分子實(shí)驗(yàn) 生物工程

1、 實(shí)驗(yàn)一 植物基因組DNA的提取及其定性、定量分析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)利用CTAB法從植物組織中提取DNA并通過瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法對(duì)DNA進(jìn)行定性定量分析。【實(shí)驗(yàn)原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)是一種陽離子型去污劑，可溶解細(xì)胞膜，在高離子強(qiáng)度下(大于0.7 M NaCl)，與蛋白和中性多糖形成復(fù)合物沉淀出來。利用液氮對(duì)植物組織進(jìn)行研磨，從而破碎細(xì)胞。然后加入CTAB緩沖液將DNA溶解出來，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后經(jīng)乙醇沉淀得到DNA。瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化DNA片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)(瓊脂糖凝膠)的樣品孔中，并

2、置于靜電場(chǎng)上。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子遷移速率快，遷移距離遠(yuǎn)，由此得到分離。凝膠電泳也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子，超螺旋質(zhì)粒DNA(cccDNA)泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA(L DNA)，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA(oc

3、DNA)。核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260 nm波長(zhǎng)處有特異的紫外吸收峰，其吸收強(qiáng)度與核酸的濃度成正比，這個(gè)物理特性為測(cè)定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。1 OD260相當(dāng)于dsDNA 50 g/mL，ssDNA 33 g/mL和ssRNA 40 g/mL?？梢源藖碛?jì)算核酸樣品的濃度。紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測(cè)定260 nm和280 nm的紫外線吸收值的比值(A260/A280)估計(jì)核酸的純度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染?！緝x器、材料與試劑】 一、儀器及耗材離心機(jī)、恒溫水浴器、臺(tái)式離心

4、機(jī)、電子天平、水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、高壓滅菌鍋、紫外線透射儀、微波爐、紫外分光光度儀、微量移液器(10、100、1000 L量程各一支)、100 mL或250 mL錐形瓶、量筒、液氮、研磨棒、點(diǎn)樣板或parafilm、吸頭、1.5 mL EP管、PE手套和乳膠手套。二、藥品三羥甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、-巰基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化鈉(NaCl)、鹽酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚藍(lán)、蔗糖、瓊脂糖、核酸染料。三、試劑1. 2CTAB buffer【1】70%乙醇【2】RNaseA (天根)【3】0.5TBE緩沖液(工作濃度)

5、【4】6loading buffer【5】6. 核酸染料(賽百盛)7. DNA marker DL 2000(Takara)8. 酚/氯仿 (1:1, V/V) 【6】【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 取約100 mg新鮮的擬南芥嫩葉放入1.5 mL EP管，在液氮冷凍條件下研磨成粉末狀。2. 加入0.6 mL 2CTAB提取液（用前加入0.2的巰基乙醇），混勻，65 水浴30 min，每10 min顛倒混勻一次。3. 取出離心管，冷卻后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混勻。4. 11,500 rpm室溫離心8 min(若沒離好可重復(fù)一次)。5. 將上清液(約400 L)轉(zhuǎn)移到另一新的1.5 mL離心管中。6

6、. 加入與上清等體積的氯仿，混勻，11,500 rpm 離心8 min，取上清(約350 L)。7. 加入600 L無水乙醇，上下顛倒混勻，-80放置30 min。8. 4，15,800 rpm離心20 min，棄上清。9. 1 mL 70乙醇(預(yù)冷)洗滌沉淀2次，上下顛倒幾次，不能vortex，7,000 g離心3 min，棄上清，風(fēng)干。10. 加入30 L無菌水(含20 g/mL RNase A)，37 溶解DNA 30 min。11. 取5 L DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：(1) 制備瓊脂糖凝膠稱取0.3 g 瓊脂糖，放入三角瓶中，加入30 mL 0.5 TBE緩沖液，置微波爐中加

7、熱至完全熔化，取出搖勻，則為1瓊脂糖凝膠液。(2) 膠板的制備 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏或膠帶將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴(yán)，不能留縫隙），形成一個(gè)模具。 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并在固定位置放好樣品梳子。 待瓊脂糖凝膠液冷卻到60 左右時(shí)，加入核酸染料1.5 L，搖勻，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。 室溫下靜置直至凝膠完全凝固（室溫下30-45 min），垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。 加入0.5 TBE電泳緩沖液至電泳槽中，使緩沖液沒過膠面約1 mm。(3) 加樣在點(diǎn)樣板或parafilm上混合

