單子葉植物CRISPR載體的構(gòu)建

1、TOC o 1-5 h z摘要1 HYPERLINK l bookmark4 引言1 HYPERLINK l bookmark8 .材料與方法4實驗材料4 HYPERLINK l bookmark10 菌株4體質(zhì)粒載4酶和試劑4酶4 HYPERLINK l bookmark20 抗生素5生化試劑5儀器設(shè)備5實驗方法5酶切5DNA片段補平6大片段去磷酸化乙醇沉淀純化DNA7膠回收7連接KODplus高保真酶PCR反應(yīng)檢測ijPCR反應(yīng)8Gateway技術(shù) HYPERLINK l bookmark52 1.3.9.1BP反應(yīng)7大腸桿菌轉(zhuǎn)化 HYPERLINK l bookmark80 質(zhì)粒提取9

2、HYPERLINK l bookmark110 2結(jié).果與分析12 HYPERLINK l bookmark112 pWBVec8+Ga-b載體的酶切12載體去磷酸化12載體補平12 HYPERLINK l bookmark116 Cas9質(zhì)粒的酶切13含有Cas9元件片段的補平13Cas9元件片段與載體的連接13 HYPERLINK l bookmark118 pWBVec8+Ga-b-CRISPR質(zhì)粒檢測13入門載體的構(gòu)建14 HYPERLINK l bookmark126 3.討論15參考文獻17致謝18 .討論本實驗對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行了定向改造一方面提高了轉(zhuǎn)化效率，另一方

3、面為以后對基因組進行人工改造提供簡單便捷的途徑。在實驗過程中我們不僅采用傳統(tǒng)的酶切、連接構(gòu)建載體，也提出利用Gateway技術(shù)進行構(gòu)建載體。Gateway技術(shù)是基于噬菌體的位點特異重組反應(yīng)，在目的片段添加重組位點，將PCR產(chǎn)物與含重組位點的供體載體混合進行BP反應(yīng)獲得入門載體(entry&0廢)，入門載體可以和不同用途的目標載體進行LR反應(yīng)獲得相應(yīng)的表達載體，無需相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶和連接酶。如果已經(jīng)成功的構(gòu)建一個入門載體，就可以反復的使用它，將特異的目標基因重組到定向改造過的表達載體上。當目的基因在表達載體間簡捷快速穿行時，保證了重組DNA片段正確的閱讀框和方向，因而不影響不同的表達克隆的測序結(jié)

4、果。這在使用每一種新的表達系統(tǒng)時，更多節(jié)省了時間。實驗驗中對比得知，傳統(tǒng)的酶切-連接技術(shù)要求嚴格，容易出錯，酶切位點不易找到，成功率不高，而Gateway技術(shù)這種方法不僅簡單而且成本較低，成功率高，適合實驗室普遍推廣應(yīng)用。本實驗將表達sgRNA和Cas9元件整合到同一載體中，以提高轉(zhuǎn)化效率。同時也利用改造后的定點突變技術(shù)對含有作題之啟換動子和sgRNA的入門載體進行改造，引入位點特異的20bp的序列，方便sgRNA元件序列的替換。定點突變技術(shù)采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等方法向基因組或是質(zhì)粒中引入具有表征方向的變化，包括堿基的添加、刪除、點突變等，定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋

5、白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段，其中，體外定點突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復雜關(guān)系的有力工具，也是實驗室中改造/優(yōu)化基因常用的手段5。對于本實驗研究的CRISPR/Cas9系統(tǒng)而言，再某些程度上優(yōu)于其他基因組編輯技術(shù)，但是也存在自身的不足，例如，在不同的生物中也表現(xiàn)出不同程度的脫靶效應(yīng)是目前研究領(lǐng)域需要解決的一大難題。據(jù)相關(guān)實驗研究表明：Spacer序列的堿基組成、長度、錯配位點的位置、數(shù)目和分布特點以及Cas9核酸酶和sgRNA的濃度等數(shù)個因素均有可能影響CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性6-9?，F(xiàn)階段主要通過盡可能的選擇特異性較高的Spacer序列的位置、對Cas

6、9基因進行密碼子優(yōu)化以及選擇合適的sgRNA（包括計算機建模和控制sgRNA的表達量）來降低脫靶效應(yīng)。最近，CRISPR-Cas9介導的基因組編輯技術(shù)發(fā)展極為迅速，已經(jīng)在動物建模、作物育種、基因治療、藥物開發(fā)和工業(yè)生物工程等不同的領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用口5目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功的在擬南芥11、煙草12、水稻13、小麥14、玉米15、等生物中實現(xiàn)了定點基因組編輯。針對世界上的耕地面積和可利用資源的存在狀況，培養(yǎng)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物就顯得至關(guān)重要。因此，采用最新的生物技術(shù)來進行修飾植物內(nèi)源基因以此來提高作物的產(chǎn)量并改良作物的品質(zhì)創(chuàng)造新的途徑16。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中也存在很多有待解決的問題：1、怎樣才能攻破PAM序列的限制2、如何設(shè)立對Cas9脫靶效應(yīng)的全面評價體系3、如何構(gòu)造在不同的物種中通用的Cas9與sgRNA導入與表達系統(tǒng)4、如何更高效的激活同源重組修復等10。然而基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的快速發(fā)展以及隨著相關(guān)基礎(chǔ)科學研究的深入，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將在基因組水平的基因的改造、表觀遺傳的調(diào)控以及在轉(zhuǎn)錄調(diào)控等不同的層次上得到更為寬廣的發(fā)展與應(yīng)用。本實驗就為不同物種構(gòu)建不同轉(zhuǎn)基因表達載體從而發(fā)生定點突變提供高效，經(jīng)濟，簡單的提供可能。謝科，饒力群.基因組編輯技術(shù)在植物中的研究進展與應(yīng)用前景