實(shí)驗(yàn)一-質(zhì)粒提取2011課件

1、模塊一 重組質(zhì)粒構(gòu)建和重組子的篩選與鑒定模塊二 植物遺傳轉(zhuǎn)化模塊三 轉(zhuǎn)化煙草的鑒定 前 言分子生物學(xué)與基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)模塊一 重組質(zhì)粒構(gòu)建和重組子的篩選與鑒定實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取和電泳檢測 實(shí)驗(yàn)二 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：酶切、目的片段回收、連接實(shí)驗(yàn)三 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)四 重組質(zhì)粒的鑒定 1952， J. Lederberg reviews the literature on cell heredity and suggests the term plasmid for all extrachromosomal hereditary determinants.質(zhì)粒是一種

2、小的雙鏈環(huán)狀DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。 背 景 知 識(shí)1. 質(zhì)粒與載體用于基因克隆的載體必須具備的條件：1）能夠在寄主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；2）具有可檢測的選擇性標(biāo)記；3）具有多克隆位點(diǎn)；4）具有較高的外源DNA的載裝能力;5) 具有針對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性。 載體種類：有來自大腸桿菌的質(zhì)粒、噬菌體、 M13噬 菌體、噬菌粒外，還有酵母、細(xì)菌人工染色 體載體以及動(dòng)、植物病毒載體。是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300 kb之間，15kb的小

3、質(zhì)粒比較容易分離純化，15kb的大質(zhì)粒則不易提取。能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子（autonomous replicon）。Characteristics of plasmids 質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。Relaxed manner pMB1/colE1復(fù)制子pGEM-7Zf(-) Vector circle map and sequence reference pointsT7 RNA polymerase transcription initiation site 1SP6 RNA polymerase transcription initiation site 123T7 RNA

4、polymerase promoter (17 to +3) 29823SP6 RNA polymerase promoter (17 to +3) 121140lacZ start codon 162lac operator 182198-lactamase (Ampr) coding region 13192179phage f1 region 23632818binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 29392955binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 158174常用

5、質(zhì)粒背 景 知 識(shí)3. 電泳 瓊脂糖凝膠電泳Chemical Structure of Agarose 瓊脂糖是D-和L-半乳糖殘基通過（1-3）（1-4）交替構(gòu)成的線狀聚合物。Pouring a Horizontal Agarose Gel水平板凝膠電泳垂直板凝膠電泳DNA分子的大小1.樣品的物理性狀DNA構(gòu)象超螺旋環(huán)狀線狀DNA 切口環(huán)狀質(zhì)粒分子，在一定條件下，泳動(dòng)率的大小順序?yàn)椋?超螺旋DNA線狀DNA 開環(huán)DNA遷移率與堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)成反比。分子越大，遷移得越慢。2.凝膠濃度3.電場強(qiáng)度 低電壓時(shí)，遷移率與電壓成正比。當(dāng)電壓增大時(shí)瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于2kb

6、DNA片段的良好分辨率，電壓一般不超過 5V/cm。4. 緩沖液離子強(qiáng)度TAE 比 TBE TPE 快10%三種的分辨率相近溴化乙錠(ethidium bromide EtBr)：0.5ug/ml 熒光染料，含有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。 凝膠上DNA的染色是一種特有的能夠激發(fā)熒光的非對(duì)稱花青染料。其靈敏度更高當(dāng)被波長為300nm的透射光照射時(shí)，可以發(fā)出量黃色熒光1：10,000稀釋使用，用電泳緩沖液當(dāng)天配置，室溫存放。SYBR gold fluorescence dye：實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取和電泳檢測 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過本實(shí)

7、驗(yàn)掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理和方法。2學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA的鑒定。 堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的質(zhì)粒DNA提取方法，該法用于從細(xì)菌培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA，比較方便、省時(shí)，提取的DNA可用于DNA的酶切、PCR甚至測序。基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA之間在拓?fù)鋵W(xué)上的差異導(dǎo)致DNA變性與復(fù)性的差異而使其分離。1.堿裂解法提取質(zhì)粒DNA 二、實(shí)驗(yàn)原理 2瓊脂糖凝膠電泳 在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于瓊脂糖分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。