8、DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1。用10 L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，將DNA marker分別加至樣品孔的左側(cè)和右側(cè)孔內(nèi)。每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。 (4) 電泳 接通電泳槽與電泳儀的電源，DNA片段從負(fù)極（黑色插頭）向正極（紅色插頭）移動(dòng)）。DNA的遷移速度與電壓成正比，但電壓升高使瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低，因此，最高電壓不超過5V/cm。 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。 紫外燈下觀察瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作），采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存

9、。12.紫外分光光度法測(cè)定DNA濃度及純度：(1) 用0.1TE對(duì)待測(cè)DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。(2) 開機(jī)，儀器會(huì)自動(dòng)對(duì)光路及分析軟件進(jìn)行檢測(cè)，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時(shí)，進(jìn)入核酸測(cè)定窗口。(3) 調(diào)零。先用0.1TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點(diǎn)擊“set ref”鍵，儀器自動(dòng)校正零點(diǎn)。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測(cè)樣品。(4) 吸70 L已稀釋的DNA樣品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用5-7 L的石英樣品杯。點(diǎn)擊“enter” 鍵，儀器即進(jìn)入分析狀態(tài)。窗口同時(shí)顯示260 nm和280 nm處的光密度（OD值）

10、及A260/A280 nm和A280/A260 nm的比率以及DNA樣品的濃度等。(5) 打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用超純水清潔石英樣品杯，風(fēng)干后，再加入下一個(gè)待測(cè)樣品。(6) DNA純度：以A260/ A280比值來反映。當(dāng)A260 /A280比值2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去除RNA。注意事項(xiàng)：1、磨樣時(shí)要反復(fù)插入液氮中冷凍，但要避免液氮進(jìn)入管中；2、取酚氯仿混合液時(shí)要吸取下層；3、加入酚氯仿和氯仿時(shí)要充分混勻；4、氯仿抽提后取上清時(shí)不要吸到蛋白層；5、晾干沉淀時(shí)，要盡可能的吸除酒精。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】樣品260280260/28010.0310.0241.2

11、91 20.0240.0211.142 30.0330.0201.650 40.0280.0231.217 50.0450.0311.452 測(cè)定OD值：M 1 2 3 4 5M 1 2 3 4 5本組共提取5個(gè)擬南芥樣品，1.2和4未出現(xiàn)條帶，3和5提出DNA（如圖），但顏色不夠亮。模板沒條帶說明提取的DNA量很少或沒有提取出來，而且OD值顯示1.2和4的A260/A280比值較小，蛋白污染啊嚴(yán)重，3和5的OD值較小，蛋白污染較小?？赡艽嬖诘脑蚴牵?1.擬南芥未充分研磨，加入液體時(shí)發(fā)現(xiàn)有大塊存在。 2.研磨速度不夠快，而且研磨途中沒有及時(shí)液氮速凍。 3.提取核酸時(shí)，沒有進(jìn)行2次抽提蛋白。

12、4.離心后，吸取上清可能吸取到中間層。 實(shí)驗(yàn)二 PCR擴(kuò)增目的片段【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過程，是將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。典型的PCR 反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA 模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱DNA聚合酶。PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個(gè)在模板DNA、一對(duì)已知序列的寡核苷酸引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚

13、合酶依賴的酶促合成反應(yīng)。整個(gè)擴(kuò)增過程分三步： 變性，加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段； 退火，快速降低溫度至50-60 后，模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，即退火階段； 延伸，溶液反應(yīng)溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4 種脫氧核苷三磷酸（dNTP)，按53方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA ，即引物的延伸階段。完成以上三步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)過25-30個(gè)循環(huán)后，DNA可擴(kuò)增106-109倍。PCR擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合?！緝x器

14、、材料與試劑】 一、儀器及耗材PCR熱循環(huán)儀、臺(tái)式離心機(jī)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器（0.1-2.5 L）、200 L PCR管、吸頭、離心管、手套、制冰機(jī)、微量移液器（10、100、1000 L量程各一支）、100 mL或250 mL錐形瓶、量筒、點(diǎn)樣板或parafilm、吸頭、PE手套和乳膠手套。二、試劑1. 10 緩沖液2. DNA 模板 1 ng/L（以實(shí)驗(yàn)一 提取的擬南芥基因組DNA為模板）3. dNTP Mix (Takara)4引物 P3： 5-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3P5： 5-ACT CTA GAT GAG T

