齊魯醫(yī)學(xué)堿性磷酸酶Km值的測(cè)定

1、堿性磷酸酶Km值的測(cè)定 2021/9/301【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.了解酶的Km值測(cè)定原理和方法2掌握堿性磷酸酶（AKP）活性測(cè)定的原理和方法 2021/9/302【實(shí)驗(yàn)原理】在溫度，PH及酶濃度恒定的條件下，酶促反應(yīng)的初速度隨底物濃度（S）增大而增加，但當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃蟮揭欢O限時(shí)，則反應(yīng)速度趨于恒定，此最大反應(yīng)速度Vmax，反應(yīng)速度與底物濃度之間的關(guān)系可用米氏方程來(lái)表示，即：2021/9/303 VmaxS V= Km + S 其中Km為米氏常數(shù)， Vmax為最大反應(yīng)速度， 當(dāng)V=Vmax/2時(shí)，則Km=s。 Km是酶的特征常數(shù)，測(cè)定Km是研究酶的一種方法 2021/9/304將米氏方程變形為雙倒數(shù)

2、方程，以l/ v1s作圖，將各點(diǎn)連線，在橫軸截距為-km，據(jù)此可算出Km值。1/V=Km/ VmaxS + 1/ Vmax 2021/9/305本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其底物，生成酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4一氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌的衍生物，根據(jù)紅色的深淺可測(cè)出酶活力高低。其反應(yīng)式如下： 磷酸苯二鈉+H2O AKP OH- 苯酚 苯酚+4-氨基安替比林K3Fe(CN)6 醌衍生物 （紅色）2021/9/306管 號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8底物液(0.04M)碳酸緩液(pH=10)蒸餾水0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80

3、0.00 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00混勻后37水浴，預(yù)溫5分鐘左右 【實(shí)驗(yàn)操作】2021/9/307酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1加入酶液后立即混勻（保持37水?。磻?yīng)開(kāi)始。從加入酶液起計(jì)時(shí)至下一步 加入堿性溶液停止反應(yīng)，各管反應(yīng)時(shí)間應(yīng)準(zhǔn)確一致，為15分鐘。2021/9/308堿性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.04-氨基安 替比林鐵氰化鉀 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1

4、.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混勻，室溫放置10分鐘左右, 以8號(hào)管為空白，于5l0nm比色，記錄各管的光密度2021/9/309結(jié)果記錄 1 2 3 4 5 6 7 8 OD底物濃度 mmol/L 1 3 5 6 8 12 16 0 1/S 1/OD1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 - 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1、原始數(shù)據(jù)2021/9/30102、作圖以 s為橫軸，OD510為縱橫作圖，觀察曲線形狀；查Km 值 以1s為橫軸，1OD510為縱軸作圖，觀察曲線形狀；查Km 值比較兩個(gè)值的差異.2021/9/3011S1/2VMAXOD510VMAXKm底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系曲線雙倒數(shù)曲線 1/s1/OD510-1/Km1/Vma