有關，有些蛋白非常容易復性，如牛胰 RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有 發(fā)現(xiàn)能夠對其進行復性的方法如IL-11,很多蛋白的復性效率只有百分之零點幾，如在純化IL-2時以十二烷基硫酸鈉

12、溶液中加入銅離子(SDmol/l CuCl2)的方法，25-37 C下反應3小時，再 EDTA至1m mol/l終止反應，復性后的二聚體低 于1%。6一般說來，蛋白質(zhì)的復性效率在20%左右。影響復性效率的因素：蛋白質(zhì)的復性濃度：正確折疊的蛋白質(zhì) 的得率低通常是由于多肽鏈之間的聚集作用，蛋 白質(zhì)的濃度是使蛋白質(zhì)聚集的主要因素，因而， 一般濃度控制在 ml;如果變性蛋白加入復性液 中過快，容易形成絮狀沉淀，可能是蛋白重新凝 聚的緣故。所以我們采用再水浴和磁力攪拌下， 逐滴加入變性蛋白，使變性蛋白在復性液中始終 處于低濃度狀態(tài)。pH和溫度：復性緩沖液的 pH值必須在 以上，這樣可以防止自由硫醇的質(zhì)子

13、化作用影響 正確配對的二硫鍵的形成，過高或過低會降低復 性效率，最適宜的復性pH值一般是。12此外，影響復性效率的因素還有，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢、離子強度、 共溶劑和其他添加劑的存在與否等。提高包涵體蛋白的復性產(chǎn)率氧化-還原轉換系統(tǒng)對于含有二硫鍵的蛋白，復性過程應能夠促使 二硫鍵形成。常用的方法有：空氣氧化法、使用 氧化交換系統(tǒng)、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化 法及DTT再氧化法.最常用的氧化交換系統(tǒng)是GSH/GSSG而 cysteine/cystine 、 cysteamine/cystamine 、 DTT/GSSG DTE/GSS常也都有應用。氧化交換 系統(tǒng)通過促使不正

14、確形成的二硫鍵的快速交換 反應提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率。通常使用 1-3m mol/l還原型疏基試劑，還原型和氧化型疏 基試劑的比例通常為10: 1 5: 1。7添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白質(zhì)的折疊， 但可能通過破壞錯誤折疊中間體的穩(wěn)定性，或增 加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復 性產(chǎn)率。如鹽酸月瓜、胭、烷基胭、以及碳酸酰胺 類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑。蛋白質(zhì)的輔因子、配基或底物亦可起到很好的促折疊作用，如蛋白質(zhì)的輔因子2伊或C/可以穩(wěn)定蛋 白質(zhì)的折疊中間體，從而防止了蛋白質(zhì)的聚集， 加入濃度大于mol/lTris緩沖液可提高包涵體蛋 白質(zhì)的折疊效率。濃度

15、為-0.6M L-Arg有助于增加 復性中間產(chǎn)物的溶解度。成功的應用于很多蛋白 如t-PA的復性中，可以抑制二聚體的形成。NDSBs是近年來出現(xiàn)的可促進蛋白復性的新家 族，NDSBs由一個親水的硫代甜菜堿及一個短的 疏水集團組成，故不屬于去垢劑，不會形成微束， 易于透析去除，目前，常用的有NDSB-195,NDSB-201, NDSB-25& 8PEG-NaSO 兩相法用PEG?口 NaSQ作為成相劑，然后加入鹽酸服， 再把變性的還原的蛋白質(zhì)溶液加入其中進行復 性，但這種方法需復性的變性蛋白質(zhì)的濃度必須 低。9分子伴侶和折疊酶等這類蛋白質(zhì)主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構 酶、肽酰-輔氨酰順反異構酶

16、、分子伴侶、FK506 結合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侶和折疊酶等 不僅可在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程 的平衡，而且可在體外促進蛋白質(zhì)的折疊復性。132.2.2.5 其它提高復性率的策略還有許多，如：非離子型去 垢劑，尤其是離子型或兩性離子去垢劑或表面活 性齊CHAPs Triton X-100、磷脂、laury Imaltosid、 Sarkosyl等對蛋白質(zhì)復性有促進作用；待折疊復 性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助其復性；多聚離子化合物如肝素不僅可以促進蛋白質(zhì)的作用，而且具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的作用。10 復性效果的檢測：根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免 疫、物理性質(zhì)等方面

17、對蛋白質(zhì)的復性效率進行檢 測。凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯 酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白 質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵 的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光 光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下 的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用 于復性研究中的過程檢測。色譜方法：如 IEX RP-HPLC CE 等,由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，生物學活性及比活測定：一般用細胞方 法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白 的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的 結果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。黏度和濁度測定：復性后的

18、蛋白溶解度 增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露， 一般水溶 性很差，大多形成可見的沉淀析出。免疫學方法：如 ELISA WESTERN等， 特別是對結構決定簇的抗體檢驗， 比較真實的反 映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。11在正常的生理條件下，組成蛋白質(zhì)的多肽鏈都 能以獨特的方式進行折疊，形成自己特有的空間 結構，以執(zhí)行某一些生命活動。當外界環(huán)境改變 時，可能造成基因突變和蛋白質(zhì)序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機體 有害的反應，引起構象病的發(fā)生和無生物活性、 不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復性 過程中發(fā)生聚集的機制尚不清楚， 許多已建立的 高效復性方法是在反復實驗和優(yōu)化的基礎上建

19、 立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個例中 發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律：如聚集的發(fā)生是由鏈間的疏水相互作用介導、聚集具有相對特異性、折疊中間 體可能具有不同的作用等等，并利用這些知識建 立了一些重組蛋白質(zhì)高效復興性的方法。相信隨著結構生物學、生物信息學、蛋白質(zhì)工程學及相 關新技術和新設備的發(fā)展和完善，在不久的將 來，預測和設計最佳復性方案將成為可能。參考文獻1包涵體蛋白質(zhì)的復性研究進展寧云山李妍生物技術通訊2重組包涵體蛋白質(zhì)的折疊復性馮小黎生物化學與生物物理進展2001;28(4)3 Fischer B, Sumner I. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in as inclusion bodies. Biotech Bioeng,1993,41(1)4王克夷哇命的化學,1999,19(5)5 Werner M H, Clore G M, Refolding proteins by gel filtration chromatography. FEBS Lett, 1994,3