15、AA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3引物溶液濃度：2 M 5. rTaq 酶 5 U/L6. 低熔點(diǎn)瓊脂糖7. 去離子水或TE（pH7.6）【7】【實(shí)驗(yàn)步驟】 1在200 L PCR 管內(nèi)配制20 L 反應(yīng)體系：反應(yīng)物 體積/LddH2O 11.3 10PCR 緩沖液 2.0dNTP 1.6（終濃度20200 M） 引物1 2.0（引物終濃度0.2 M）引物2 2.0（引物終濃度0.2 M）模板DNA 1.0rTag 酶 0.1 Total 20 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。2. 將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，6,000 rpm離心15 se

16、c使反應(yīng)成分集于管底。3. PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置： 94 預(yù)變性 3 min; 94 變性 30 sec; 64 退火 30 sec; 30 cycles 72 延伸 1 min; 72 延伸 10min; 16 pause反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，置4 保存?zhèn)溆谩?. 配制1的瓊脂糖凝膠。5. 取5 L PCR產(chǎn)物，加1 L的6 loading buffer(上樣緩沖液)，輕彈混勻后進(jìn)行電泳檢測(cè)。6. 如果PCR產(chǎn)物非常特異，可以直接用于與載體的重組連接。注意事項(xiàng)：1、加樣時(shí)要精確用移液器。2、檢查PCR儀是否熱蓋。 3、每種試劑彈化后要離心；做MIX時(shí)，最后加酶，分裝之前要混勻；分裝后需離心

17、混勻。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)652 bp。M 1 2 3 4750bp M 1 2 3 4750bp 如圖所示：本組2和3有條帶，1和4未出現(xiàn)條帶。條帶大小在750bp的mark下方，目的條帶是2bp，認(rèn)為PCR結(jié)果是目的條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：模板量太多或者太少均得不到很亮的條帶。DNA模板不純?？赡苁遣僮鞑划?dāng)，比如MIX沒有混勻，PCR產(chǎn)物沒有甩一下就直接點(diǎn)樣。加酶后，沒有彈勻。注意事項(xiàng)：1、加樣時(shí)要精確用移液器。2、檢查PCR儀是否熱蓋。 3、每種試劑彈化后要離心；做MIX時(shí)，最后加酶，分裝之前要混勻；分裝后需離心混勻。 實(shí)驗(yàn)三 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?通

18、過本實(shí)驗(yàn)掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。【實(shí)驗(yàn)原理】 體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中才能大量的進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細(xì)胞會(huì)使細(xì)胞易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉(zhuǎn)化。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。用理化方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，如電轉(zhuǎn)化法、CaCl2法。CaCl2法是目前實(shí)驗(yàn)室常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其原理是使細(xì)菌處于0C、CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細(xì)胞膜表面，經(jīng)42C 短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH5菌

19、株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理受體菌使其處于感受態(tài)，之后通過轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。【儀器、材料與試劑】 一、儀器及耗材臺(tái)式離心機(jī)、移液器、吸頭、恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、低溫離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫箱、-80冰箱、4/-20 冰箱、制冰機(jī)、50 mL 離心管、小指管、試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶等、玻璃涂棒、鑷子、牙簽、酒精燈、微量移液器（10、100、1000 L量程各一支）、吸頭、1.5 mL EP管、PE手套和乳膠手套。二、藥品胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉(NaCl) 、氯化鈣(CaCl2) 。三、試劑1. 1 mol / L CaCl2 溶液【8】2. 1 mol / L MgCl2

20、溶液【9】3. 75% 甘油【10】4. LB 液體培養(yǎng)基【11】【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 從大腸桿菌DH5 平板上挑取一個(gè)單菌落接于2 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 210 rpm 振蕩培養(yǎng)過夜。2. 次日，按1:100(V/V)，即取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有100 mL LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37 振蕩培養(yǎng)2-3 hr。（此時(shí)，OD 600 0.3-0.5，此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵）。3. 將菌液轉(zhuǎn)移到50 mL冰浴好的離心管中，冰上放置10 min。4. 4 ，3,500 rpm/min，離心10 min，回收細(xì)胞。5. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置，以便培養(yǎng)液流盡。6. 將菌體重懸于5mL 的M