8、如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)、和線性DNA分子(lDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?cccDNAlDNAocDNA三、實(shí)驗(yàn)儀器及耗材，材料和試劑儀器及耗材：臺(tái)式高速離心機(jī)、滅菌鍋、恒溫?fù)u床、恒溫水浴、電泳儀、水平電泳槽、加樣器（pipettor）、小離心管（eppendorf tube）、吸頭（tip）、三角瓶、牙簽、制膠板等，凝膠成像掃描儀。材料：分別含有pBI121、pBin19質(zhì)粒的大腸桿菌。試劑 溶液I 葡萄糖 50 mmol/L TrisHCl (pH 8.0) 25 mmol/

9、L EDTA(pH 8.0) 10 mmol/L Tris-HCl：保持溶液適當(dāng)?shù)?pH EDTA（pH 8.0 ）：Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，抑制DNase的活性。 葡萄糖： 使大腸桿菌在溶液中保持懸浮溶液II NaOH 0.2 mol/L SDS 1% 裂解細(xì)胞，使DNA變性溶液III 5 mol/L乙酸鉀 60 ml 冰乙酸 11.5 ml 水 28.5 ml 中和NaOH，質(zhì)粒復(fù)性 LB培養(yǎng)基 NaCl 10g/L 酵母提取液 5g/L 胰蛋白胨 10g/L pH 7.0卡那霉素（Kan）: 貯液濃度為100mg/ml，工作濃度50-100g/ml，-20 保存。氨芐青

10、霉素(Amp) : 貯液濃度為100mg/ml，工作濃度50-100g/ml，-20 保存。70% 乙醇無水乙醇TE buffer (pH 8.0) TrisHCl (pH 8.0) 10 mmol/L (三羥甲基氨基甲烷) EDTA(pH 8.0) 1 mmol/L (乙二胺四乙酸)RNaseA: 貯液濃度為10mg/ml, 工作濃度10g/mlTBE:工作液( 0.5X) : 45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0) 貯存液 5X: 每升含 54 g Tris， 27.8 g硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)加樣緩沖液（lo

11、ading buffer 6x）： 0.25%溴酚蘭，40%蔗糖瓊脂糖染料：SYBR GoldDNA Marker（分子量標(biāo)準(zhǔn)）實(shí)驗(yàn)步驟三個(gè)基本步驟，即細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增；細(xì)菌菌體的裂解；質(zhì)粒DNA的提取和純化。 1挑一個(gè)單菌落接種于3 ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37劇烈振蕩過夜（8-16h）；2收集1.5 ml過夜培養(yǎng)物于2 ml小離心管中，10000 rpm離心30秒收集菌體，盡可能除盡培養(yǎng)基；3. 重復(fù)步驟2一次；4向細(xì)胞沉淀中加入100l溶液I，劇烈振蕩（Vortex），使菌體充分懸??；實(shí)驗(yàn)步驟5加入200l溶液II，立即溫和顛倒離心管4次（避免劇烈振蕩）；6加入1

12、50l預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒離心管4次，將離心管置冰浴中不少于5 min；7于室溫12000rpm離心10 min；8轉(zhuǎn)移上清，加入0.7倍體積的異丙醇顛倒混勻，立即在室溫下12000 rpm離心12 min； 9棄上清液，用500l 70%乙醇洗滌一次，在空氣中使質(zhì)粒風(fēng)干；10加入30l TE或重蒸水(含RNase50ug/ml) 溶解DNA。置于37 10分鐘。（二）DNA瓊脂糖電泳檢測1、 配置0.8%瓊脂糖凝膠：稱取適量的瓊脂糖粉末，放在一錐形瓶中，加入適量的0.5XTBE電泳緩沖液。置于微波爐加熱溶化。2、取有機(jī)玻璃制膠板槽，用透明膠帶沿膠兩端風(fēng)嚴(yán)。3、水平放置膠槽，在一端插好梳

13、子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。4、待膠凝固后，小心拔起梳子，撕下膠帶，使加樣孔端置陰極端放進(jìn)電泳槽內(nèi)5、在槽內(nèi)加入0.5TBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。6、把樣品按下量在封口膜上小心混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔。1l加樣緩沖液（10）+3l待測DNA樣品+1l SYBR Gold+5lH2O。7、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出，電壓最高不超過5v/cm，開始電泳。8、觀察溴酚蘭（藍(lán)色）的移動(dòng)。當(dāng)其移動(dòng)至膠板2/3處，可停止電泳。9、把凝膠放入凝膠成像掃描儀內(nèi)，關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈（300 nm)進(jìn)行觀察。5000300020001000750500250100五、注意事項(xiàng)1離心機(jī)使用前，注意離心管必須配平。離心機(jī)運(yùn)行過程中出現(xiàn)異常，馬上急停。2加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時(shí)清除