21、IX, （務(wù)必放冰上）。MIX【12】為1/10體積的終濃度為20 mM CaCl2 和 80 mM MgCl2的混合溶液中。7. 4 ，3,500 rpm/min，離心10 min，回收細(xì)胞。8. 將菌體重懸于1mL的MIX（務(wù)必放冰上）。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。分裝為到1.5 mL的離心管中，每份100L。置于-80保存。MIX【13】為1/50體積冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液。 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 從大腸桿菌DH5a平板上挑取的單菌落在2mlLB液體培養(yǎng)基的試管里培養(yǎng)，次日OD值為0.311，在要求范圍之內(nèi)，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞生長(zhǎng)良好。注意事項(xiàng)：1：搖大體積菌液時(shí)，一定要嚴(yán)格控制OD

22、600在0.3到0.5之間。 2：所用到的所有的離心管都要冰浴。 3、MIX、MIX重懸都要在冰上操作。 4、離心時(shí)都用4低溫離心。實(shí)驗(yàn)四 目的片段和載體的連接【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?通過本實(shí)驗(yàn)掌握DNA重組連接方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA叫做重組子。DNA重組本質(zhì)是一個(gè)酶促反應(yīng)過程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段的5端磷酸和3端羥基之間相互作用，形成磷酸二酯鍵的過程。pMD19-T Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物(TA Cloning)的專用載體。它含有Amp抗性基因、半乳糖苷酶的啟動(dòng)子和編碼其N端氨基酸(肽鏈)的片斷基因

23、，在這段基因中插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)（DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案），其中有EcoR V識(shí)別位點(diǎn)，用EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3端添加“T”而成。這款載體含有的高效連接液Solution I可以在短時(shí)間內(nèi)（約30 min）完成連接反應(yīng)，連接反應(yīng)的溫度在37 時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度12-16，最多可以連接12-16hr（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定?！緝x器、材料與試劑】 一、儀器及耗材移液器、吸頭、恒溫水浴

24、鍋、溫度計(jì)、微量移液器(10、100、1000 L量程各一支)、吸頭、0.5 mL/1.5mL離心管或200 L PCR管、PE手套和乳膠手套、制冰機(jī)。二、藥品及試劑1. pMD-19 T 連接試劑盒（含pMD-19 T載體、連接試劑）2. PCR擴(kuò)增回收片段。【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 在滅菌的Eppendorf 管中，加入：pMD-19 T載體 0.5 L目的PCR片段 4.5 LSolution 5 L共10 L體系，混勻，16 連接30min。DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3-10倍。2. 蓋好蓋子，用手指輕彈EP管數(shù)次，并于臺(tái)式離心機(jī)離心2 sec以集中溶液。3. 將反應(yīng)管放入1

25、6 連接過夜（1216hr）。4. 取出約25 ng的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定連接結(jié)果，以未經(jīng)連接的質(zhì)粒DNA片段和PCR片段為對(duì)照進(jìn)行電泳檢測(cè).【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 經(jīng)過37攝氏度24h，處理組生長(zhǎng)了很多白色菌落，藍(lán)色菌落較少，且菌落直接較小，白菌落為DNA重組子或?yàn)榧訇栃?，需要進(jìn)一步鑒定。 實(shí)驗(yàn)五 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?通過本實(shí)驗(yàn)，掌握重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法和原理?！緦?shí)驗(yàn)原理】 轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。轉(zhuǎn)化緩沖液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羥基鈣磷酸復(fù)合物，此復(fù)合物粘附于感受態(tài)細(xì)胞表面。42 短時(shí)間熱處理（熱休克），可以促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合

26、物。將處理后的細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)液中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型(如Amp抗性) 得到表達(dá)。然后再涂布于含有氨芐青霉素的選擇性平板上，37 培養(yǎng)過夜形成單克隆。在這個(gè)過程中包含兩種篩選方法，一種是抗性篩選，一種是藍(lán)白斑篩選。載體中含有耐藥基因，可以使轉(zhuǎn)化成功的受體細(xì)胞具有抗藥性，能夠在含有相應(yīng)藥物的瓊脂平板上形成單克隆菌落。通過這種方法就可以篩選轉(zhuǎn)化成功的受體細(xì)胞。而能進(jìn)行藍(lán)白篩選是因?yàn)檩d體中有一段大腸桿菌-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子和編碼其N端氨基酸（肽鏈）的片斷基因。宿主具有編碼半乳糖苷酶的C端基因。當(dāng)二者產(chǎn)物組合在一起，就具有活性酶的產(chǎn)生，此現(xiàn)象稱為互補(bǔ)。在誘導(dǎo)物IPTG（乳

27、糖類似物，不會(huì)被-半乳糖苷酶摧化降解）的作用下，由互補(bǔ)形成的具有功能活性的-半乳糖苷酶，可分解培養(yǎng)物中的X-gal（它能將無色的化合物X-gal切割成半乳糖和藍(lán)色底物），使其呈藍(lán)色反應(yīng) 。如果外源基因插入位于LacZ基因內(nèi)部的多克隆酶切位點(diǎn)中，就會(huì)破壞肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)的-半乳糖苷酶相互補(bǔ)的活性肽鏈，導(dǎo)致不能編碼-半乳糖苷酶，菌落呈正常的白色。而沒有插入外源片斷的則是藍(lán)色的。因此，按照菌落的顏色就可以確定載體上是否插入了外源基因。【儀器、材料與試劑】一、儀器及耗材超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴器、EP管、培養(yǎng)皿、玻璃涂棒、鑷子、牙簽、酒精燈、-20冰箱、高

28、壓蒸汽滅菌鍋、pH計(jì)、電子天平冰及冰盒、制冰機(jī)。二、試劑胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉（NaCl)、氨芐青霉素、二甲基甲酰胺、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）、IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）、75%酒精【14】、大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞、連接產(chǎn)物?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1. 取實(shí)驗(yàn)三重組質(zhì)粒10 L加入100 L感受態(tài)細(xì)胞，混勻（輕彈，感受態(tài)很脆弱），冰浴30 min（靜置，勿動(dòng)，確保DNA吸附在感受態(tài)細(xì)胞表面）。2. 將管放到42 水浴鍋中，熱激90 sec（準(zhǔn)確，防止LB液體進(jìn)入細(xì)胞中）。3. 冰浴2 min（使得感受態(tài)細(xì)胞膜收縮，磷脂雙分子層的運(yùn)動(dòng)）。 4. 加500 L L

29、B 液體培養(yǎng)基（在超凈臺(tái)中進(jìn)行），輕輕混勻。5. 37 溫育45 min ，130 rpm慢搖（必須保證前20 min的轉(zhuǎn)速，因?yàn)榇竽c桿菌42 min左右繁殖一代，第一代的細(xì)胞較脆弱，防止細(xì)胞破碎）。6. 在預(yù)制的LB 瓊脂平板上，加40 L 20 mg/mL X-gal 【15】和16 L 50 mg/mL IPTG【16】 溶液。7. 用滅菌玻璃棒（酒精燈上燒后冷卻）均勻涂布。 8. 37 溫箱中放置30 min（使有毒物質(zhì)揮發(fā)）。9. 3,500 rpm，離心2 min。10. 棄約500 L上清，將剩余菌液輕輕吹打混勻涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，晾至液體被吸收。11. 倒置平皿37

30、 培養(yǎng)12-16hr，出現(xiàn)單菌落（培養(yǎng)皿上會(huì)長(zhǎng)出藍(lán)色和白色菌落，其中白色菌落為含有重組DNA 質(zhì)粒的菌落）。注意事項(xiàng)：連接結(jié)束約3min時(shí)取出感受態(tài)，插入冰中，盡量避免晃動(dòng)。連接產(chǎn)物打入感受態(tài)中后輕彈混勻。冰浴靜置時(shí)勿動(dòng)。熱激后要立即放入冰中冰浴。涂IPTG、X-Gal后的LB平板 正放入培養(yǎng)箱，涂菌后倒置。 實(shí)驗(yàn)六 菌落的PCR鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)菌落PCR的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】重組子經(jīng)過藍(lán)白斑篩選后（具有假陽性），接下來可通過菌落PCR方法對(duì)重組子進(jìn)一步進(jìn)行快速鑒定。用滅菌后的牙簽輕輕粘取白色菌落的部分菌體，在準(zhǔn)備好的雙蒸水中洗一下，充分混勻，取一定量加入PCR反應(yīng)體

31、系，在PCR反應(yīng)循環(huán)中，95 加熱可以使細(xì)菌破裂，釋放出重組質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增模板。采用外源基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，如果重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，則可以擴(kuò)增得到預(yù)期大小的目的片段?！緝x器、材料與試劑】 一、儀器及耗材PCR熱循環(huán)儀、臺(tái)式離心機(jī)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器（0.1-2.5 L）、200 L PCR管、吸頭、離心管、手套、制冰機(jī)、微量移液器（10、100、1000 L量程各一支）、100 mL或250 mL錐形瓶、量筒、點(diǎn)樣板或parafilm、吸頭、PE手套和乳膠手套。二、試劑1. 10 緩沖液2. DNA 模板 （以菌體熱解后暴露的DNA為模板）3. dNTP Mix4. 引物

32、 P3： 5-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3P5： 5-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3引物溶液濃度：2 M 5. rTaq 酶 5 U/L6. 去離子水或TE（pH7.6）【實(shí)驗(yàn)步驟】 用200 L的移液器頭挑取轉(zhuǎn)化平板上白色的單菌落于15 L無菌水中，從中取2 L菌液作為菌落PCR模板。1在200 L PCR 管內(nèi)配制20 L 反應(yīng)體系：反應(yīng)物 體積/LddH2O 10.3 10PCR 緩沖液 2.0dNTP 1.6 引物 2.0 引物2 2.0菌液 2.0rTag 酶 0.

33、1 Total 20 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。2. 將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，6,000 rpm離心15 sec使反應(yīng)成分集于管底。3. PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置： 94 預(yù)變性 3 min; 94 變性 30 sec; 64 退火 30 sec; 30 cycles 72 延伸 1 min; 72 延伸 3 min; 16 pause反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，置4 保存?zhèn)溆谩?. 配制1的瓊脂糖凝膠。5. 取5 L PCR產(chǎn)物，加1 L的6loading buffer，輕彈混勻后進(jìn)行電泳檢測(cè)?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】 本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)652 bp。注意事項(xiàng)：1、挑菌時(shí)，

34、盡量不要挑到培養(yǎng)基，吹打多次混勻。 2、避免劇烈操作。 3、其他注意事項(xiàng)同實(shí)驗(yàn)二。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】625bp750bp M 1 2 3 4 5 625bp750bp M 1 2 3 4 5本組共做5個(gè)菌落PCR，其中3和5出現(xiàn)結(jié)果，3的條帶較暗。1，2和4沒有出現(xiàn)條帶，第一個(gè)甬道未發(fā)現(xiàn)任何核酸存在。試驗(yàn)結(jié)果討論： PCR成功的條帶大小與M比，在750bp之下，且倆條條帶高度幾乎一致，可以認(rèn)為是目的條帶635bp，同時(shí)說明重組質(zhì)粒可能轉(zhuǎn)入成功。而2和4沒有出現(xiàn)條帶，說明挑取的菌落是假陽性的。第一甬道里沒有任何核酸存在，說明在做PCR，沒有加入模板。接下來將重新挑取出條帶菌落進(jìn)一步測(cè)定。條帶顏色較淺的

35、3，可能由于挑取培養(yǎng)基量大，或者是菌落沒有吹打開。 實(shí)驗(yàn)七 重組質(zhì)粒DNA的提取及酶切鑒定【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1 kb至200 kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)步驟：培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實(shí)際操

36、作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，在這樣的條件下，盡管共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，因?yàn)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)

37、狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為、型三大類。其中類酶在分子克隆和基因操作中最為有用，是常用的分子生物學(xué)工具酶。 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列長(zhǎng)度一般為4-8個(gè)呈回文序列的特異核苷酸對(duì)。一般情況下，識(shí)別序列越長(zhǎng)，在同一DNA分子中識(shí)別位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率就越小。限制性內(nèi)切酶主要用于基因組DNA的片段化、重組

38、DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的基因片段的分離與回收以及DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同，可有單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。根據(jù)酶切反應(yīng)的體積不同，可分為小量酶切反應(yīng)和大量的酶切反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以EcoR和Hind III對(duì)本實(shí)驗(yàn)中提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行小量酶切鑒定。在用特定的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)后，通常可采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切效果。【儀器、材料與試劑】 一、儀器及耗材恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋、EP管、水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、制冰機(jī)、瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備、微量移液器（10、100、1000 L量程各一支）1.5 mL EP管、PE手套和乳膠手套。二、試劑1. 質(zhì)粒提取試劑盒（天根） 2. Spe和Nco I限制性內(nèi)切核酸酶(Fermentas)3. 內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液4. 瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 將實(shí)驗(yàn)六第一步剩余的13 L菌液接于2 mL 含Amp ( 50 g/mL )的LB液體培養(yǎng)基中37 振蕩（225 rpm）培養(yǎng)過夜。2. 取1.5